李天然，蔡立杰，趙紹宏，魏正茂，霍天龍，盧光明，宋 斌

1.福建醫(yī)科大學(xué)?？偱R床醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院放射科，福建莆田351100;2.解放軍總醫(yī)院第一附屬醫(yī)院放射科;3.北京大學(xué)人民醫(yī)院放射科;4.南京總醫(yī)院放射科

自體干細胞移植對于治療包括腫瘤在內(nèi)的多種疾病具有潛在的應(yīng)用前景［1］。然而，干細胞具有很多不確定性，是否對腫瘤具有長期有效的持續(xù)作用，以及移植干細胞的安全性仍需研究。通過現(xiàn)代基因工程技術(shù)對干細胞進行改造，使其具有特定的功能表達，又保持干細胞的基本特性，實現(xiàn)對腫瘤的干預(yù)效能的提升是值得探索的研究內(nèi)容。已經(jīng)證明，骨橋蛋白(osteopontin，OPN)在病理狀態(tài)下，全身各個器官均有表達。在肝壞死動物模型中壞死區(qū)和感染區(qū)域的Kupffer 細胞、巨噬細胞和衛(wèi)星細胞中有表達，OPN 有助于巨噬細胞向病灶區(qū)域遷移［2］，血漿中OPN 表達水平與慢性肝病有密切的關(guān)系［3］。OPN 在各種癌癥中均有表達，包括肝細胞癌(hepatocellular carcinoma，HCC)，在腫瘤的生長、侵襲、轉(zhuǎn)移、血管化和阻止腫瘤細胞凋亡中有重要作用［4-5］，OPN 中含有精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸(Arg-Gly-Asp，RGD)序列，RGD 可與整合素αv、β3受體結(jié)合，促進腫瘤的轉(zhuǎn)移?；贠PN 生物學(xué)特性，本研究設(shè)計利用基因工程技術(shù)將OPN 基因轉(zhuǎn)染骨髓間充質(zhì)干細胞(bone marrow mesenchymal stem cells，BMSCs)，使BMSCs 表達OPN 上調(diào)，觀察基因轉(zhuǎn)染后BMSCs 對具有高轉(zhuǎn)移潛能肝癌細胞(MHCC97-H)的影響。

1 材料與方法

1.1 細胞株 BMSCs 購自賽業(yè)(廣州)生物科技有限公司，人MHCC97-H 購自上海復(fù)旦大學(xué)肝癌研究所。Transwell 小室(Millipore)。

1.2 OPN 基因轉(zhuǎn)染BMSCs 方法

1.2.1 OPN 表達質(zhì)粒構(gòu)建:構(gòu)建以人OPN 為靶向基因的mRNA 表達質(zhì)粒，pLV. EX3d. P/neo-EF1A ＞OPN＞IRES/eGFP，以綠色熒光蛋白(green fluorescence protein，GFP)為報告基因。

1.2.2 病毒包裝和OPN 基因轉(zhuǎn)染方法:取293FT 細胞，10 cm 的培養(yǎng)皿按5 ×106個細胞數(shù)接種，培養(yǎng)箱中過夜;更換培養(yǎng)液。將DNA-Lipofectamine 2000 復(fù)合物添加到293FT 細胞中，每天更換培養(yǎng)液，轉(zhuǎn)染培養(yǎng)72 h，去除培養(yǎng)液，熒光顯微鏡下觀察轉(zhuǎn)染效果;若細胞轉(zhuǎn)染率達到要求，擴增細胞送檢PCR 檢測?；蛐揎椙昂驜MSCs 免疫組織化學(xué)染色熒光檢測。另取細胞，用PBS 洗滌細胞，甲醛固定，結(jié)晶紫染色液，去除染色液，PBS 洗滌細胞，計數(shù)被染成藍色的克隆數(shù)目，計算病毒滴度。

1.3 MHCC97-H 與BMSCs/OPN 轉(zhuǎn)染細胞的共培養(yǎng)實驗

1.3.1 MHCC97-H 細胞侵襲能力檢測:Transwell 侵襲小室技術(shù)是利用Matrigel 模擬天然基底膜結(jié)構(gòu)，觀察具有侵襲和遷移能力的細胞在趨化劑誘導(dǎo)下穿過多孔濾膜的情況。取BD 基質(zhì)膠，用完全培養(yǎng)基稀釋，按8.68 μg/cm2的濃度鋪至Transwell 6 孔板的上室，37 ℃孵育2 h，吸去BD 基質(zhì)膠。復(fù)蘇肝癌細胞MHCC97-H 培養(yǎng)，常規(guī)培養(yǎng)48 h，換液，備用。BMSCs 或BMSCs/OPN 培養(yǎng)至第3 代，備用。實驗組共分兩組(BMSC s 組和OPN 基因轉(zhuǎn)染BMSCs 組)，將培養(yǎng)BMSCs 或BMSCs/OPN按1 ×106濃度接種于Transwell 共培養(yǎng)系統(tǒng)下室，再將Transwell 的上室置于孔中，在上室內(nèi)接種MHCC97-H 細胞，使上下室的培養(yǎng)液相互融通，建立起B(yǎng)MSCs 或BMSCs/OPN 與MHCC97-H 細胞的共培養(yǎng)體系。對照組MHCC97-H 按1 ×106濃度接種于Transwell 共培養(yǎng)系統(tǒng)的上室，Transwell 下室加入單純DMEM 培養(yǎng)基為對照。實驗組與對照組實驗細胞培養(yǎng)48 h，分別取出共培養(yǎng)上室，吸去上室的培養(yǎng)基，并用PBS 洗2 次;用預(yù)冷的多聚甲醛固定上室的細胞，室溫固定30 min，吉姆薩染色30 min 后，用純凈水漂洗干凈，計數(shù)上室遷移至Matrigel 膜下的細胞數(shù)，顯微鏡下隨機選取5 個視野進行拍攝(200 ×)，計數(shù)每個視野的平均細胞數(shù)量，細胞計數(shù)作為MHCC97-H細胞侵襲能力檢測的指標。

1.3.2 MHCC97-H 增殖能力檢測:采用Cell Counting kit-8 法(CCK-8)檢測MHCC97-H 細胞增殖能力，實驗分組同1.3.1。待下室細胞(BMSCs 或BMSCs/OPN)均貼壁后，96 孔板上室每孔2 ×103的細胞量進行接種MHCC97-H 細胞，共培養(yǎng)48 h 后，取出上室板，每孔加入8 μl 的CCK-8 溶液，37 ℃孵育4 h，孵育完畢后，進行吸光度值(optical density，OD)490 nm 讀數(shù)。

1.4 實時定量基因擴增熒光檢測系統(tǒng)qPCR 檢測MHCC97-H 實驗 實驗分組同1.3.1。待下室細胞(BMSCs 或BMSCs/OPN)貼壁后，上室12 孔板每孔3 ×104的細胞量進行接種MHCC97-H 細胞，共培養(yǎng)48 h后，取上室MHCC97-H 細胞送檢qPCR。

1.4.1 引物序列:引物設(shè)計序列由賽業(yè)(廣州)生物科技公司合成。檢測MHCC97-H 細胞與BMSCs 共培養(yǎng)前后轉(zhuǎn)移相關(guān)的生物因子OPN、αv、β3及基質(zhì)蛋白酶原2(matrix metalloproteinase-2，MMP-2)表達情況，以人肌動蛋白GAPDH 作為內(nèi)參照物(見表1)。

表1 生物因子引物序列設(shè)計(F-正向引物，R-反向引物)Tab 1 Biological factors primer sequence design (F-Forward primer，R-Reverse primer)

1.4.2 qPCR 實驗方法:(1)MHCC97-H 細胞的RNA提取，細胞裂解，加入200 μl 氯仿，14 000 × g 離心15 min;吸取400 μl 上層水相，加入500 μl 的異丙醇，14 000 ×g 離心10 min，去廢液，加入1 ml 無水乙醇洗滌RNA 沉淀;12 000 × g 離心5 min，去廢液;加入20 μl DEPC 水溶解RNA 沉淀。(2)合成cDNA:在去除了DNA 污染的RNA 樣品中加入oligo (dT)18primer 1 μl，70 ℃孵育5 min;按照順序加入:5 × reaction buffer 4 μl;10 mmol/L dNTP mix 2 μl;RiboLockTMRNase Inhibitor (20 u/μl)1 μl。37 ℃孵育溫浴5 min;加入 RevertAidTMM-MuLV Reverse Transcriptase(200 u/μl)1 μl;42 ℃孵育60 min，70 ℃孵育10 min。(3)特異性引物聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)擴增相應(yīng)的cDNA。PCR 條件:預(yù)變性95 ℃，5 min;變性94 ℃，30 s，退火58 ℃，30 s，延伸72 ℃，30 s，共40 個循環(huán)，最后72 ℃，10 min。PCR 產(chǎn)物電泳并經(jīng)凝膠電泳處理系統(tǒng)掃描半定量分析。

1.5 統(tǒng)計學(xué)處理 采用SPSS 16.0 統(tǒng)計軟件進行處理，組間比較采用F 檢驗，兩組間比較采用獨立樣本t檢驗，P ＜0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 OPN 基因轉(zhuǎn)染BMSCs 實驗結(jié)果 熒光顯微鏡結(jié)果顯示，OPN 基因轉(zhuǎn)染BMSCs 成功，細胞形態(tài)與未經(jīng)轉(zhuǎn)染的BMSCs 細胞形態(tài)學(xué)上無差別。qPCR 法檢測OPN 基因轉(zhuǎn)染BMSCs 前后OPN 基因表達，以正常BMSCs 為對照組，OPN 基因轉(zhuǎn)染BMSCs 后，OPN 表達明顯高于對照組(2. 79 ±0. 96 vs 0.72 ±0. 50，P ＜0.05)，表明基因轉(zhuǎn)染成功(見圖1)。

2.2 OPN 轉(zhuǎn)染BMSCs 對MHCC97-H 增殖的影響以MHCC97-H 細胞作為對照組，OD 值檢測結(jié)果顯示，MHCC97-H 與BMSCs 細胞共培養(yǎng)后，MHCC97-H增殖能力增強，與對照組比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(0.57 ±0.21 vs 0.34 ±0.16，P ＜0.05);OPN 基因轉(zhuǎn)染的BMSCs 細胞對MHCC97-H 細胞增殖無明顯作用，與對照組比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(0. 41 ±0. 11 vs 0.34 ±0.16，P ＞0.05)。

圖1 OPN 基因轉(zhuǎn)染的BMSCs 細胞形態(tài)學(xué) A:熒光顯微鏡示細胞發(fā)出綠色熒光，GFP 是基因轉(zhuǎn)染載體的報告基因(200 ×);B:細胞排列規(guī)則，細胞形態(tài)呈長形、梭形(100 ×)Fig 1 Cells morphology of OPN gene transfected BMSCs A:BMSCs cells showed green fluorescence under fluorescence microscope，and GFP as a reporter gene (200 ×);B:cells arranged regularly，and BMSCs cells tended to be long and spindle shape(100 ×)

2.3 OPN 轉(zhuǎn)染BMSCs 對MHCC97-H 侵襲能力的影響 以MHCC97-H 細胞作為對照組，結(jié)果顯示，MHCC97-H 與BMSCs 細胞共培養(yǎng)后，侵襲能力變化不明顯，細胞侵襲數(shù)量與對照組比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(61.2 ±4.56 vs 67.4 ±8.24，P ＞0.05);OPN 基因轉(zhuǎn)染的BMSCs 細胞對MHCC97-H 細胞侵襲具有明顯的促進作用，與MHCC97-H 和BMSCs 共培養(yǎng)組比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(92.4 ±10.4 vs 61.2 ±4.56，P ＜0.05)。

2.4 MHCC97-H 細胞與BMSCs 共培養(yǎng)后轉(zhuǎn)移相關(guān)因子的表達 以MHCC97-H 作為對照組，與對照組比較，MHCC97-H 與BMSCs 共培養(yǎng)后，MHCC97-H 細胞OPN、αv、β3表達變化不明顯，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P ＞0.05)，而MMP-2 表達差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P ＜0.05)。MHCC97-H 與經(jīng)DPN 轉(zhuǎn)染的BMSCs 細胞共培養(yǎng)后，MHCC97-H 細胞OPN 表達明顯降低，而αv、β3、MMP-2表達明顯升高，與對照組比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P ＜0.01，見表2)。

表2 MHCC-97 細胞與轉(zhuǎn)基因轉(zhuǎn)染前后BMSCs 共培養(yǎng)相關(guān)生物因子表達比較Tab 2 Comparison of biological factors expressions of MHCC97-H co-culture with BMSCs before and after transfected OPN gene

3 討論

原發(fā)性肝癌侵襲和轉(zhuǎn)移是影響肝癌預(yù)后的兩大因素。近年來生物治療成為肝癌治療的新技術(shù)，然而基于干細胞技術(shù)的生物治療目前尚未取得一致的意見［6］。本研究主要是利用基因工程技術(shù)對BMSCs 進行修飾，觀察經(jīng)基因修飾的BMSCs 對肝癌細胞轉(zhuǎn)移潛能的影響情況，為干細胞的生物治療進行探索性基礎(chǔ)研究。

OPN 是與轉(zhuǎn)移相關(guān)的生物因子，通過與整合素αv、β3相結(jié)合而促進腫瘤的轉(zhuǎn)移［7］?；贐MSCs 是基因良好載體這一特性，通過基因修飾技術(shù)OPN 轉(zhuǎn)染BMSCs，使之過表達OPN，觀察經(jīng)基因修飾的BMSCs對MHCC97-H 的影響。研究中采用Gateway 克隆技術(shù)設(shè)計構(gòu)建質(zhì)粒作為載體，eGFP 作為報告基因，轉(zhuǎn)染BMSCs 細胞，通過直接觀察目的細胞中eGFP 的表達確定目的基因表達情況。結(jié)果顯示OPN 轉(zhuǎn)染BMSCs成功，PCR 檢測證明OPN 在轉(zhuǎn)基因BMSCs 中高表達。

本研究結(jié)果表明，BMSCs 具有促進MHCC97-H 細胞增殖的作用，而經(jīng)OPN 基因修飾的BMSCs 細胞對MHCC97-H 細胞無明顯作用，提示BMSCs 具有促進肝癌細胞增殖的作用，該結(jié)果與上海復(fù)旦大學(xué)研究結(jié)果相一致［8］。Fierro 等［9］認為BMSCs 對腫瘤細胞的作用可能是通過旁分泌機制而實現(xiàn)的，BMSCs 分泌堿性成纖維細胞生長因子(bFGF)、血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)等而起到促進腫瘤增殖的目的。BMSCs 自身缺乏特異性，具有多樣分化潛能和分泌功能，它在一定情況下可分化成各種基質(zhì)細胞，形成腫瘤細胞生長的微環(huán)境，有利于腫瘤的生長。Djouad 等［10］認為這是因為BMSCs 存在免疫抑制，促進了腫瘤細胞生長。本課題組前期研究結(jié)果也顯示，BMSCs 具有促進肝癌細胞TGFβ1 表達而起到促進細胞增殖的作用［11］。

MHCC97-H 侵襲實驗結(jié)果顯示，MHCC97-H 與經(jīng)OPN 基因修飾BMSCs 細胞共培養(yǎng)后，侵襲能力明顯增強，PCR 結(jié)果顯示外源性O(shè)PN 抑制MHCC97-H 細胞釋放內(nèi)源性O(shè)PN 因子。OPN 是一種分泌型細胞外基質(zhì)蛋白，其分子中含有RGD (Arg-Gly-Asp)三肽序列，RGD 可通過與細胞膜表面受體αv、β3整合素結(jié)合產(chǎn)生促進轉(zhuǎn)移的作用［12］。BMSCs 產(chǎn)生的外源性O(shè)PN 與MHCC97-H 細胞膜表面的αv、β3整合素受體結(jié)合，競爭性地抑制肝癌細胞內(nèi)源性O(shè)PN 的釋放，肝癌細胞αv、β3表達增高也佐證了競爭性結(jié)合的存在。實驗表明，外源性O(shè)PN 可以促進肝癌細胞的侵襲，可能的機制與3 個方面因素有關(guān):(1)增加瘤細胞與胞外基質(zhì)相互作用;(2)幫助腫瘤細胞逃避宿主免疫系統(tǒng)的監(jiān)控，易化侵襲和轉(zhuǎn)移過程;(3)OPN 與整合素αv、β3結(jié)合促進組織芽狀結(jié)構(gòu)的形成，在腫瘤細胞中可誘導(dǎo)表達VEGF，對促進腫瘤血管生成方面有重要作用，可促進血管形成從而在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展、侵襲及轉(zhuǎn)移中發(fā)揮重要作用［13-14］。也有研究認為OPN 誘導(dǎo)整合素的表達變化而起到促進和抑制腫瘤轉(zhuǎn)移的作用［15］。本研究也證實經(jīng)基因轉(zhuǎn)染的BMSCs 細胞與MHCC97-H共培養(yǎng)后，MHCC97-H 細胞的MMP-2 表達明顯增加。有研究認為OPN 通過IκB/IKK 信號激活加快腫瘤細胞周圍型膠原等細胞外基質(zhì)降解，同時激活MMP-2酶原，促進腫瘤轉(zhuǎn)移［16］。因此，有理由相信外源性O(shè)PN 表達增加，通過激活I(lǐng)κB/IKK 和增加MMP-2 表達，MMP-2 對促進ECM 降解而發(fā)生腫瘤細胞的侵襲、轉(zhuǎn)移。

綜上，BMSCs 具有促進MHCC97-H 細胞增殖的作用，OPN 基因轉(zhuǎn)染的BMSCs 細胞具有促進MHCC97-H細胞侵襲的作用。外源性O(shè)PN 抑制內(nèi)源性O(shè)PN 表達，外源性O(shè)PN 可能通過激活MMP-2 活性而促進腫瘤侵襲的作用。

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