再生基因蛋白Ⅳ、骨橋蛋白、表皮生長(zhǎng)因子受體蛋白在胃腺癌中的表達(dá)及臨床意義

楊德生康玉華李福春1孫珠蕾2胡軍紅3陳宏超4索智敏

(河南大學(xué)淮河醫(yī)院消化內(nèi)科，河南開封475000)

摘要〔〕目的研究再生基因蛋白(Reg)Ⅳ、骨橋蛋白(OPN)及表皮生長(zhǎng)因子受體(EGFR)在胃腺癌中的表達(dá)及與其臨床意義。方法應(yīng)用S-P免疫組化技術(shù)檢測(cè)65例胃腺癌及其相應(yīng)的癌旁正常組織中RegⅣ、OPN、EGFR蛋白的表達(dá)。結(jié)果65例胃腺癌組織中RegⅣ、OPN、EGFR蛋白的陽(yáng)性表達(dá)率53.8%(35/65)， 63.1%(41/65)， 56.9%(37/65)均高于癌旁正常組織12.3%(8/65)、4.6%(3/65)、18.5%(12/65)(P<0.05)。RegⅣ蛋白的表達(dá)與胃癌分化程度相關(guān)有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，OPN蛋白的表達(dá)與浸潤(rùn)深度、腫瘤分化程度、臨床分期相關(guān)有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，EGFR蛋白的表達(dá)與胃腺癌的浸潤(rùn)深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、臨床分期相關(guān)有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。RegⅣ、OPN與EGFR蛋白在胃腺癌組織中的表達(dá)呈正相關(guān)關(guān)系(P<0.05)，RegⅣ與OPN蛋白在胃腺癌組織中的表達(dá)呈正相關(guān)關(guān)系(P<0.05)。結(jié)論RegⅣ、OPN、EGFR蛋白均在胃癌組織中表達(dá)呈正相關(guān)，并在胃癌的發(fā)生發(fā)展發(fā)揮重要作用。

關(guān)鍵詞〔〕再生基因蛋白Ⅳ；骨橋蛋白；表皮生長(zhǎng)因子受體；胃腺癌；免疫組織化學(xué)

中圖分類號(hào)〔〕R735.2〔文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼〕A〔

1河南大學(xué)淮河醫(yī)院超聲科2河南大學(xué)淮河醫(yī)院病理科

3河南大學(xué)淮河醫(yī)院普通外科4鄭州市第一人民醫(yī)院消化內(nèi)科

第一作者：楊德生(1981-)，男，碩士，主治醫(yī)師，主要從事消化道腫瘤研究。

胃癌是病死率僅次于肺癌，在中國(guó)的發(fā)病率正在逐年上升的趨勢(shì)〔1~3〕，其中絕大多數(shù)為胃腺癌。盡管已有治療研究取得重大進(jìn)展，但仍不能令人滿意，胃腺癌的5年生產(chǎn)率仍然很低。胃癌治療方面研究的突破取決于胃癌的復(fù)雜的分子機(jī)制等基礎(chǔ)研究的進(jìn)展〔4〕。研究發(fā)現(xiàn)多種基因和表觀遺傳學(xué)的改變?cè)谖赴┑陌l(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要作用，比如粒酶活性，遺傳不穩(wěn)定性、原癌基因、抑癌基因、生長(zhǎng)因子、基質(zhì)降解酶、細(xì)胞周期調(diào)控蛋白、細(xì)胞黏附分子等〔5~7〕。再生基因蛋白(Reg)基因家族是鈣依賴性凝集素超家族〔1,2〕，在一些胃腸道腫瘤中表達(dá)上調(diào)，參與細(xì)胞增殖和分化，RegⅣ是其中一個(gè)新成員〔3,8〕。骨橋蛋白(OPN)是在最初骨基質(zhì)中發(fā)現(xiàn)的，具有多種功能的一種胞外基質(zhì)蛋白，參與細(xì)胞黏附和細(xì)胞遷移，影響腫瘤發(fā)生和轉(zhuǎn)移進(jìn)程〔9〕。表皮生長(zhǎng)因子受體(EGFR)為酪氨酸激酶受體，在體內(nèi)通過(guò)多種信號(hào)途徑在腫瘤的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要作用〔10〕。在胃腺癌中EZH2與EGFR、Akt的蛋白水平的表達(dá)之間的關(guān)系國(guó)內(nèi)外未見報(bào)道。因此，本研究采用免疫組織化學(xué)染色法檢測(cè)RegⅣ、OPN、EGFR蛋白在胃癌及癌旁正常組織中的表達(dá)，為闡明其與胃癌的關(guān)系，探討RegⅣ、OPN、EGFR蛋白在胃癌中的作用及潛在的作用機(jī)制。

1材料與方法

1.1標(biāo)本來(lái)自河南大學(xué)淮河醫(yī)院普通外科2010年1月至2011年6月手術(shù)切除新鮮胃腺癌標(biāo)本 65例，均經(jīng)HE切片病理證實(shí)，所有病例術(shù)前均未接受任何放療或化療，并排除其他臟器的惡性腫瘤。選取同一病例的癌旁切緣正常組織65例作為對(duì)照組。65例胃腺癌中，男34例，女31例；年齡27~79〔平均(46.3±4.5)〕歲；高、中、低分化腺癌分別為16例、22例和27例；淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移44例，無(wú)轉(zhuǎn)移21例；按TNM分期標(biāo)準(zhǔn)，Ⅰ期9例，Ⅱ期15例，Ⅲ期19例及Ⅳ期22例；按浸潤(rùn)深度分，T110例，T215例，T317例， T423例。

1.2試劑及方法濃縮型鼠抗人單克隆抗體RegⅣ、OPN、EGFR及免疫組化試劑盒、DAB試劑盒均購(gòu)自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司。用免疫組化(S-P 法)法：取厚4 μm石蠟切片，常規(guī)脫蠟、水化后，采用電爐加熱煮沸修復(fù)抗原；RegⅣ、OPN、EGFR蛋白單克隆抗體均按1∶100稀釋，操作參照產(chǎn)品說(shuō)明書，以磷酸鹽緩沖液(PBS)代替一抗作為陰性對(duì)照。用已證實(shí)的RegⅣ、OPN、EGFR染色陽(yáng)性胃腺癌切片作陽(yáng)性對(duì)照。

1.3結(jié)果判斷RegⅣ、OPN、EGFR蛋白均按照以下標(biāo)準(zhǔn)：根據(jù)染色程度及陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)來(lái)計(jì)算評(píng)分，a 染色程度:0陰性，1弱陽(yáng)性，2中等陽(yáng)性，3強(qiáng)陽(yáng)性；b 陽(yáng)性細(xì)胞數(shù):無(wú)陽(yáng)性細(xì)胞0，陽(yáng)性細(xì)胞1%~25% 1分，陽(yáng)性細(xì)胞26%~50% 2分，陽(yáng)性細(xì)胞>50% 3分；a+b之和為3~6分者評(píng)為免疫組織染色陽(yáng)性；計(jì)數(shù)方法，結(jié)果判定在雙盲法下進(jìn)行，每張切片由兩名病理醫(yī)師分別判斷。兩者不一致時(shí)重新計(jì)數(shù)。

1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)方法應(yīng)用SPSS13.0軟件進(jìn)行χ2檢驗(yàn)、非參數(shù)檢驗(yàn)的秩和檢驗(yàn)，雙變量相關(guān)關(guān)系分析采用Spearman相關(guān)分析。

2結(jié)果

2.1RegⅣ、OPN、EGFR蛋白的表達(dá) 65例胃腺癌組織中，RegⅣ蛋白陽(yáng)性表達(dá)率53.8%(35/65)，其陽(yáng)性表達(dá)部位為細(xì)胞核；OPN的陽(yáng)性表達(dá)率63.1%(41/65)，陽(yáng)性表達(dá)部位為主要在細(xì)胞質(zhì)；EGFR的陽(yáng)性表達(dá)率56.9%(37/65)，陽(yáng)性表達(dá)部位為細(xì)胞膜，均呈強(qiáng)陽(yáng)性過(guò)度表達(dá)現(xiàn)象。癌旁正常組織中，RegⅣ、OPN、EGFR蛋白均為弱陽(yáng)性低表達(dá)，陽(yáng)性表達(dá)率分別為12.3%(8/65)、4.6%(3/65)、18.5%(12/65)。兩組間表達(dá)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=25.333、49.609、20.471，P=0.00)。見圖1。

2.2Reg Ⅳ、OPN、EGFR蛋白的表達(dá)與胃腺癌的臨床病理特征的關(guān)系Reg Ⅳ蛋白的表達(dá)與胃癌分化程度相關(guān)有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移程度、臨床分期及浸潤(rùn)深度無(wú)關(guān)(P>0.05);OPN與EGFR蛋白的表達(dá)與胃腺癌的浸潤(rùn)深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、臨床分期相關(guān)有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，與腫瘤分化程度無(wú)關(guān)(P>0.05)。見表1。

表1　RegⅣ、OPN、EGFR蛋白陽(yáng)性表達(dá)與

2.3RegⅣ、OPN、EGFR蛋白在胃腺癌中表達(dá)之間的相互關(guān)系RegⅣ、OPN與EGFR蛋白在胃腺癌組織中的表達(dá)呈正相關(guān)(r=0.254,P=0.041;r=0.300,P=0.015)，RegⅣ與OPN蛋白在胃腺癌組織中的表達(dá)呈正相關(guān)(r=0.251,P<0.05)。

RegⅣ

OPN

EGFR

3討論

Reg代表一組小的細(xì)胞再生和增殖所必需的分泌蛋白，形成一種免疫系統(tǒng)〔11,12〕。人的Reg家族中，人RegⅣ基因位于1號(hào)染色體上，不像其他Reg家族基因均位于2p12〔13〕。RegⅣ可在各種正常組織表達(dá)，如胃、大腸、小腸和胰腺〔14,15〕，但其表達(dá)水平較癌組織中要低得多〔16〕。Violette等〔17〕的研究表明，Reg Ⅳ在大腸腫瘤(特別是在黏液癌)相對(duì)于正常大腸組織。一些研究已經(jīng)證明，在胃癌組織中高表達(dá)RegⅣ蛋白。Bishnupuri等〔18〕報(bào)道，用定量聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)測(cè)定，胃癌中RegⅣ基因的表達(dá)顯著高于正常組織。RegⅣ的抗凋亡特性與大腸癌的進(jìn)展和胃癌化療耐藥性密切相關(guān)〔18,19〕，RegⅣ的表達(dá)有望成為一個(gè)標(biāo)記高度惡性潛力的生物學(xué)標(biāo)志物〔15，20，21〕。Oue等〔14〕用免疫組織化學(xué)法檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，結(jié)直腸腺癌RegⅣ蛋白36%高表達(dá)，且與腫瘤分期密切相關(guān)，而在29%的胃腺癌中高表達(dá)，并伴有腸黏蛋白表型和神經(jīng)內(nèi)分泌分化，但與腫瘤分期和預(yù)后無(wú)相關(guān)。本研究發(fā)現(xiàn)，RegⅣ在胃腺癌中高表達(dá)，顯著高于癌旁正常組織中的表達(dá)，且腫瘤分化程度相關(guān)，而與臨床分期、淋巴轉(zhuǎn)移、浸潤(rùn)深度無(wú)關(guān)，與文獻(xiàn)報(bào)道相符，進(jìn)一步證實(shí)了RegⅣ在胃腺癌中的作用。

EGFR是一種跨膜蛋白，屬于ErbB家族受體酪氨酸激酶(RTK)。它被激活后與EGF家族的肽生長(zhǎng)因子結(jié)合，其中包括表皮生長(zhǎng)因子(EGF)，轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子(TGF)-α等〔22,23〕，通過(guò)與配體結(jié)合誘導(dǎo)ErbB受體聚合物和異二聚體，導(dǎo)致細(xì)胞質(zhì)的激酶結(jié)構(gòu)域的酪氨酸激酶自身磷酸化和激活。激活EGFR結(jié)果同時(shí)激活多個(gè)下游信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路調(diào)制的多效性細(xì)胞的反應(yīng)，包括細(xì)胞增殖，遷移，侵襲，抑制細(xì)胞凋亡〔24〕。本研究發(fā)現(xiàn)，EGFR在胃腺癌中高表達(dá)，顯著高于癌旁正常組織中的表達(dá)，且與臨床分期、淋巴轉(zhuǎn)移、浸潤(rùn)深度相關(guān)，而與腫瘤分化程度無(wú)關(guān)，與文獻(xiàn)報(bào)道相符〔25〕，進(jìn)一步證實(shí)了EGFR在胃腺癌中的作用。

OPN首先被確定為一個(gè)非膠原骨基質(zhì)蛋白，它隨后被證明是一種細(xì)胞因子，調(diào)節(jié)免疫細(xì)胞的移動(dòng)〔26〕。此外，OPN作為腫瘤侵襲和轉(zhuǎn)移中的一個(gè)關(guān)鍵的信號(hào)調(diào)節(jié)通路在乳腺癌，肺癌，前列腺癌，卵巢癌和結(jié)腸癌中被證實(shí)〔27,28〕的。OPN可綁定到不同的細(xì)胞表面受體，包括整合素等，誘導(dǎo)并影響腫瘤細(xì)胞的基因表達(dá)，增強(qiáng)的移動(dòng)性和黏附，加速生長(zhǎng)和分裂，以及延長(zhǎng)細(xì)胞的存活，從而腫瘤進(jìn)展和轉(zhuǎn)移的過(guò)程中發(fā)揮重要作用〔29,30〕。OPN最近被認(rèn)為是腫瘤進(jìn)展〔31〕的一個(gè)新的標(biāo)志物。OPN的高表達(dá)水平與腫瘤分期，轉(zhuǎn)移及患者生存期密切相關(guān)〔32〕。在本研究中骨橋蛋白表達(dá)于細(xì)胞質(zhì)，在胃腺癌中的陽(yáng)性率顯著高于癌旁正常組織，且其表達(dá)與腫瘤的淋巴轉(zhuǎn)移、浸潤(rùn)深度、臨床分期相關(guān)，這與目前文獻(xiàn)報(bào)道相符〔33,34〕。

RegⅣ激活的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路知之甚少。EGFR在MKN28和TMK1細(xì)胞中形成自分泌和旁分泌環(huán)路〔35〕。據(jù)報(bào)道，高磷酸化水平的表皮生長(zhǎng)因子受體和RegⅣ在MKN28和TMK1細(xì)胞系中，RegⅣ與EGFR的高磷酸化水平與EGFR的磷酸化有關(guān)〔36〕。Kuniyasu等〔37〕研究發(fā)現(xiàn)在RegⅣ轉(zhuǎn)染MKN28和TMK1胃癌細(xì)胞系中可增加的EGFR磷酸化水平。在RegⅣ轉(zhuǎn)染的MKN28和TMK1細(xì)胞系中，RegⅣ可增加EGFR的磷酸化。在敲除RegⅣ的MKN45細(xì)胞中，反比抑制表皮生長(zhǎng)因子受體磷酸化表達(dá)。Bishnupuri等〔36〕通過(guò)觀察結(jié)腸腺癌細(xì)胞純化rhR4對(duì)的信號(hào)傳導(dǎo)通路響應(yīng)Reg Ⅳ的影響，得出rhR4治療導(dǎo)致EGFR酪氨酸992和Tyr 1068和Akt蛋白在蘇氨酸308和絲氨酸473的快速磷酸化，推測(cè)在人結(jié)腸癌細(xì)胞系RegⅣ蛋白是一種強(qiáng)效的EGFR/磷酸肌醇3-kinase/Akt/AP-1的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路激活劑。激活EGFR信號(hào)傳導(dǎo)通路在結(jié)腸癌細(xì)胞的有絲分裂信號(hào)，增加細(xì)胞增殖，血管生成，轉(zhuǎn)移和抗細(xì)胞凋亡〔38〕。Nanakin等〔39〕發(fā)現(xiàn)，在SW403細(xì)胞系中EGF和TGF-α可增強(qiáng)RegⅣ基因表達(dá)的ERK信號(hào)通路。兩者合計(jì)，這些研究表明，陽(yáng)性表達(dá)EGF和RegⅣ之 間存在反饋回路中的信號(hào)通路。因此，阻斷RegⅣ/EGFR信號(hào)傳導(dǎo)可作為人胃腸腺癌的潛在的治療干預(yù)措施。本研究發(fā)現(xiàn)，RegⅣ和EGFR在胃腺癌中的表達(dá)呈正相關(guān)，進(jìn)一步從蛋白水平證實(shí)了上述觀點(diǎn)。

EGFR和OPN之間的相互作用，在體外的一些實(shí)驗(yàn)性腫瘤系統(tǒng)已被證明，但是，也有沒有報(bào)告其在對(duì)人的活檢組織體內(nèi)實(shí)驗(yàn)中報(bào)道較少。研究發(fā)現(xiàn)，由EGF通過(guò)與受體結(jié)合可以在乳腺癌細(xì)胞，大鼠腎上皮細(xì)胞〔40〕，HepG2細(xì)胞〔41〕，和HL60細(xì)胞〔42〕中誘導(dǎo)骨橋蛋白基因的表達(dá)〔43〕。在另一方面，在對(duì)乳腺癌細(xì)胞的體外研究表明，腫瘤細(xì)胞中的下游信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的激活導(dǎo)致了與整合結(jié)合的OPN誘發(fā)的c-Src的依賴性的EGFR的轉(zhuǎn)錄〔29〕。EGFR酪氨酸激酶信號(hào)途徑可被內(nèi)在受體終止。整合素和生長(zhǎng)因子受體各種激活和抑制信號(hào)的平衡被認(rèn)為可以確定細(xì)胞的命運(yùn)。然而，整合素和生長(zhǎng)因子受體之間的相互作用比簡(jiǎn)單的獨(dú)立激活相同的信號(hào)通路更復(fù)雜〔44〕。在缺乏配體如EGFR的情況，整合素所誘導(dǎo)多種受體酪氨酸激酶激活都將被中斷。在細(xì)胞的生長(zhǎng)和延長(zhǎng)細(xì)胞的存活，蛋白質(zhì)水解等生物學(xué)效應(yīng)方面，骨橋蛋白和表皮生長(zhǎng)因子受體配體結(jié)合和Akt的活化的信號(hào)途徑是重疊的〔45〕。

癌癥的發(fā)生發(fā)展是多個(gè)基因的相互作用的結(jié)果。更好地了解發(fā)生癌變過(guò)程中基因表達(dá)的變化，可用于腫瘤的診斷，治療和預(yù)防。新的生物標(biāo)志物對(duì)癌癥診斷和治療的新靶點(diǎn)鑒定的一個(gè)主要目標(biāo)〔46〕。本研究顯示，RegⅣ、OPN、EGFR在胃腺癌組織中高表達(dá)，且其表達(dá)呈正相關(guān)，提示三者在胃癌的發(fā)生發(fā)展中呈潛在的相互協(xié)調(diào)作用，聯(lián)合監(jiān)測(cè)3個(gè)指標(biāo)有望對(duì)胃腺癌的早期診斷、靶向治療和預(yù)后評(píng)估提供參考，Reg Ⅳ、OPN、EGFR在胃腺癌中的具體作用機(jī)制還有待進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)證明。

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〔2013-09-17修回〕

(編輯趙慧玲/曹夢(mèng)園)