雙熒光mRFP-eGFP-LC3體系在細胞自噬中的作用*

**通信作者 E-mail:shaojunliu@yahoo.com

網(wǎng)絡(luò)出版時間：2015-09-11網(wǎng)絡(luò)出版地址：http://www.cnki.net/kcms/detail/52.5012.R.20150911.2321.062.html

黃楨鈞， 劉彬， 劉本榮， 劉少軍**

(廣州心血管疾病研究所 廣州醫(yī)科大學附屬第二醫(yī)院 心內(nèi)科， 廣東 廣州510260)

[摘要]目的： 探討雙熒光mRFP-eGFP-LC3(ptfLC3)體系在細胞自噬中的作用。方法: 采用不同濃度雷帕霉素(50、100、200、500、1 000 nmol/L)處理人胚腎細胞(HEK293)，蛋白印跡法檢測不同濃度雷帕霉素組中自噬標記蛋白(LC3蛋白)的表達及LC3-II/LC3-I比值；單熒光GFP-LC3質(zhì)粒和雙熒光mRFP-eGFP-LC3質(zhì)粒轉(zhuǎn)染HEK293細胞，雷帕霉素(200 nmol/L)處理3 h，采用熒光顯微鏡統(tǒng)計，并比較兩種方法轉(zhuǎn)染后HEK293細胞內(nèi)LC3亮點的變化。結(jié)果： 不同濃度雷帕霉素處理HEK293細胞，LC3-II蛋白和LC3-II/LC3-I比值均增加；轉(zhuǎn)染GFP-LC3質(zhì)粒時，雷帕霉素處理HEK293細胞中綠色亮點的數(shù)量增加；轉(zhuǎn)染mRFP-eGFP-LC3質(zhì)粒時，雷帕霉素處理HEK293細胞中綠色和紅色亮點數(shù)量均增加。結(jié)論： 雙熒光mRFP-eGFP-LC3體系優(yōu)于單熒光GFP-LC3體系，更能全面完整地反映細胞自噬水平，能夠反映細胞內(nèi)自噬流的變化，是自噬定量分析的可靠方法。

[關(guān)鍵詞]雷帕霉素； 自噬； 人胚腎細胞； LC3； 單熒光GFP-LC3質(zhì)粒； 雙熒光mRFP-eGFP-LC3

[基金項目]*國家自然科學基金青年項目(81300151)

[中圖分類號]R34-33

Evaluating the Effect of Dual-Fluorescence mRFP-eGFP-LC3 in Autophagy

HUANG Zhenjun, LIU Bin, LIU Benrong, LIU Shaojun

(DepartmentofCardiology,GuangzhouInstituteofCardiovascularDisease,theSecondAffiliatedHospital

ofGuangzhouMedicalUniversity,Guangzhou510260,Guangdong,China)

Abstract[] Objective:To investigate the effect of dual-fluorescence mRFP-eGFP-LC3 (ptfLC3) in autophagy. Methods: HEK293 cells were treated with rapamycin(50, 100, 200, 500, 1 000 nmol/L)for 3h and then adopting Western blot to test the expression of LC3 protein and ratio of LC3-II/LC3-I. Mono-fluorescence GFP-LC3 and dual-fluorescence mRFP-eGFP-LC3 transfected HEK293 cells. 24 h after the transfection, the cells were treated with rapamycin(200 nmol/L)for an additional 3 h, then analyzed by fluorescence microscopy to compare the spot change of LC3 in HEK293 cells. Results: Different concentration of rapamycin increased the ratio of LC3-II/LC3-I in HEK293 cells. After transfected with plasmids, green spot increased in rapamycin treated HEK293 cells; while for mRFP-eGFP-LC3 plasmids transfection, green and red spot increased in rapamycin treated HEK293 cells. Conclusion: Dual-fluorescence mRFP-eGFP-LC3 is superior to mono-fluorescence GFP-LC3, which can comprehensively reflect the level of autophagy and changes of autophagic flux, providing a reliable method for the quantitative analysis of autophagy.

[Key words] rapamycin; autophagy; human embryonic kidney cells; LC3; mono-fluorescence GFP-LC3 plasmid; dual-fluorescence mRFP-eGFP-LC3

自噬(autophagy)即自體吞噬，與異體吞噬相對，是細胞內(nèi)形成的雙層膜結(jié)構(gòu)包繞自己內(nèi)部受損傷的蛋白質(zhì)或細胞器，比如線粒體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)或高爾基體碎片等，進而與溶酶體融合將其內(nèi)容物降解的過程。越來越多的研究發(fā)現(xiàn)，自噬與惡性腫瘤、心臟疾病、神經(jīng)退行性疾病等密切相關(guān)[1-2]，這使得自噬成為一個非常熱門的研究領(lǐng)域，也建立了一系列與之相適應(yīng)的自噬檢測方式，如電鏡和熒光顯微鏡的應(yīng)用，蛋白印跡法檢測自噬相關(guān)蛋白LC3和P62，長壽命蛋白的檢測等等。然而，自噬的復(fù)雜性和許多未知性決定了聯(lián)合應(yīng)用多種檢測方式的必要性，因為到目前為止還沒有任何一種方法能夠全面反映自噬水平的變化，尤其是定量分析方法還不成熟，存在許多缺點。本研究介紹一種可靠的自噬定量分析方法，即雙熒光mRFP-eGFP-LC3體系，并將其與GFP-LC3和蛋白印跡法相比較，以期解決在應(yīng)用該方法時面臨的一些實際問題，為自噬活性的檢測、尤其是在自噬定量分析方面提供參考。

1材料和方法

1.1試劑與儀器

DMEM培養(yǎng)液購自Gbico公司，雷帕霉素購自生工生物工程(上海)股份有限公司，GFP-LC3質(zhì)粒由本實驗室構(gòu)建。mRFP-eGFP-LC3質(zhì)粒購自Addgene(plasmid：21074)[3]，Lipofactamine 3000轉(zhuǎn)染試劑盒購自Life Technologies，LC3B兔抗人多克隆抗體購自Sigma公司(#L7543)，β-Tubulin鼠抗人單克隆抗體(#M20005)購自Abmart公司，HRP標記羊抗兔、羊抗小鼠IgG購自Cell Signaling公司(#7074，#7076)。儀器和耗材包括Thermo scientific 3110系列II CO2培養(yǎng)箱、AMG EVOS fl熒光顯微鏡、Sonics & Materials超聲波破碎儀、Thermo scientific BCA蛋白測定試劑盒、Biotek Epoch酶標儀以及BIO-RAD電泳儀和轉(zhuǎn)膜儀。

1.2HEK293細胞培養(yǎng)

HEK293細胞購自中國科學院細胞庫，采用DMEM高糖培養(yǎng)液(含10%胎牛血清、1%青霉素-鏈霉素)培養(yǎng)，在37 ℃、5% CO2、濕化的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，2 d換液1次，隔4～5 d傳代1次，取對數(shù)生長期細胞進行實驗。

1.3蛋白印跡法檢測LC3-II/LC3-I表達

采用不同濃度雷帕霉素(50、100、200、500、1 000 nmol/L)處理HEK293細胞3 h后收獲細胞，4 ℃預(yù)冷PBS洗2遍，用適量RIPA裂解液冰上裂解5 min，刮下細胞，30%強度超聲1 s×3次。4 ℃ 10 000 r/min離心10 min。BCA法測定蛋白濃度，12% SDS-PAGE200V電泳，100 V轉(zhuǎn)膜1 h，5%脫脂牛奶室溫封閉1 h，一抗LC3(1∶2 000)和β-Tubulin(1∶5 000)4 ℃孵育過夜。用相應(yīng)種屬二抗室溫孵育1 h。ECL發(fā)光顯影。Image-Pro Plus6.0軟件分析Western blot條帶的灰度值，并計算LC3-II/LC3-I的比值。

1.4單熒光GFP-LC3質(zhì)粒轉(zhuǎn)染

采用GFP-LC3質(zhì)粒瞬時轉(zhuǎn)染HEK293細胞，24 h后再用雷帕霉素(200 nmol/L)處理3 h，400倍熒光顯微鏡下觀察細胞內(nèi)GFP-LC3綠色亮點的變化，并在每個實驗組隨機選取300個細胞進行拍照，重復(fù)3次，取平均值。

1.5雙熒光mRFP-eGFP-LC3質(zhì)粒轉(zhuǎn)染

mRFP-eGFP-LC3質(zhì)粒轉(zhuǎn)染HEK293細胞24 h，再以雷帕霉素(200 nmol/L)處理3 h，400倍熒光顯微鏡觀察細胞內(nèi)紅色和綠色LC3亮點變化，隨機選取300個細胞拍照，包括紅色熒光圖、綠色熒光圖，重復(fù)3次，取平均值。

1.6統(tǒng)計學分析

采用SPSS 13.0軟件進行分析，兩組數(shù)據(jù)之間的比較采用t檢驗，P<0.05表示差異有統(tǒng)計學差異。

2結(jié)果

2.1LC3蛋白及LC3-II/LC3-I比值

雷帕霉素處理HEK293細胞后，LC3-II蛋白及LC3-II/LC3-I比值均增加,并呈濃度依賴性，見圖1。

圖1　不同濃度雷帕霉素處理后HEK293 細胞LC3蛋白的表達 Fig.1　The expression of LC3-II/LC3-I in HEK293 cells after treated with different concentration of rapamycin

2.2mRFP-eGFP-LC3質(zhì)粒圖譜及其蛋白的表達

ptfLC3質(zhì)粒可表達出mRFP-eGFP-LC3融合蛋白(圖2)，該蛋白中mRFP發(fā)射紅色熒光，eGFP發(fā)射綠色熒光。

2.3雙熒光mRFP-eGFP-LC3體系與單熒光GFP-LC3體系

單熒光法可見GFP-LC3亮點增加，表明細胞內(nèi)自噬體增加；雙熒光法可見紅色和綠色亮點均增加，在紅、綠色合成圖像中黃色亮點(自噬體)和紅色亮點(自噬溶酶體)均增加(圖3)。

圖2　mRFP-eGFP-LC3質(zhì)粒圖譜及蛋白表達 Fig.2　Plasmid map of mRFP-eGFP-LC3 and the protein expression

3討論

目前，研究自噬的定量分析方法多使用GFP-LC3法，即通過轉(zhuǎn)染可表達GFP-LC3融合蛋白的質(zhì)粒，使LC3攜帶有綠色熒光，從而可通過熒光顯微鏡觀察細胞內(nèi)LC3的定位和轉(zhuǎn)化。LC3-I在細胞質(zhì)內(nèi)散在分布，熒光顯微鏡下呈彌散分布的綠色熒光，而LC3-II則聚集在自噬囊泡的內(nèi)外膜上，包括自噬前體、自噬體、自噬溶酶體，使得這些自噬結(jié)構(gòu)呈綠色亮點(LC3亮點)。因此我們可以用LC3亮點來反映細胞內(nèi)自噬囊泡的數(shù)量。但由于綠色熒光在自噬體與溶酶體融合成自噬溶酶體后的酸性環(huán)境下易淬滅，GFP-LC3法用于自噬定量分析的準確性欠佳。

注：A、B為LC3熒光亮點的典型圖像，C為平均每個細胞含有的自噬體(GFP-LC3亮點)，D為平均每個細胞含有的 自噬體(合成圖像中的黃色亮點)和自噬溶酶體(合成圖像中的紅色亮點)； (1)與對照組比較，P<0.05 圖3　雙熒光mRFP-eGFP-LC3體系與單熒光GFP-LC3體系比較 Fig.3　Comparison of dual-fluorescence mRFP-eGFP-LC3 and mono-fluorescence GFP-LC3 in HEK293 cell

雙熒光mRFP-eGFP-LC3體系是比GFP-LC3更可靠的自噬定量分析方法。該體系最大的優(yōu)點是可以同時直觀地判斷細胞自噬活性和自噬流(自噬通量)的變化，而不需要外加其它藥物干預(yù)。根據(jù)RFP紅色熒光不易在溶酶體酸性環(huán)境下降解的特點[3-4]，本研究采用mRFP-eGFP-LC3轉(zhuǎn)染細胞。由于LC3攜帶有mRFP的紅色熒光和eGFP的綠色熒光，并可大量聚集在自噬前體和自噬體膜上, 使它們在熒光顯微鏡的紅綠合成圖像中呈黃色亮點；但LC3攜帶的eGFP綠色熒光在自噬體與溶酶體融合形成自噬溶酶體的酸性條件下發(fā)生淬滅，而mRFP紅色熒光耐受降解，使自噬溶酶體呈紅色亮點。因此mRFP紅色熒光可全程標記和追蹤LC3,而eGFP的減弱可以指示自噬體和溶酶體的融合。當自噬被誘導時，黃色亮點(主要是自噬體)和紅色亮點(自噬溶酶體)都增加；當自噬被抑制引起自噬體生成減少時，黃色亮點和紅色亮點都減少；當自噬被抑制引起自噬體降解障礙時，黃色亮點增加，紅色亮點減少或者不變。據(jù)此我們還可以根據(jù)黃色和紅色的相互對比監(jiān)測自噬體到自噬溶酶體的轉(zhuǎn)化，因為自噬過程是否順暢影響細胞的生理狀態(tài)。本研究以雷帕霉素處理HEK293細胞,蛋白印跡法檢測LC3-II及LC3-II/LC3-I均增加，這說明雷帕霉素可誘導HEK293細胞自噬，建立雷帕霉素誘導的HEK293細胞自噬模型；并以該細胞模型為基礎(chǔ)雙熒光mRFP-eGFP-LC3體系與單熒光GFP-LC3體系進行比較，結(jié)果顯示mRFP-eGFP-LC3體系具有更大的優(yōu)越性，它可以同時反映自噬體和自噬溶酶體的變化，監(jiān)測細胞內(nèi)自噬流的變化，因而可以取代GFP-LC3用于自噬定量分析。

在應(yīng)用雙熒光法時需要注意幾個問題。(1)許多細胞尤其是腫瘤細胞保持著一定水平的基礎(chǔ)自噬，轉(zhuǎn)染mRFP-eGFP-LC3后即可觀察到一定數(shù)量的LC3亮點，需要設(shè)立嚴格的實驗對照。(2)串聯(lián)mRFP-eGFP-LC3的表達和轉(zhuǎn)染試劑本身可能對細胞有一定的毒性，使本底LC3亮點增加，mRFP-eGFP-LC3蛋白表達過多也會使背景太亮難以準確計數(shù)亮點，因此必須優(yōu)化轉(zhuǎn)染條件。本研究使用毒性更小的Lipo3000，根據(jù)細胞狀況確定質(zhì)粒DNA與轉(zhuǎn)染試劑的最佳比例，并在轉(zhuǎn)染后等待24～48 h再處理細胞，大大減少了背景水平，方便計數(shù)。(3)最好使用超過一個時間點觀察早期自噬體的增加和隨后晚期自噬體的增加，作為自噬流維持的一個額外保證[5]。(4)確立一套合理的計數(shù)標準非常重要，否則很容易引起誤差導致統(tǒng)計結(jié)果不準確，因為目前還沒有統(tǒng)一的標準來明確多大、多亮的斑點才納入統(tǒng)計。在某些情況下自噬體會發(fā)生相互融合，形成更大的亮點，而亮點的大小與自噬水平的還不明確；而當LC3亮點大量增加時也會使計算十分困難。(5)本研究分別統(tǒng)計了平均每個細胞含有的黃色和紅色LC3亮點數(shù)目，是比較可靠合理的方法[6]，也可以統(tǒng)計含有LC3亮點的細胞占所有細胞的百分比。(6)目前已經(jīng)有人嘗試使用特殊的圖像識別系統(tǒng)應(yīng)用于自噬結(jié)構(gòu)的定量分析[7-8]。

另外在應(yīng)用雙熒光結(jié)構(gòu)體系時使用Cellomics顯微鏡對黃色亮點和紅色亮點進行自動化定量分析，可以在許多隨機的視野內(nèi)評估大量的細胞(1 000個以上),這會比手動評估一些挑出來的細胞更準確、更可靠[9]。

總之，根據(jù)雙熒光結(jié)構(gòu)能夠發(fā)出不同熒光信號及其對酸性PH的敏感性不同，為監(jiān)測許多細胞類型的自噬流提供了一個方便的方法。目前，雙熒光mRFP-eGFP-LC3已經(jīng)逐漸得到許多學者的認可，相信會在自噬的研究領(lǐng)域得到越來越廣泛的應(yīng)用。

4參考文獻

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(2015-05-22收稿，2015-08-16修回)

中文編輯： 文箐潁； 英文編輯： 趙毅