同源盒基因在裸鼠多發(fā)性骨髓瘤中的作用

李燕楊濤1張培軍2楊潔羅建民3郝洪嶺王素云李杰袁軍王瑞倉張曉霞王超

(河北省人民醫(yī)院血液科,河北石家莊050051)

摘要〔〕目的探討同源盒基因(HOX)B在多發(fā)性骨髓瘤(MM)中的作用。方法用免疫組化法、實時RT-PCR技術(shù)、TUNEL法對裸鼠組織細胞中的HOXB基因表達水平進行檢測，檢測結(jié)果經(jīng)過內(nèi)參基因β-actin校正后，按2-ΔΔCt法進行計算。得到各組HOXB相對表達量F值，以對照組為參照，HOXB mRNA相對表達率(%)=100%×(其他組mRNA相對表達量F值/對照組mRNA相對表達量F值)，計算各組HOXB3 mRNA、HOXB4 mRNA和HOXB7 mRNA相對表達水平。結(jié)果在造模實驗中，30只大鼠中死亡1只，造模失敗2只，27只納入觀察組。觀察組HOXB3、HOXB4 、HOXB7 mRNA相對表達水平均高于對照組(P<0.05)。而免疫組化法則發(fā)現(xiàn)觀察組的陽性率遠遠高于對照組。結(jié)論HOXB基因參與MM形成和發(fā)展，在其中扮演了較為重要的角色。

關(guān)鍵詞〔〕同源盒基金(HOX)B；多發(fā)性骨髓瘤；RT-PCR技術(shù)

中圖分類號〔〕R55〔文獻標識碼〕A〔

1河北省人民醫(yī)院泌尿外科2高碑店市醫(yī)院呼吸科

3河北醫(yī)科大學第二附屬醫(yī)院血液科

第一作者：李燕(1978-)，女，碩士，主治醫(yī)師，主要從事惡性血液病研究。

同源盒基因(HOX)最初是在果蠅體內(nèi)被發(fā)現(xiàn)的，后來證實HOX基因存在于所有的動物種類中，而且其作用不僅僅是參與了胚胎發(fā)育，而且也參與了造血干細胞的自我更新及定向分化〔1〕，HOX家族編碼的蛋白質(zhì)是一種高度保守的轉(zhuǎn)錄因子，每個基因中含有同源結(jié)構(gòu)域，分別包括了一個核苷酸序列和若干個氨基酸。目前已經(jīng)被鑒定的人類HOX有39個，HOXB家族是由B1～B9及B13成員組成的。目前對HOXB3、HOXB4和HOXB7基因的研究均集中在其對造血干細胞的影響〔2，3〕及對免疫細胞的增生影響。本研究探討HOXB在鼠多發(fā)性骨髓瘤(MM)中的作用。

1材料與方法

1.1實驗材料30只實驗用裸鼠，均為雌性，6周齡，體重14～16 g，飼養(yǎng)于無菌間層流室內(nèi)，每籠5只，每3 d換1次飼料、飲水及墊料，采用MPC-11骨髓瘤細胞于BALB/c裸鼠皮下接種(接種濃度為6×105個腫瘤細胞)〔4〕，每鼠0.1 ml。30 d后，脫臼處死裸鼠，切其腹部，將其腫瘤部分分離出，分離出漿細胞待檢。造模成功大鼠27只歸入觀察組，選同類體重類似周齡相同的正常裸鼠27只歸入對照組。

1.2方法用免疫組化法、實時RT-PCR技術(shù)、TUNEL法比較兩組裸鼠腹部皮下組織細胞中HOXB基因表達水平。采用Primer 5引物軟件設(shè)計目的檢測物mRNA及內(nèi)參照基因β-actin的PCR引物，經(jīng)GeneBank Blast進行同源性比較，確定其特異性，將引物進行稀釋，在-20℃環(huán)境下進行保存，選擇MM細胞作為觀察點，將其用PBS沖洗2次后放入培養(yǎng)皿中，并且加入裂解細胞，室溫下放置5 min，直到細胞裂解液可以被吸取到EP管中為止，將其輕輕地進行顛倒混合，再放置2 min，然后加入配合好濃度的氯仿，并且用槍頭反復(fù)吹打幾次，靜置10 min。凝膠電泳檢測樣品見圖1。按照上述方法可以獲得RNA，經(jīng)檢驗符合實驗要求后，對其進行逆轉(zhuǎn)錄，將mRNA進行反轉(zhuǎn)錄，變成cDNA，逆轉(zhuǎn)錄操作按照試劑盒(PrimeScriptTMRT Reagent Kit)操作說明。操作后可以得到的各個標本基因的相關(guān)數(shù)據(jù)，細胞系HOXB mRNA相對表達量 = 2-ΔΔCt，其中ΔCt = Ct(PANC-1)-Ct(β-actin)。免疫組化方法是10%正常血清阻斷非特異性結(jié)合位點，室溫20 min；不洗，滴加適當稀釋一抗，37℃ 2 h，PBS洗3×3 min；生物素化豬抗羊IgG 1∶200 37℃ 30 min；PBS洗3×3 min；Streptavidin-HRP 1∶200 37℃ 30 min；PBS洗3×3 min；0.05% DAB+0.03%H2O2顯色8～12 min，水洗；蘇木素襯染，水洗；吹干，樹膠封片；結(jié)果中陽性表達呈棕褐色，背景為青藍色。每張切片隨機觀察5個視野，每個視野計數(shù)500個細胞中出現(xiàn)的陽性細胞數(shù)，計算凋亡細胞指數(shù)(AI=TUNEL 染色陽性細胞數(shù)/腫瘤細胞數(shù)×100%)。

1～4：為提取的RNA樣品 圖1　凝膠電泳檢測樣品

1.3統(tǒng)計學方法采用SPSS16.0統(tǒng)計軟件進行t及χ2檢驗。

2結(jié)果

2.1造模結(jié)果以B細胞轉(zhuǎn)化為惡性漿細胞，能在半固體培養(yǎng)基上生長及使裸鼠生長腫瘤、腫瘤的病理檢測、小鼠血清免疫固定電泳等特征，利用影像學檢查發(fā)現(xiàn)裸鼠體內(nèi)腫瘤長至長徑0.8 cm，判斷為造模成功。

2.2HOXB3、HOXB4、HOXB7基因表達水平在兩組中的比較觀察組HOXB3、HOXB4、HOXB7 mRNA相對表達水平均明顯高于對照組，見表1。

2.3兩組HOXB基因陽性表達情況觀察組組織細胞的各個階段可見陽性顆粒沉著于腫瘤細胞胞質(zhì)。見圖2。

表1　兩組HOXB3、HOXB4、HOXB7 mRNA

圖2　對照組及觀察組各個時間段HOXB基因表達情況(×400)

3討論

MM屬于惡性漿細胞病，其發(fā)病特征就是單克隆漿細胞惡性增殖，并且分泌了大量的單克隆免疫球蛋白，前者又引發(fā)了后者無序的增生，并且形成了浸潤的特征，大量單克隆免疫球蛋白出現(xiàn)，導(dǎo)致了蛋白分泌的抑制，破壞了骨質(zhì)，并且還會形成反復(fù)感染，貧血和高鈣血癥等，這一系列臨床表現(xiàn)導(dǎo)致了嚴重的不良后果，所以引起其發(fā)病因素還不是很明確，但是很多研究認為其主要表達B細胞——漿細胞特點，所以其起源可能比起B(yǎng)細胞更早，有可能是造血前體細胞發(fā)生惡變而形成的。采用MPC-11骨髓瘤細胞于BABL /c小鼠皮下接種的方法，成功建立MM動物模型方法可靠〔4,5〕。

HOXB基因在造血調(diào)控中發(fā)揮重要的作用，并且也參與了干細胞和免疫細胞增殖和凋亡的過程，其表達異常參與了各類血液疾病和惡性細胞腫瘤的發(fā)生。HOXD13突變會造成多指癥，HOXA13突變則會導(dǎo)致手腳生殖器征，HOXB群集中的8個成員會影響紅細胞的發(fā)育，其中HOXB4與HOXB7又會影響T細胞與B細胞。由此可知，該細胞基因可能與同樣因較前B細胞更早的造血前體細胞的惡變產(chǎn)生的MM有關(guān)。本研究提示HOXB基因參與MM形成和發(fā)展，在其中扮演了較重要的角色。HOXB基因表達水平對MM生物學行為的影響：首先，下調(diào)HOXB表達水平抑制干細胞和免疫細胞系的生長增殖能力，免疫細胞衰減及干細胞造血功能的損傷，使得各類腫瘤細胞無限制生長增殖。

但是本研究也同樣提出一系列未解決的問題，例如，即便了解了MM組織HOXB基因表達的異常性，如何對其進行靶向治療，誰是HOXB的靶基因。即便找到了靶基因，那么靶向性分布仍然不能保證100%進入腫瘤細胞，同樣不可避免地進入正常細胞并表達，對正常細胞構(gòu)成潛在的生物學威脅，影響正常細胞的增殖？這些問題都有待進一步研究。

4參考文獻

1Filleur S，Courtin A，Ait-Si-Ali S，etal.SiRNA-mediated inhibition of vascular endothelial growth factor severely limits tumor resistance to antiangiogenic thrombospondin-1 and slows tumor vascularization and growth〔J〕.Cancer Res，2013；63：3919-22.

2Rozenfeld S，Shen W.HOXB6 overexpression in murine bone marrow immortalizes a myclomoncytic precursor in vitro and causes hematopietic stem cell expansion and acute mycloid leukemia in vivo〔J〕.Blood，2011；(4)：1546-66.

3Denk C，Butz K，Schneider A，etal.p53 mutations are rare events in recurrent cervical cancer〔J〕.J Mol Med，2001；79：283-8.

4劉瑜，周美玉，孟文彤，等.多發(fā)性骨髓瘤局部成瘤小鼠模型的建立〔J〕.中國實驗血液學雜志，2010；3(1)：34-5.

5黃媚賢，劉文君，郭渠蓮，等.人巨細胞病毒感染對臍血紅系祖細胞發(fā)育過程中Hoxb2，Hoxb4基因表達的影響〔J〕.中國組織工程研究與臨床康復(fù)，2010；45(1)：56-7.

〔2014-01-23修回〕

(編輯苑云杰)