張 毅，臧國慶，王潔玲，湯正好，江 紅，奚 敏，余永勝

上海交通大學附屬第六人民醫(yī)院感染病科，上海200233

乙型肝炎病毒(hepatitis B virus，HBV)感染是一個嚴重的公共衛(wèi)生問題。據統(tǒng)計，全球每年約有100萬人死于HBV 感染所致的肝硬化、肝衰竭和原發(fā)性肝癌［1］。我國現有慢性HBV 感染患者約9 300 萬人，其中慢性乙型肝炎(chronic hepatitis B，CHB)患者約2 000萬人［2］。研究發(fā)現CHB 患者體內Th 細胞分化出現偏移，存在Th1、Th2 細胞及其分泌的細胞因子比例失衡［3］。Th1 型免疫應答低下使機體不能產生足量的細胞毒性T 淋巴細胞(cytotoxic T lymphocytes，CTL)和Th1 型細胞因子以殺傷、破壞HBV 感染的靶細胞，HBV 復制不能得到抑制;而Th2 型細胞因子又可抑制Th1 細胞的免疫應答，使機體不能及時清除HBV，最終導致HBV 慢性持續(xù)感染［3］。Th1/Th2 失衡是CHB 發(fā)生、發(fā)展和不同轉歸的重要原因［4-6］。Runx3(runtrelated transcription factor 3)是一種腫瘤抑制基因，在機體正常生長、發(fā)育和腫瘤發(fā)生、發(fā)展過程中起著重要作用［7-8］。研究發(fā)現Runx3 是CD4+T 細胞分化過程中重要的轉錄因子，可以調節(jié)Th 細胞的分化，從而影響Th1/Th2 的平衡［9-11］。但目前尚無Runx3 與乙型肝炎的相關研究。本文旨在探討乙型肝炎患者外周血CD4+T 細胞Runx3 的表達及意義。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取2011 年6 月-2012 年12 月上海交通大學附屬第六人民醫(yī)院感染病科診治的CHB患者37 例(CHB 組)，男23 例，女14 例，年齡21 ～58歲，平均年齡(38.1 ±16.5)歲，診斷符合2010 年《慢性乙型肝炎防治指南》［12］，其中輕度20 例、中度11例、重度6 例。急性乙型肝炎(acute hepatitis B，AHB)患者11 例(AHB 組)，男7 例，女4 例，年齡20 ～55歲，平均年齡(36.9 ±15.7)歲，診斷符合2000 年《病毒性肝炎防治方案》［13］。所有患者均排除其他肝炎病毒、人免疫缺陷病毒、EB 病毒、巨細胞病毒等病原體感染，排除自身免疫性疾病、腫瘤等疾病。所有患者就診前6 個月內均未使用過干擾素、核苷(酸)類似物等抗病毒藥物和(或)胸腺肽等免疫調節(jié)藥物。健康對照者19 名(健康對照組)，男12 名，女7 名，年齡23 ～56歲，平均年齡(37.8 ±14.6)歲，排除各系統(tǒng)疾病，6 個月內未使用過免疫調節(jié)藥物。CHB 組、AHB 組、健康對照組之間性別、年齡相比，差異無統(tǒng)計學意義(P ＞0.05)，具有可比性。

1.2 方法

1.2.1 主要試劑:RosetteSep 富集人CD4+T 細胞抗體(StemCell 公司)，人淋巴細胞分離液(StemCell 公司)，總RNA 提取試劑盒(Invitrogen 公司)，反轉錄試劑盒(Promega 公司)，熒光定量PCR 試劑盒(Takara 公司)。

1.2.2 外周血CD4+T 細胞分離:無菌條件下采集CHB 患者、AHB 患者和健康對照者肘靜脈血各10 ml置于肝素抗凝管中;加入500 μl RosetteSep 富集人CD4+T 細胞抗體混合物，充分混勻，室溫孵育20 min;用等體積含2% FBS 的PBS 稀釋血液并緩慢混勻;將稀釋血液按稀釋血液:淋巴細胞分離液=2∶1 的比例在10 ml 淋巴細胞分離液的上面緩慢加入稀釋的血液樣品，室溫1 200 r/min 離心20 min;收集位于淋巴細胞分離液與血漿界面之間的灰色細胞層;加入5 倍體積含2%的PBS 混勻，1 200 r/min 離心10 min，棄上清，再重復洗滌富集細胞1 次，分離得到CD4+T 細胞;流式細胞儀檢測CD4+T 細胞純度達90%以上，-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3 引物設計與合成:根據NCBI GenBank 公布的人Runx3 基因編碼區(qū)序列，應用Primer Premier 5.0 軟件設計引物，以GAPDH 基因為內參照。引物由上海生工生物工程技術服務有限公司合成。引物序列如下:Runx3 上游引物5＇-ACTGTGATGGCAGGCAATG-3＇;Runx3 下 游 引 物5＇-GTGATGGTCAGGGTGAAACTC-3＇;GAPDH 上游引物5＇-GCACCGTCAAGGCTGAGAAC-3＇;GAPDH 下游引物5＇-GCCTTCTCCATGGTGGTGAA-3＇。

1.2. 4 總RNA 提取與反轉錄合成cDNA:按照Invitrogen 公司的總RNA 提取試劑盒說明書進行操作提取總RNA;按照Promega 公司的反轉錄試劑盒說明書進行操作反轉錄合成cDNA，反應條件(20 μl 反應體系):42 ℃孵育60 min，70 ℃滅活10 min。 -80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.5 實時定量PCR 檢測Runx3 mRNA 表達水平:在ABI 7500 PCR 儀上進行實時定量PCR 檢測，按照Takara 公司的熒光定量PCR 試劑盒說明書進行操作，每份cDNA 做3 個重復管。PCR 反應體系:SYBR Premix Ex Taq 12.5 μl，上下游引物各0.5 μl，cDNA 模板1. 0 μl，ddH2O 10. 5 μl。PCR 反應條件:預變性95 ℃5 min，變性95 ℃15 s，退火60 ℃1 min，共40個循環(huán)。PCR 循環(huán)結束后對擴增曲線進行分析，3 個重復管取平均Ct 值計算，并對所擴增的PCR 產物熔解曲線進行分析。應用2-△△Ct法計算Runx3 mRNA的相對表達水平。

1.3 統(tǒng)計學處理 采用SPSS 16.0 統(tǒng)計軟件進行分析，計量資料用±s 表示，組間比較采用LSD-t 檢驗，P ＜0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 各組外周血CD4+T 細胞Runx3 mRNA 表達水平 CHB 組Runx3 mRNA 的表達水平明顯低于AHB組和健康對照組(P ＜0.01)，AHB 組Runx3 mRNA 的表達水平明顯高于健康對照組(P ＜0.05，見表1)。

表1 各組外周血CD4 +T 細胞Runx3 mRNA 表達水平(±s)Tab 1 Runx3 mRNA expression in peripheral CD4 +T cells of each group (±s)

表1 各組外周血CD4 +T 細胞Runx3 mRNA 表達水平(±s)Tab 1 Runx3 mRNA expression in peripheral CD4 +T cells of each group (±s)

注:與健康對照組比較，▲P ＜0.01，●P ＜0.05;與AHB 組比較，* P ＜0.01。

組別 例數Runx3 mRNA CHB 組 37 0.48 ±0.09▲＊AHB 組 11 0.87 ±0.12 ●健康對照組19 0.79 ±0.17

2.2 CHB 患者輕、中、重度組外周血CD4+T 細胞Runx3 mRNA 表達水平 CHB 重度組Runx3 mRNA的表達水平明顯高于CHB 輕度組(P ＜0.05);CHB 輕度組與CHB 中度組、CHB 中度組與CHB 重度組Runx3 mRNA 的表達水平相比，差異無統(tǒng)計學意義(P ＞0.05，見表2)。

表2 CHB 患者外周血Runx3 mRNA 表達水平(±s)Tab 2 Runx3 mRNA expression in CHB patients (±s)

表2 CHB 患者外周血Runx3 mRNA 表達水平(±s)Tab 2 Runx3 mRNA expression in CHB patients (±s)

注:與輕度組比較，* P ＜0.05。

組別 例數Runx3 mRNA輕度組20 0.39 ±0.18中度組 11 0.55 ±0.23重度組 6 0.65 ±0.27*

3 討論

乙型肝炎自然感染率高，80% ～90% 的兒童和5% ～10%的成年人感染HBV 后會轉變?yōu)槁訦BV攜帶者，成為慢性肝炎、肝硬化和肝細胞癌發(fā)病的高危人群［14-15］。CHB 發(fā)病機制非常復雜，目前尚未完全闡明。

在HBV 特異性抗原的刺激下，初始CD4+T 細胞在不同細胞因子的作用下分化為Th1、Th2 等細胞亞群。Th1、Th2 細胞的分化狀態(tài)及其相互之間的平衡在機體抗HBV 的免疫應答中起著重要作用［4-6］。Kasahara 等［16］研究發(fā)現Th1 細胞依靠其分泌的多種細胞因子發(fā)揮直接抗HBV 或間接免疫調節(jié)作用，同時其分泌的細胞因子是機體產生HBV 特異性CTL 的必要條件。Penna 等［17］研究發(fā)現Th1 型細胞因子可造成肝細胞的損傷，但其在AHB 的恢復過程中發(fā)揮了重要作用。Maruyama 等［18］研究發(fā)現Th2 細胞及其細胞因子與HBV 持續(xù)感染有關。當Th1 細胞亞群占優(yōu)勢時，將促進細胞免疫反應，增強CD8+T 細胞的活性，從而清除肝細胞內的病毒，但同時增加了肝臟的炎癥反應而加重肝細胞的損傷;當Th2 細胞亞群占優(yōu)勢時，將促進體液免疫反應，并抑制細胞免疫反應，CTL 活性減弱，肝細胞損傷減輕［19］。

Runx3 基因于1994 年由Levanon 等［7，20］研究發(fā)現，曾先后被命名為AML2、PEBP2αC 和CBFA3。人Runx3 基因位于染色體1p36.1，基因全長約67 kb，含有2 個啟動子、6 個外顯子和1 290 bp 的開放閱讀框［20-21］。Runx3 是調節(jié)Th 細胞分化重要的轉錄因子，其可以通過增強T-bet(T-box expressed in T cells)或減弱GATA3(GATA binding protein 3)的轉錄活性，促使CD4+T 細胞向Th1 細胞分化［9-11］。Djuretic 等［10］研究發(fā)現Runx3 在Th1 細胞中以T-bet 依賴的方式被誘導，Th1 細胞中IFN-γ 的大量產生和IL4 基因的沉默需要T-bet 和Runx3 的共同作用;在Runx3 缺失的Th2細胞中，T-bet 不能抑制IL4，但T-bet 和Runx3 共同作用卻能顯著抑制IL4。Kohu 等［11］研究發(fā)現Runx3 在Th2 細胞中也能被誘導，它可以與GATA3 相互作用并削弱GATA3 的轉錄活性，Runx3 過表達能促使Th 細胞向Th1 細胞分化，并下調Th2 細胞的免疫應答。

本研究顯示，CHB 組Runx3 mRNA 的表達水平明顯低于AHB 組和健康對照組，而AHB 組Runx3 mRNA 的表達水平明顯高于健康對照組。CHB 患者Runx3 低水平表達不能有效促進Th1 細胞免疫應答，無法清除體內病毒，從而使機體處于HBV 持續(xù)感染狀態(tài)。Brooks 等［22］研 究 發(fā) 現CHB 患 者 體 內 存 在Th1/Th2失衡，Th1 細胞反應不足，Th1 型免疫應答低下而Th2 型免疫應答亢進，Th1 細胞減少是乙型肝炎保護性抗體不能產生的重要原因。Maini 等［23］研究發(fā)現急性自限性HBV 感染主要是細胞免疫反應的結果，細胞因子多為Th1 型，而慢性HBV 感染細胞免疫反應很弱或測不出，體液免疫卻相對較強，細胞因子多為Th2 型。

本研究還顯示，CHB 重度組Runx3 mRNA 的表達水平明顯高于CHB 輕度組。Jiang 等［24］研究發(fā)現慢性HBV 感染者Th1 細胞隨肝臟炎癥活動的加劇而明顯增多，而Th2 細胞比例在慢性HBV 感染的不同階段則較為恒定，但均明顯高于健康對照組。L?hr 等［25］研究發(fā)現急性重癥乙型肝炎患者Th1 細胞的增殖反應比急性非重癥乙型肝炎患者強，類似結果在慢性重癥乙型肝炎患者中也得到證實。

綜上所述，Runx3 在CHB 的發(fā)病過程中可能發(fā)揮了重要作用，CHB 患者Runx3 表達水平降低可能與Th1/Th2 失衡有關，但能否通過上調Runx3 的表達水平促使CHB 患者外周血Th 細胞向Th1 細胞分化和Th1 型細胞因子的分泌從而促進HBV 的清除還有待進一步研究。

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