電刺激干預(yù)腓腸肌拉傷后成肌調(diào)節(jié)因子MyoD與Myogenin蛋白表達(dá)的研究

劉敏

(廣州體育學(xué)院，廣東 廣州510000)

摘要：目的：采用低強度電刺激治療腓腸肌拉傷，觀察其對于肌肉損傷部位成肌調(diào)節(jié)因子MyoD與Myogenin蛋白表達(dá)的影響。方法：雄性SD大鼠32只，隨機分為對照組、模型組、D14組和D14-40Hz組。除對照組外其余各組建立腓腸肌拉傷動物模型。于造模后第5天D14-40Hz組開始予以電刺激，其余組繼續(xù)喂養(yǎng)。正常對照組在實驗開始當(dāng)天，模型組在造模當(dāng)天，D14組和D14-40Hz組在第14天進行在體力矩測試，測試結(jié)束后處死動物，分離腓腸肌采用免疫印跡法(Western blotting)測定MyoD與Myogenin蛋白表達(dá)。結(jié)果：對照組關(guān)節(jié)最大等長力矩值為0.236±0.045(Nm)，模型組肌肉拉傷后即刻關(guān)節(jié)最大等長力矩下降為0.176±0.034(Nm)，兩者比較存在顯著性差異(P<0.05)；第14天D14-40Hz組最大等長力矩值為0.247±0.038(Nm)，與D14組比較存在顯著性差異(P<0.05)。MyoD與Myogenin蛋白表達(dá)測定結(jié)果：肌肉拉傷后第14天MyoD蛋白表達(dá)D14組與對照組比較無差異(P>0.05)，但是MyoD蛋白表達(dá)D14-40Hz組比D14組增強明顯(P<0.05)；肌肉拉傷后第14天，D14-40Hz組Myogenin蛋白表達(dá)明顯強于D14組(P<0.05)。結(jié)論：腓腸肌急性拉傷后，早期采用低強度電刺激治療可以明顯提高關(guān)節(jié)力矩，并促進了MyoD與Myogenin的表達(dá)，對組織修復(fù)起到了積極地作用。

關(guān)鍵詞：腓腸肌拉傷;電刺激治療

中圖分類號：G804.2

收稿日期：2015-06-23

作者簡介：劉敏(1974-),女，貴州人，講師

研究方向：健美操訓(xùn)練與教學(xué)

Effect of Electrical Therapy on Protein Expression of MyoD

and Myogenin in Gastrocnemius Strain

LIU Jun

(Guangdong University of Foreign Studies, Guangzhou 510006,China)

Abstract：Objective：To observe the effect of electrical therapy on protein expression of MyoD and Myogenin in gastrocnemius strain. Methods：Thirty-two male Sprague-Dawley (SD) rats were utilized in this study(control group, animal model group, D14 group, and D14-40Hz group). All male SD rats except those in control group were created a partial gastrocnemius stretch injury. After injury, no interventions were given to animal model group and D14 group. At fifth day, the electrical protocol was given to D14-40Hz group. After experiment, changes in joint torque, protein expression of MyoD and Myogenin were tested. Results: The isometric ankle peak torque of control group was 0.236±0.045Nm. The isometric peak torque of animal model group dropped to 0.176±0.034Nm(P<0.05)post-injury. The isometric ankle peak torque of D14-40Hz group was 0.247±0.038., which is significant difference compared to the isometric peak torque of D14 group(P<0.05). No significant difference of the protein expression of MyoD existed between control group and D14 group(P>0.05). However, the protein expression of MyoD in D14-40Hz group was higher than D14 group (P<0.05). The protein expression of Myogenin (D14-40Hz) was higher than D14 group(P<0.05).Conclusions: The low intensity 40Hz electrical stimulation could increase the isometric peak toque. What's more, it was helpful to improve the expression of MyoD and Myogenin. Therefore, it showed the 40Hz electrical stimulation was useful for muscular rebuilding of gastrocnemius strain by improving gene regulatory of MyoD and Myogenin.

Key words：Gastrocnemius Strain, Electrical Therapy

現(xiàn)代競技運動中肌肉損傷是最常見的運動損傷之一[1-6],輕度的肌肉拉傷可影響運動員的訓(xùn)練、比賽等，嚴(yán)重的肌肉拉傷斷裂則可迫使運動員結(jié)束其運動生涯。因此，運動中肌肉拉傷臨床治療越來越受到關(guān)注。其中電刺激在肌肉損傷臨床治療中的應(yīng)用越來越受到關(guān)注，目前雖然無法明確地闡述電刺激對于肌肉拉傷康復(fù)治療的作用機制，但是臨床實踐中卻不斷證實了它的有效性[7-9]。本文擬采用低強度電刺激治療腓腸肌急性拉傷，觀察分析其對于肌肉損傷部位結(jié)構(gòu)重塑以及成肌調(diào)節(jié)因子MyoD與Myogenin蛋白表達(dá)的影響的影響，從而為臨床治療提供實驗支持和理論依據(jù)。

1實驗材料與方法

1.1實驗動物分組與動物模型構(gòu)建

雄性SD大鼠32只，體重340±20g。先按照動物體重分層，然后再隨機分為對照組、D0模型組、D14模型組和D14-40Hz組。模型組與D14-40Hz組建立腓腸肌拉傷動物模型。采用腹腔注射方法麻醉大鼠，然后大鼠取仰臥位予以固定，再選大鼠一側(cè)肢體，用生理刺激儀的針電刺激肌肉兩端使固定側(cè)肢體的腓腸肌發(fā)生強直收縮，與此同時發(fā)動機帶動大鼠固定板腓腸肌迅速做離心收縮，造成一側(cè)肢體腓腸肌拉傷。

1.2電刺激治療方案

D14-40Hz組于動物造模后第6天開始給予電刺激，實驗前清理大鼠皮膚，將表面電極貼放在腓腸肌遠(yuǎn)近兩端。電刺激方案為：頻率40Hz，脈沖寬度200us，間隔為5s開10s關(guān)，24h內(nèi)兩次，每次持續(xù)30min，相隔3h，刺激強度以能夠觀察到肉眼可見腓腸肌肌肉收縮為度。

1.3實驗指標(biāo)測試

1.3.1在體力矩的測定

對照組、模型組、D14組和D14-40Hz組分別于實驗當(dāng)天、第14天測試關(guān)節(jié)力矩，麻醉后將大鼠取仰臥位固定，腿部固定板與動態(tài)扭矩傳感器一端連接，另一端與發(fā)動機軸連接，實驗中通過運動控制器調(diào)整角度為900，使用針電刺激使腓腸肌發(fā)生強直收縮，大鼠足部發(fā)生跖曲，從而通過扭矩傳感器測量力矩大小。

1.3.2MyoD與Myogenin蛋白表達(dá)免疫印跡測定

實驗結(jié)束后分離腓腸肌組織，并離心提取總蛋白測定肌肉組織中的蛋白含量。常規(guī)上樣電泳，轉(zhuǎn)膜(冰上電泳,電泳2 h,電流80V)，將轉(zhuǎn)印好的PVDF 膜放入封閉液中于脫色搖床上搖動2h。然后漂洗, 再加入MyoD/Myogenin一抗抗體, 4℃下孵育過夜。第二天漂洗5次，然后予以二抗稀釋液與膜接觸，室溫下孵育2h。最后在暗室中顯影和定影。

1.4統(tǒng)計學(xué)分析

2實驗結(jié)果

2.1在體力矩測量結(jié)果

2.1.1大鼠肌肉拉傷后不同時刻最大等長力矩指標(biāo)的變化

對照組腓腸肌力矩值為0.236±0.045(Nm)，模型組在肌肉拉傷后即刻最大等長力矩下降為0.176±0.034(Nm)，兩者比較存在顯著性差異(P<0.05)；第14天基本恢復(fù)到正常水平，D14組腓腸肌力矩值為0.227±0.036(Nm)，與對照組比較差異不顯著性(P>0.05)。見表1：

表1　實驗各組最大等長力矩測量結(jié)果

注：與對照比較：*P<0.05；與模型組比較：△P<0.05

2.1.2大鼠肌肉拉傷后第14天各組最大等長力矩指標(biāo)的變化

第14天D14-40Hz組最大等長力矩值為0.247±0.038(Nm)，與D14比較存在顯著性差異(P<0.05)。見表2：

表2　實驗各組最大等長力矩測量結(jié)果

注：與D14組比較：*P<0.05；與對照組比較：△P>0.05

2.2免疫印跡測定MyoD與Myogenin蛋白表達(dá)

實驗第14天免疫印跡測定MyoD與Myogenin蛋白表達(dá)， D14組與對照組比較無差異(P>0.05)；與對照組比較，D14-40Hz組顯著增強(P<0.05)，見圖1；Myogenin蛋白表達(dá)，D14-40Hz組高于D14組(P<0.05)。見圖2：

3分析與討論

3.1電刺激對于損傷肌肉組織和修復(fù)力學(xué)指標(biāo)的影響

電刺激在增加肌肉力量和肌肉損傷的治療等方面被認(rèn)為是一種有效手段，目前雖然電刺激治療在組織修復(fù)中廣泛應(yīng)用，但是對于肌肉拉傷早期進行電刺激的具體時間依舊存在爭議。有學(xué)者認(rèn)為骨骼肌急性損傷后，早期物理電刺激治療應(yīng)該在急性炎癥反應(yīng)期后，因為這個時期受傷的組織表現(xiàn)為出血、腫脹和壞死，以及損傷組織周圍有大量炎細(xì)胞聚集和浸潤，一般在傷后48h～72h之間達(dá)到高峰，隨后才逐漸消退。雖然關(guān)于進行電刺激治療的具體時間存在爭議，不過每一次的電刺激都會引起肌肉節(jié)律性的收縮，研究證實電刺激療法能促進肌肉損傷后的修復(fù)，組織切片顯示電刺激治療組肌節(jié)清晰，新生的肌纖維更加成熟[10-11]。對于組織功能的評估方面，力矩是肌肉功能評價比較常用的指標(biāo)[12-14]，本實驗同樣選用力矩測試作為組織修復(fù)的力學(xué)觀測指標(biāo)。電刺激[15]可以控制肌肉的收縮時間和收縮強度, 通過肌肉的收縮顯著提高肌肉力量。因此，本實驗假設(shè)早期(傷后第5天)給予低強度電刺激干預(yù)腓腸肌拉傷的組織修復(fù)，一方面可以避免炎癥反應(yīng)的加劇，另外一方面也有助于損傷組織的修復(fù)和功能重塑。本實驗所采用的低強度40Hz電刺激是低頻電刺激，第14天D14-40Hz組最大等長力矩值為0.247±0.038(Nm)，與D14組比較存在顯著性差異(P<0.05)。這說明肌肉損傷早期低強度低頻率40Hz電刺激，能夠提高最大等長力矩，有利于損傷有利于損傷部位結(jié)構(gòu)和功能的重塑。因此，本實驗結(jié)果可以作為臨床治療的實驗依據(jù)。

圖1　第14天免疫印跡測定MyoD蛋白表達(dá)

圖2　第14天免疫印跡測定Myogenin蛋白表達(dá)

3.2電刺激對于損傷肌肉成肌調(diào)節(jié)因子MyoD和Myogenin的影響

骨骼肌對于機械刺激有很好的反應(yīng)能力，有研究表明損傷后輕微的張力刺激能夠使新生的肌原纖維排列有序，并順著刺激所產(chǎn)生的應(yīng)力線方向排列，這對于損傷肌肉組織的重塑是非常有利的。肌肉組織如果受到諸如牽拉的機械刺激，肌肉組織內(nèi)的衛(wèi)星細(xì)胞則出現(xiàn)增值[16]，而在肌肉組織修復(fù)過程中已經(jīng)證實了肌衛(wèi)星細(xì)胞的重要性[17-19]。而MyoD和Myogenin在特異肌基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控中起著至關(guān)重要的作用，并積極地促進了其他類型細(xì)胞轉(zhuǎn)化為成肌細(xì)胞以及成肌細(xì)胞分化為肌管。同時研究也已經(jīng)發(fā)現(xiàn)電刺激可以調(diào)節(jié)內(nèi)源性各種生長因子的表達(dá)[20]，并且能夠降低TGF-β的表達(dá)，據(jù)推測這可能與myogenin的作用相關(guān)[21]。而如果給予一定的牽拉刺激，可以增加肌肉組織中蛋白的合成，這其中MyoD在肌衛(wèi)星細(xì)胞激活成為具有成肌特性的肌肉干細(xì)胞過程中至關(guān)重要，而蛋白myogenin則決定了肌肉干細(xì)胞能否終末分化為肌纖維[22]。本實驗研究通過免疫印跡法對MyoD與Myogenin表達(dá)的測定，結(jié)果顯示40Hz的低強度電刺激對于MyoD與Myogenin的表達(dá)起到促進作用，這對于新生肌纖維的結(jié)構(gòu)重塑意義重大。

因此我們可以得到這樣的結(jié)論，腓腸肌急性拉傷后早期采用低強度電刺激治療，可以有效地促進損傷后嘗試著從成肌調(diào)節(jié)因子MyoD與Myogenin蛋白表達(dá)，對于損傷后肌肉組織功能結(jié)構(gòu)的重塑非常有利。但是，目前的研究工作還遠(yuǎn)遠(yuǎn)不足。本實驗研究只是針對肌肉拉傷給予小強度的電刺激治療，嘗試著從成肌調(diào)節(jié)因子MyoD與Myogenin表達(dá)的角度解釋電刺激修復(fù)損傷肌肉的機制，至于發(fā)揮該作用的其它途徑尚不清楚，并且電刺激不同強度的應(yīng)用療效如何依舊有待進一步的分析和探討。

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