郭 丹，宋先忱，張興會，豆興堂，李豐田，趙艷嬌（遼寧省畜牧科學(xué)研究院，遼陽 111000）

繁殖與生理

遼寧絨山羊羔羊體外胚胎生產(chǎn)技術(shù)的研究

郭 丹，宋先忱，張興會，豆興堂，李豐田，趙艷嬌
（遼寧省畜牧科學(xué)研究院，遼陽 111000）

以4～8周齡的遼寧絨山羊母羔為研究對象，研究不同年齡階段羔羊卵泡發(fā)育數(shù)量和發(fā)育質(zhì)量的變化，同時還比較了不同基礎(chǔ)液作為受精液對體外受精和早期卵裂的影響，并嘗試研究了在早期胚胎的發(fā)育培養(yǎng)液中添加EDTA的效果。結(jié)果表明：6～8周齡母羔的卵母細(xì)胞體外成熟率和受精率均顯著高于4～6周齡母羔；利用SOF液作為受精體系的基礎(chǔ)液時體外受精的效果更好，卵裂率達(dá)42.47%；在早期胚胎的發(fā)育液中添加10μmol/L EDTA可有效提高16細(xì)胞以上的胚胎數(shù)。

遼寧絨山羊；羔羊；超數(shù)排卵；體外受精；胚胎移植

幼畜體外胚胎移植（juvenile in vitro embryotransfer，JIVET）技術(shù)是利用幼齡母畜卵巢對激素誘導(dǎo)卵泡發(fā)育敏感，卵母細(xì)胞生產(chǎn)效率高于成年母畜數(shù)倍的生理特點，采用外源促性腺激素處理幼齡母畜，誘導(dǎo)卵巢卵泡超數(shù)發(fā)育，將活體取卵、卵母細(xì)胞成熟、體外受精、胚胎移植等技術(shù)相結(jié)合而形成的幼畜體外胚胎生產(chǎn)的技術(shù)［1］。傳統(tǒng)的超數(shù)排卵與胚胎移植（MOET）方案用于成年母羊，所需的一個世代間隔至少為12個月，將JIVET技術(shù)用于4～8周齡羔羊，可將世代間隔縮短至6～7個月。有效縮短家畜繁殖的世代間隔，充分發(fā)掘優(yōu)良遺傳性狀母畜的繁殖潛能，提高畜群的遺傳改良速度與生產(chǎn)效率，為家畜育種提供豐富的遺傳資源。

1 試驗材料

1.1 供、受體母羊

選擇年齡4～8周齡、體重5～8 kg、體質(zhì)健康、體況良好、精神狀態(tài)佳的哺乳期羔羊10只，按照年齡分為2組，其中4～6周齡的羔羊為試驗I組，6～8周齡的羔羊為試驗II組，每組5只。同時選擇20只體況良好、體格健壯的經(jīng)產(chǎn)母羊作為胚胎移植的受體母羊，均由遼寧省遼寧絨山羊育種場有限公司提供。

1.2 主要儀器設(shè)備

活體采卵泵：Craft，英國；電子天平：AB135-S，瑞士；CO2培養(yǎng)箱：HERACELL150，美國；超純水儀：Pulse1+PURELAB flex，美國ELGA；顯微鏡：Leica M165C，德國。

1.3 超數(shù)排卵及同期發(fā)情藥物

促卵泡素FSH（100 IU/支，寧波第二激素廠產(chǎn)），促卵泡素FSH（400mg/瓶，加拿大產(chǎn)），孕馬血清促性腺激素PMSG（1 000 IU/支，寧波市三生藥業(yè)有限公司產(chǎn)），促黃體素LH（40mg/瓶，加拿大產(chǎn)）。

1.4 細(xì)胞體外培養(yǎng)藥物

Medium 199（with Earle’ssalts）：M3769，Sigma；FSH（加拿大產(chǎn)，400mg/瓶，批號：R9D19A）；肝素：H01923，Bioszune分裝；發(fā)情羊血清（ESS）：絨山羊發(fā)情當(dāng)天用常規(guī)血清制備法自制，56℃滅活處理30min；17β-雌二醇：E8875，Sigma分裝；BSA：4919，Sigma分裝；Mineraloil：M5904，規(guī)格500mL，Sigma分裝；E2：E8875，Sigma分裝；其他試劑除特殊說明外均購自Sigma公司。

1.5 培養(yǎng)液的配制

采卵液：M199+5mmol/LNaHCO3+10mmol/LHEPES+ 10mmol/LHEPES-Na+0.01g/L肝素鈉+1%FCS+0.065g/L青霉素G鈉+0.05 g/L鏈霉素鈉。

卵母細(xì)胞成熟液：M199原液+15%ESS+10μg/mL FSH+10μg/mLLH+1μg/mLE2。

精子獲能液：SOF（TALP）基礎(chǔ)液+10%ESS+25μg/mL肝素+10μL/mL青鏈霉素。

受精液：SOF（TALP）基礎(chǔ)液+6mg/mL BSA+1μg/mL亞?；撬徕c+10μL/mL青鏈霉素。

胚胎發(fā)育液：SOF（TALP）基礎(chǔ)液+1%非必需氨基酸（V/V）+1%必需氨基酸（V/V）+8mg/mL BSA+10μmol/L EDTA（EDTA組有，對照組沒有）。

2 方法

2.1 羔羊的超排方案

羔羊超數(shù)排卵采取后腿內(nèi)側(cè)肌肉注射，分4針注射，第1針為國產(chǎn)的PMSG（300 IU），后3針為加拿大產(chǎn)的FSH（40mg），每針間隔12 h。超排藥物均需統(tǒng)一用稀釋液溶解后，用移液器按計量分裝到EPPENDOF管內(nèi)，冷凍保存，避免藥物因反復(fù)凍融而導(dǎo)致藥物成分的變化。

2.2 卵母細(xì)胞的采集

采卵方法為常規(guī)手術(shù)法，在超排處理最后一針結(jié)束后10～12h手術(shù)，采用活體采卵方法收集卵母細(xì)胞，用10mL注射器抽吸卵巢上2～6mm卵泡內(nèi)的卵泡液，轉(zhuǎn)移入離心管中，在無菌操作間用實體顯微鏡撿取卵丘-卵母細(xì)胞復(fù)合體（COCs）。

2.3 卵母細(xì)胞成熟培養(yǎng)

將獲得的卵母細(xì)胞用采卵液漂洗干凈后，按照細(xì)胞級別檢出，將A、B級別的卵母細(xì)胞在成熟液中洗3次，移入100μL成熟液滴中（Nunc產(chǎn)35mm×10mm培養(yǎng)皿，液滴上覆蓋礦物油，在培養(yǎng)皿中預(yù)先培養(yǎng)2 h），每個液滴放入15～20枚卵母細(xì)胞，置于5%CO2、飽和濕度和38.5℃的二氧化碳培養(yǎng)皿中，成熟培養(yǎng)24 h。

2.4 體外受精操作

2.4.1 精子獲能 取0.25mL的細(xì)管冷凍精液（遼寧省遼寧絨山羊原種場有限公司提供）2～3管，在37℃恒溫水浴鍋中解凍，在顯微鏡下觀察精液質(zhì)量。取鏡檢合格的精液150～200μL，輕輕加入到含有800μL獲能液的圓底玻璃試管中（38.5℃、5%CO2下平衡4 h），豎直輕輕地放入CO2培養(yǎng)箱內(nèi)，使精子獲能上游20～30min。

2.4.2 卵母細(xì)胞準(zhǔn)備 將成熟培養(yǎng)24 h后的卵母細(xì)胞在0.1%的透明質(zhì)酸酶液中反復(fù)吹打沖洗1次，除去部分卵丘細(xì)胞，保留2～3層卵丘細(xì)胞，再將卵母細(xì)胞轉(zhuǎn)移到受精液中，用受精液洗滌2～3遍，將卵母細(xì)胞轉(zhuǎn)移到含有受精液的四孔板中。四孔板每孔中含有400μL受精液，上覆蓋礦物油，預(yù)先在38.5℃、5%CO2的條件下平衡4 h。每孔加入25～30枚卵母細(xì)胞。

2.4.3 體外受精操作 取微量圓底玻璃試管中的上清液，移入1.5mL的離心管中，1 000 r/min離心5min，棄上清，再加入200μL受精液懸浮，顯微鏡下再次檢查精子活力和密度，根據(jù)精子密度取適量上清液，使精子密度為1×106個/mL，輕輕加入到含有卵母細(xì)胞的四孔板中，避免產(chǎn)生氣泡，并將四孔板放入CO2培養(yǎng)箱，38.5℃、5% CO2、飽和濕度下，精卵受精作用20 h。

2.5 早期胚胎體外發(fā)育培養(yǎng)

精卵受精24 h后，將假定合子轉(zhuǎn)移到胚胎發(fā)育洗滌液中，巴氏撿卵管輕輕吹打假定合子周圍的卵丘細(xì)胞與粘附的精子，使之脫落。體式鏡下配合撿卵管撥動假定合子，觀察。將假定合子在胚胎發(fā)育液中洗滌2～3遍，轉(zhuǎn)移到含胚胎發(fā)育液的四孔板中（每孔600μL發(fā)育液，上覆蓋礦物油），每個微滴放入假定合子15～20枚，在38.5℃、5%CO2、飽和濕度下培養(yǎng)24 h后觀察卵裂情況。

2.6 受體羊同期發(fā)情及胚胎移植

受體羊陰道埋植CIDR 15 d，撤去CIDR的同時每只受體羊注射PMSG 250 IU。于受體羊發(fā)情后2 d，采用手術(shù)法將發(fā)育到4～8細(xì)胞的體外胚胎移入受體羊卵巢上黃體發(fā)育良好的同側(cè)輸卵管內(nèi)，每只受體移入體外受精胚胎2～3枚。統(tǒng)計移植受體的產(chǎn)羔結(jié)果。

2.7 統(tǒng)計分析

試驗數(shù)據(jù)用SPSS 13.0軟件One-Way ANOVA程序進(jìn)行方差分析，差異顯著性用t檢驗，P＞0.05為差異不顯著，P＜0.05為差異顯著，P＜0.01為差異極顯著。

3 結(jié)果與分析

3.1 羔羊不同周齡階段對卵母細(xì)胞體外成熟培養(yǎng)的影響

從表1可見，兩組平均回收的卵母細(xì)胞數(shù)可達(dá)59.5枚，說明本試驗中所采取的超數(shù)排卵方案是較理想的。其中I組顯著高于II組（P＜0.05），平均回收卵母細(xì)胞數(shù)可達(dá)66.6枚，說明卵巢對激素的反應(yīng)雖然存在差異，但是年齡對卵泡數(shù)量和胚胎生產(chǎn)的影響較大。結(jié)果表明，4～6周齡母羊的誘導(dǎo)卵泡發(fā)育效果較理想，6～8周齡母羊次之。而兩組平均體外成熟的卵母細(xì)胞數(shù)為23.0枚，說明體外成熟培養(yǎng)體系也是成熟穩(wěn)定的。從表2可以看出，雖然兩組平均成熟的卵母細(xì)胞數(shù)差異并不顯著（P＞0.05），但I(xiàn)I組的體外成熟率和卵裂率顯著高于I組，說明6～8周齡母羊的體外發(fā)育能力比4～6周齡母羊的要強(qiáng)。因此，在選擇供體羔羊時，盡量選擇6～8周齡的母羊，效果會更好一些。

表1 羔羊不同周齡階段對卵母細(xì)胞體外成熟的影響

表2 羔羊不同周齡階段超排處理后的發(fā)育情況

3.2 不同受精體系對卵裂及胚胎發(fā)育的影響

本試驗采用了TALP基礎(chǔ)液和SOF基礎(chǔ)液作為受精體系的兩種基礎(chǔ)液，其他添加成分均一致。從表3可見，SOF受精體系卵裂率顯著高于TALP（P＜0.05）。因此，對于遼寧絨山羊羔羊體外胚胎的生產(chǎn)應(yīng)選擇SOF受精體系更為高效。

表3 受精體系對胚胎發(fā)育的影響

3.3 發(fā)育液中添加10μmol/LEDTA對幼羔早期胚胎體外發(fā)育的影響

EDTA作為一種抗氧化劑，可以清除胚胎代謝過程中所產(chǎn)生的有害自由基，有利于胚胎的體外發(fā)育［2］。因此，在本試驗中，設(shè)計了添加10μmol/LEDTA的EDTA組和無添加的對照組。由表4可知，EDTA組受精卵48 h卵裂率（53.3%）顯著高于對照組（37.3%）（P＜0.05）；體外受精I(xiàn)VF后第5天發(fā)育至16細(xì)胞以上胚胎的百分率（78.1%）也極顯著高于對照組（45.4%）（P＜0.01）。

表4 發(fā)育液中添加EDTA對羔羊卵母細(xì)胞體外胚胎發(fā)育的影響

3.4 幼羔超排生產(chǎn)體外胚胎移植產(chǎn)羔結(jié)果

試驗共移植受體母羊20只，妊娠3只，產(chǎn)下4只羔羊，幼羔超排所生產(chǎn)體外胚胎進(jìn)行胚胎移植的妊娠率15%，產(chǎn)羔率13%，其中3只健康狀況良好（圖1），1只為死羔。

圖1 遼寧絨山羊羔羊體外胚胎生產(chǎn)照片

4 結(jié)論與討論

4.1 供體母羔的年齡對體外成熟和體外受精效果的影響

供體羔羊個體差異對卵母細(xì)胞影響很大，尤其是其發(fā)育至囊胚的能力有很大差異。理想的供體羔羊在激素誘導(dǎo)處理時將產(chǎn)生大量的卵泡及有發(fā)育能力的卵母細(xì)胞。然而不同發(fā)育階段的羔羊激素處理后卵巢的反應(yīng)程度不一。Armstrong等［3］提出從幼齡羔羊收集卵母細(xì)胞，年齡在4～6周齡時較理想，這時處理卵泡數(shù)量多。Ptak等［4］認(rèn)為1月齡羔羊卵巢反應(yīng)最敏感，3月齡較弱，而2、5、7月齡時明顯與1月齡不同。Earl等［5］報道了從8～9周齡激素誘導(dǎo)與4月齡非誘導(dǎo)羔羊所獲卵母細(xì)胞體外發(fā)育率相似。O’Brien等［6］報道激素誘導(dǎo)3～6周齡羔羊獲得的的卵母細(xì)胞的體外發(fā)育能力要比16～24周齡羔羊高。Morton等［7］觀察到從16～24周齡未作激素誘導(dǎo)羔羊獲得的卵母細(xì)胞發(fā)育至囊胚期的比率與成年母羊相近，但3～6周齡羔羊激素誘導(dǎo)后獲得的卵母細(xì)胞的發(fā)育能力有所降低。這些研究比較了幼齡羔羊激素誘導(dǎo)與大齡對照羔羊所獲卵母細(xì)胞的發(fā)育能力，確定了羔羊年齡與激素誘導(dǎo)處理的結(jié)果相關(guān)?？傊?～8周齡羔羊是采集大量卵母細(xì)胞，獲得具有完善發(fā)育能力的卵母細(xì)胞的理想供體。然而，選擇供體羔羊目前還沒有特效方法。

4.2 不同受精體系對卵裂的影響

國外較多采用TALP液研究性成熟前山羊卵母細(xì)胞的體外受精，用添加了50μg/mL肝素的mDM液獲能，用添加1μg/mL亞牛磺酸的TALP液受精［8］。張鎖鏈等［9］采集種公羊新鮮精液，以0.5μM A-23187處理1min或在培養(yǎng)液中添加50μg/mL肝素獲能，用2mM咖啡因、20μg/mLBSA的BO液做受精液，2～4細(xì)胞胚的卵裂率分別為28.6%和41.9%。武建朝［10］的研究結(jié)果表明，TALP受精液（卵裂率42.11%）比BO更適合母羔體外受精及卵裂。本試驗結(jié)果顯示，SOF受精體系更適合絨山羊母羔卵母細(xì)胞體外受精。

4.3 不同胚胎體外發(fā)育體系對早期胚胎發(fā)育能力的影響

許多研究認(rèn)為，幼齡動物獲得的胚胎發(fā)育速度減緩是體外胚胎成活率低的原因。另外，低的成活率都伴隨著高比例的胚胎或胎兒損失以及干尸化情況的出現(xiàn)。Ptak等［11］報道，妊娠附植著床（40～60 d）及胎兒損失（80～100 d）使得628枚胚胎移植后僅有6%存活至妊娠期滿，8%的分裂胚生產(chǎn)出健康成活的后代［11］。

Kelly等［2］證實，初情期前羔羊作供體所采集的卵母細(xì)胞具有產(chǎn)生后代的能力。本研究幼羔超排所生產(chǎn)體外胚胎移植后成功產(chǎn)下4只羔羊，進(jìn)一步支持了上述研究結(jié)論，但移植產(chǎn)羔率僅15%，表明移植后的胚胎在發(fā)育過程中丟失率偏高［2］。幼羔生產(chǎn)體外胚胎進(jìn)行移植后的胚胎丟失率（80%）高于成年母羊（60%）［11］，其原因之一是幼羔體外生產(chǎn)的胚胎不能由母源基因組表達(dá)向胚胎基因組表達(dá)的順利過渡［3］。

在早期胚胎發(fā)育過程中，某些基因的激活會引起水中有害自由基含量上升，導(dǎo)致有絲分裂異常，從而使體外胚胎發(fā)育阻滯。EDTA作為一種抗氧化劑，可以清除胚胎代謝過程中所產(chǎn)生的有害自由基，有利于胚胎的體外發(fā)育。因此，在本研究中開展了在發(fā)育液中添加EDTA對幼羔早期胚胎體外發(fā)育影響的研究，結(jié)果表明，EDTA組受精卵48 h卵裂率（53.3%）顯著高于對照組（37.3%）（P＜0.05）；體外受精I(xiàn)VF后第5天發(fā)育至16細(xì)胞以上胚胎的百分率（78.1%）極顯著高于對照組（45.4%）（P＜0.01）。表明在早期胚胎發(fā)育液中添加10μmol/LEDTA有利于提高幼羔供體所生產(chǎn)體外胚胎的發(fā)育能力。

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Study on the in Vitro Em bryo Production of Liaoning Cashm ere Kids

GuoDan,Song Xianchen,Zhang Xinghui，etal
（Liaoning InstituteofAnimalHusbandry，Liaoyang111000，China）

In this study，4～8-week-old Liaoning cashmere female kidswere used to study the change of follicular quantity and quality，meanwhile theeffectsofdifferentbasison the in vitro fertilization and early cleavagewere compared，by theway，theeffect ofaddition of EDTA in themedium on early embryo developmentwas studied.The results showed that the oocytematuration rate and fertilization rate of 6～8-week-old kidswere significantly higher than those of 4～6-week-old kids；SOF solution was better than TALP for the in vitro fertilization and the cleavage rate reached 42.47%；the addition of EDTA at the concentration of 10 μmol/L could effectively improve thenumberof16-cellormoreembryos.

cashmere kid；superovulation；embryo；in vitro fertilization；transfer

S827.3

A

2095-3887（2015）04-0020-04

10.3969/j.issn.2095-3887.2015.04.006

2015-05-22

遼寧省自然科學(xué)基金項目（201202110）；遼寧省自然科學(xué)基金項目（2013020068）；遼寧省自然科學(xué)基金項目（2014020179）

郭丹（1981-），女，高級畜牧師，碩士。研究方向：絨山羊育種。