細(xì)胞外信號調(diào)節(jié)激酶1/2對糖尿病腦缺血再灌注大鼠海馬區(qū)Bax表達(dá)的調(diào)控作用

李建民周娜趙雅寧薛承景陳長香張盼李淑杏

(河北聯(lián)合大學(xué)康復(fù)醫(yī)學(xué)院神經(jīng)研究所，河北唐山063000)

摘要〔〕目的探討細(xì)胞外信號調(diào)節(jié)激酶1/2對糖尿病腦缺血再灌注大鼠海馬區(qū)Bax表達(dá)的調(diào)控。方法采用鏈脲佐菌素誘導(dǎo)聯(lián)合改良的Pulsineli 4血管阻斷(4-VO)法制作糖尿病全腦缺血再灌注模型，并應(yīng)用ERK1/2抑制劑U0126對糖尿病腦缺血再灌注大鼠預(yù)處理。分別在缺血1、6、24和48 h應(yīng)用光鏡觀察海馬區(qū)神經(jīng)細(xì)胞形態(tài)變化；免疫組織化學(xué)法檢測磷酸化ERK1/2和Bax表達(dá)水平。結(jié)果糖尿病腦缺血組各時間存活神經(jīng)元密度顯著低于血糖正常腦缺血組、磷酸化ERK1/2表達(dá)水平低于血糖正常腦缺血組、Bax表達(dá)水平高于血糖正常腦缺血組；應(yīng)用U0126處理后，各時間點海馬區(qū)神經(jīng)元細(xì)胞存活密度降低、磷酸化ERK1/2表達(dá)降低、Bax表達(dá)增高。結(jié)論ERK1/2活化通過介導(dǎo)Bax表達(dá)參與并介導(dǎo)了糖尿病加重全腦缺血再灌注后神經(jīng)細(xì)胞的丟失。

關(guān)鍵詞〔〕細(xì)胞外信號調(diào)節(jié)激酶1/2；糖尿病;腦缺血再灌注；Bax；海馬區(qū)

中圖分類號〔〕R743.31〔文獻(xiàn)標(biāo)識碼〕A〔

基金項目：河北省自然科學(xué)基金 (H2012401007)；河北省衛(wèi)生廳課題(20110527)

通訊作者：趙雅寧(1974-)，女，副教授，博士，主要從事神經(jīng)病學(xué)研究。

第一作者：李建民(1962-)，男，教授，博士，主要從事神經(jīng)病學(xué)研究。

研究表明高血糖能加重腦缺血所致的各種腦損傷，是腦缺血發(fā)病率和死亡率增高的重要的獨立危險因素〔1，2〕， 糖尿病患者腦卒中發(fā)病率明顯高于非糖尿病患者，且腦損害的嚴(yán)重程度、腦卒中死亡的可能性均增加，預(yù)后較差〔3〕。但糖尿病加重腦缺血損傷的機(jī)制尚未明確。細(xì)胞外信號調(diào)節(jié)激酶1/2 (ERK1/2)是有絲分裂原活化蛋白激酶(MAPKs)家族重要組成部分，活化后經(jīng)多級激酶的級聯(lián)反應(yīng)把細(xì)胞外刺激信號向細(xì)胞內(nèi)傳遞，至細(xì)胞核中，激活下游的激酶或多種轉(zhuǎn)錄因子從而介導(dǎo)細(xì)胞產(chǎn)生各種生物學(xué)反應(yīng)，在細(xì)胞增殖、分化及凋亡等的過程中具有至關(guān)重要的作用。目前ERK1/2在腦損傷疾病的作用尚存在爭議。本研究應(yīng)用糖尿病聯(lián)合腦缺血再灌注模型，觀察實驗大鼠海馬區(qū)磷酸化ERK1/2和Bax表達(dá)變化以及神經(jīng)細(xì)胞丟失情況，并應(yīng)用ERK1/2通路抑制劑U0126進(jìn)行處理，探討ERK1/2在糖尿病加重腦缺血再灌注神經(jīng)元損傷中的作用及對Bax的調(diào)控作用。

1材料和方法

1.1實驗動物及試劑本實驗共用健康雄性SD大鼠80只，由北京維通利華實驗動物中心提供；多克隆磷酸化ERK1/2和Bax免疫組化試劑盒購自中杉生物有限公司(北京)。

1.2動物分組和處理80只雄性SD大鼠〔SCXK(京)2005-0013〕，體質(zhì)量(185±19)g,隨機(jī)分為假手術(shù)組(SO)和血糖正常全腦缺血再灌注組(NI/R)和糖尿病全腦缺血再灌注組(DCI)和DCI +ERK1/2抑制劑U0126干預(yù)組；每組又隨機(jī)平均分為缺血再灌注1、6、24和48 h時間亞組。

1.3分別作如下處理SO組：分離暴露血管，但不電凝椎動脈、不夾閉頸總動脈；NI/R組：采用改良的Pulsineli 4血管阻斷(4-VO)法〔4〕制作大鼠全腦缺血模型：動物常規(guī)麻醉，頸正中切口，分離雙側(cè)頸總動脈，在其下置線備用。枕后部正中切開,暴露雙側(cè)第1頸椎橫突翼孔，直視下熱凝其下通過的椎動脈，電凝每次時間約2～4 s，使翼小孔后雙側(cè)椎動脈永久閉塞。術(shù)后大鼠縫皮回籠，24 h后以無創(chuàng)性微動脈夾夾閉雙側(cè)頸總動脈，缺血30 min后松開動脈夾，實行再灌注。缺血及再灌注期間用紅外線測溫儀監(jiān)測耳內(nèi)鼓膜溫度，并使之維持在(37±0.2)℃。DCI組：大鼠術(shù)前禁食12 h，按55 mg/kg腹腔注射鏈脲佐菌素(STZ)，72 h后空腹血糖超過16.7 mmol/L，有多尿、體質(zhì)量下降等表現(xiàn)的大鼠為糖尿病造模成功。然后按上述全腦缺血模型進(jìn)行手術(shù)，制作糖尿病+全腦缺血再灌注模型。DCI+ERK1/2抑制劑U0126干預(yù)組：預(yù)先將U0126用二甲基亞砜溶解，于動物在制作形成糖尿病模型后再完成腦缺血再灌注模型前30 min經(jīng)尾靜脈注射(0.01 mg/kg)。

1.4病理組織學(xué)檢測各組動物在規(guī)定時間點以戊巴比妥鈉麻醉(40 mg/kg),用40 g/L多聚甲醛經(jīng)左心室灌注固定后取腦,在視交叉后1～6 mm處冠狀面切開，取中間塊入4 %多聚甲醛固定液固定，石蠟包埋，切片(片厚5 μm)，進(jìn)行HE染色。在有測微尺的光學(xué)顯微鏡(200×)下觀察海馬區(qū)神經(jīng)元形態(tài)變化并計數(shù)(200×)倍視野下的神經(jīng)細(xì)胞數(shù)，即神經(jīng)元密度(ND)，取均值。

1.5磷酸化ERK1/2和Bax蛋白免疫組化切片常規(guī)脫蠟至水，枸櫞酸鹽微波修復(fù)，分別滴加磷酸化ERK1/2和Bax抗體(ERK1/2：1∶200；Bax：1∶150)， 濕盒中4℃過夜，IgG抗體-HRP多聚體(PV 二步法)，37℃溫箱 30 min，DAB 顯色，脫水、透明、封片。以 PBS代替一抗作陰性對照。鏡下觀察并攝片，陽性率的定量分析：每個標(biāo)本取4張切片，200倍光鏡下每張切片在海馬隨機(jī)選取4個視野，在有測微尺的光學(xué)顯微鏡(200×)下觀察海馬區(qū)陽性細(xì)胞變化并計數(shù)(200×)倍視野下的陽性細(xì)胞數(shù)量。

2結(jié)果

2.1形態(tài)學(xué)結(jié)果SO組海馬區(qū)神經(jīng)元排列緊密，神經(jīng)元胞體較大，胞核大而圓，核仁清晰，胞質(zhì)著色淺而均勻。NI/R 組海馬區(qū)細(xì)胞輪廓模糊，排列紊亂，胞體收縮呈多角形或不規(guī)則，部分胞質(zhì)自溶；各時間點存活神經(jīng)元密度均明顯減少(P<0.05)；DCI 組中海馬區(qū)神經(jīng)元結(jié)構(gòu)損傷加重，大部分胞質(zhì)自溶，各時間點神經(jīng)元細(xì)胞存活密度進(jìn)一步降低(P<0.05)；U0126組神經(jīng)細(xì)胞結(jié)構(gòu)損傷明顯，存活神經(jīng)細(xì)胞數(shù)量較DCI明顯減少(P<0.05)。表1。

2.2磷酸化ERK1/2和Bax免疫組化結(jié)果磷酸化ERK1/2陽性表達(dá)主要位于細(xì)胞核，少量位于細(xì)胞質(zhì)，陽性細(xì)胞的胞核或胞質(zhì)內(nèi)可見細(xì)小的棕黃色顆粒(圖1)。SO組可見少量磷酸化ERK1/2陽性細(xì)胞，染色淺淡。與SO組比較，NI/R 組1 h和6 h時間點磷酸化ERK1/2陽性細(xì)胞增多，24 h和48 h迅速下降但顯著高于SO(P<0.05)；與NI/R組比較，DCI組各時間點磷酸化ERK1/2陽性細(xì)胞減少(P<0.05)；U0126組各時間點磷酸化ERK1/2陽性細(xì)胞較DCI明顯減少(P<0.05)。Bax：Bax陽性表達(dá)主要位于細(xì)胞質(zhì)，陽性細(xì)胞的胞質(zhì)可見細(xì)小的棕黃色顆粒(圖2)。SO組偶見Bax陽性細(xì)胞，染色淺淡。與SO組比較，NI/R 組各時間點Bax陽性細(xì)胞均增多(P<0.05)；與NI/R組比較，DCI組中1 h、6 h和24 h Bax陽性細(xì)胞增多，48 h下降但仍高于NI/R 組(P<0.05)；U0126組Bax陽性細(xì)胞較DCI組明顯減少(P<0.05)，見表2。

組別1h6h24h48hSO組33.60±2.5131.80±1.4834.80±2.9532.20±3.77NI/R組30.22±2.281)26.00±1.231)24.80±2.171)18.20±1.481)DCI組26.90±2.301)2)20.26±2.001)2)18.78±2.061)2)16.60±1.701)2)U0126組24.12±2.101)2)3)18.60±1.141)2)3)16.80±1.201)2)3)14.10±1.081)2)3)

與SO組同一時間點比較：1)P<0.05；與NI/R組同一時間比較：2)P<0.05；與DCI組同一時間點比較：3)P<0.05,下表同

SO組　　　　NI/R組　　　　DCI組　　　　U0126組 圖1　各組24 h海馬區(qū)磷酸化ERK1/2陽性 細(xì)胞變化免疫組織化學(xué)法(×200)

SO組　　　　NI/R組　　　　DCI組　　　　U0126組 圖2　各組24 h海馬區(qū)Bax陽性細(xì)胞 變化免疫組織化學(xué)法(× 200)

組別ERK1/21h6h24h48hBax1h6h24h48hSO組2.25±0.702.32±0.682.40±0.752.46±0.720.85±0.150.80±0.100.75±0.100.80±0.15NI/R組16.10±1.181)34.16±2.941)24.36±2.261)20.60±1.671)2.40±1.341)7.60±1.951)18.20±1.481)23.60±2.881)DCI組13.20±1.451)2)27.40±2.521)2)19.80±1.301)2)16.40±1.121)2)8.12±1.681)2)17.00±2.121)2)30.60±2.851)2)25.60±1.781)2)U0126組11.12±1.181)2)3)20.20±2.501)2)3)12.86±1.261)2)3)11.58±1.001)2)3)9.24±1.701)2)23.20±2.491)2)3)32.20±3.101)2)3)18.20±1.121)2)3)

3討論

MAPKs信號通路是連接大多數(shù)細(xì)胞外信號與膜受體、轉(zhuǎn)錄因子和各基因調(diào)節(jié)的中央信號通路，其家族成員包括細(xì)胞外信號調(diào)節(jié)激酶(ERK1/2)、C-Jun氨基末端激酶(JNK)和p38 MAPK等。目前在多種中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病中均證實存在 ERK1/2活性改變，但ERK1/2活化在腦損傷的作用尚存在一定爭議〔5，6〕。馬軼等〔7〕應(yīng)用雙血管阻塞聯(lián)合放血法建立糖尿病大鼠全腦缺血模型，發(fā)現(xiàn)在糖尿病大鼠腦缺血1 h和3 h磷酸化ERK1/2顯著高于正常血糖腦缺血組，表明ERK1/2活性增高介導(dǎo)了糖尿病加重的腦缺血再灌注神經(jīng)元的損傷。本研究結(jié)果提示糖尿病加重缺血神經(jīng)細(xì)胞損傷與ERK1/2活性下降有關(guān)，進(jìn)一步應(yīng)用抑制劑U0126阻斷糖尿病大鼠腦缺血后ERK1/2通路活化，海馬區(qū)存活神經(jīng)元數(shù)量降低明顯，視野內(nèi)幾乎大多是壞死的神經(jīng)細(xì)胞，更有力的說明糖尿病腦缺血再灌注后ERK1/2的活化對神經(jīng)細(xì)胞具有保護(hù)作用。研究顯示〔8〕激活的ERK1/2可轉(zhuǎn)錄上調(diào)腦缺血缺氧模型中抗氧化系統(tǒng)的保護(hù)因子而促進(jìn)神經(jīng)元的存活；有學(xué)者認(rèn)為活化的 Ras/ERK1/2級聯(lián)是神經(jīng)元耐受腦缺血應(yīng)激反應(yīng)的核心〔9〕。筆者認(rèn)為糖尿病合并腦缺血情況下，ERK1/2活性下降，使神經(jīng)細(xì)胞耐受缺血缺氧能力下降，細(xì)胞死亡嚴(yán)重，是糖尿病鼠腦缺血后神經(jīng)損傷加重的原因之一。

正常情況下，Bax蛋白含量極低，且Bax蛋白以非活性形式分布于細(xì)胞質(zhì)或細(xì)胞骨架上，當(dāng)受到凋亡刺激因素作用后構(gòu)象發(fā)生改變，轉(zhuǎn)位至線粒體外膜，促進(jìn)膜上電壓依賴離子通道開放、觸發(fā)凋亡蛋白釋放執(zhí)行凋亡程序。實驗表明在糖尿病腦病以及糖尿病腦缺血再灌注損傷中Bax表達(dá)增多，且表達(dá)在瀕死的神經(jīng)元上。抑制或降低糖尿病鼠腦內(nèi)Bax表達(dá)，可顯著減輕由于高血糖加重的腦缺血神經(jīng)細(xì)胞的損傷〔10，11〕。本研究中DCI組Bax表達(dá)增多，采用ERK1/2通路抑制劑預(yù)處理DCI再灌注動物，發(fā)現(xiàn)阻斷ERK1/2通路時Bax表達(dá)進(jìn)一步升高，提示糖尿病加重腦缺血再灌注神經(jīng)損傷過程中，ERK1/2活化可調(diào)控Bax表達(dá)，ERK1/2活性降低介導(dǎo)了Bax表達(dá)增加，而導(dǎo)致神經(jīng)細(xì)胞丟失嚴(yán)重。目前雖然尚無有關(guān)ERK1/2磷酸化直接調(diào)控Bax表達(dá)的相關(guān)報道，但研究顯示ERK1/2磷酸化可介導(dǎo)激活轉(zhuǎn)錄因子cAMP反應(yīng)元件結(jié)合蛋白(CREB)以及CREB介導(dǎo)的bcl-2家族抗凋亡成員bcl-2表達(dá)增加〔9，12〕。

總之，本研究發(fā)現(xiàn)糖尿病加重了全腦缺血再灌注后神經(jīng)細(xì)胞損傷，此過程中ERK1/2活性降低調(diào)控Bax表達(dá)增強(qiáng)，而導(dǎo)致神經(jīng)細(xì)胞丟失嚴(yán)重。

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〔2013-12-09修回〕

(編輯趙慧玲/曹夢園)