王明龍

（山西清澤陽光環(huán)?？萍加邢薰?，山西 太原 030012）

白腐真菌（white rot fungus）是一類腐生的絲狀真菌，由于其分泌的胞外木質素降解酶具有非特異性和無需底物誘導的獨特性能，使得它對許多結構不同、高毒性、高分子難降解有機物具有廣譜的降解能力，能降解包括多環(huán)芳烴化合物、氯代芳烴化合物、農藥、染料以及炸藥廢水等在內的多種環(huán)境污染物，在很多方面具有重要的應用價值［1-4］。同時，固定化細胞技術在廢水處理中有處理效率高、穩(wěn)定性強、生物密度高、反應啟動快、抗逆性強、耐毒性、耐高負荷、產污泥量少、固液分離簡單、菌體可循環(huán)利用等優(yōu)點。因此，將兩者優(yōu)點結合起來的固定化白腐真菌培養(yǎng)及降解技術在環(huán)境保護領域更具生產實踐意義［5］。

近年來，固定化白腐真菌培養(yǎng)及降解技術越來越多地受到世界各國科學界及工業(yè)界的高度重視，它們在環(huán)境保護領域正顯示出誘人的應用前景。因此，對白腐真菌的深入研究有著重要的理論價值和實際意義，并且已成為世界各國環(huán)境保護領域又一新的研究熱點［6-8］。

1 材料與方法

1.1 材料和試劑

本實驗所用的白腐真菌是從生物研究所購買。

培養(yǎng)基所需試劑：葡萄糖、酒石酸銨、維生素B1、KH2PO4、NaHPO4、MgSO4、CaCl2、FeSO4、MnSO4、ZnSO4·7H2O、NaCl、牛肉膏、蛋白胨、瓊脂粉。

調節(jié)pH的試劑：4%的鹽酸溶液，5%的氫氧化鈉溶液。

1.2 儀器設備

AL204-1C（萬分之一）電子分析天平；無菌接種操作室和接種環(huán)；手提式蒸汽消毒器，YXQ-LS-SII大型臺式滅菌鍋；電動離心機；AL204-1C（千分之一）電子分析天平；柜式培養(yǎng)箱；SPX-150-D振蕩培養(yǎng)箱。

1.3 培養(yǎng)基

1）白腐真菌的固體培養(yǎng)基：葡萄糖10g，瓊脂15g～20g，酒石酸銨 0.4g，KH2PO43g，NaHPO40.2g，MgSO40.25g，維生素B1 0.005g，CaCl20.1g，FeSO40.1g，ZnSO4·7H2O 0.03g，MnSO40.002g。

2）白腐真菌的液體培養(yǎng)基（搖床發(fā)酵液體培養(yǎng)基）：葡萄糖10g，酒石酸銨0.4g，KH2PO43g，NaHPO40.2g，MgSO40.25g，維生素B1 0.005g，CaCl20.1g，FeSO40.1g，ZnSO4·7H2O 0.03g，MnSO40.002g。

1.4 培養(yǎng)方法

1.4.1 培養(yǎng)基的制備

1）按照固體和液體的培養(yǎng)基成分用萬分之一分析天平稱好藥品，倒入燒杯中，并用蒸餾水定容到標線。

2）用鹽酸或者氫氧化鈉調節(jié)溶液的pH值，采用pH試紙來判斷pH值。

3）將用來制備固體培養(yǎng)基的培養(yǎng)皿用報紙包好和培養(yǎng)液放入臺式蒸汽鍋中，在115℃下殺菌20min。將用來制備液體培養(yǎng)基的含有培養(yǎng)液的燒杯放入蒸汽消毒器，在121℃下殺菌20min。

4）固體培養(yǎng)基：消毒后，將培養(yǎng)液趁熱倒入培養(yǎng)皿中，放置在無菌環(huán)境中備用。

5）液體培養(yǎng)基：待冷卻后倒入培養(yǎng)瓶，放在無菌環(huán)境中待用，等溫度降到30℃再接種［9-13］。

1.4.2 微生物生長量的測量方法

本實驗中在測量白腐真菌時采用了直接測量的方法，通過測其濕重來判斷它在該培養(yǎng)基中的生長量。具體測法：用分析天平（千分之一）測量4個離心瓶的質量。將培養(yǎng)好的白腐真菌液體培養(yǎng)液分組，每4個1組。每次測4個，每2個用托盤天平配平。放入離心機中，設定好轉速和時間（4 000r/min，20min），開始離心。離心后，將上清液倒掉，用分析天平（千分之一）測量其質量，并記錄。

2 結果與討論

本實驗的液體培養(yǎng)基為白色懸浮液，經過48h的培養(yǎng)，白腐真菌逐漸成型，出現部分孢體。而經過96h的培養(yǎng)，菌液中出現孢子狀菌體，菌體比較舒展，可用肉眼觀察其長勢。

在本實驗中采用葡萄糖的最佳質量濃度為10g/L，選取轉速為120r/min，ZnSO4最佳質量濃度是 0.03g/L，MnSO4的 最 佳 質 量 濃 度 為0.001 7g/L［14］。

2.1 各單因素對白腐真菌生長量的影響

2.1.1 pH值對生長量的影響

白腐真菌的最佳培養(yǎng)溫度為30℃～40℃。查閱資料可以發(fā)現，在這個溫度段，溫度對菌體的影響不是很大，所以選擇的溫度為37℃。將pH值分成6個水平分別進行實驗。經過培養(yǎng)和測試，得出表1的結論。白腐真菌在酸性環(huán)境中生長較好，堿性環(huán)境抑制該菌的生長；但過量的酸性也會抑制白腐真菌的生長。白腐真菌的最適生長pH值為4.5。

表1 pH值與生長量的關系

2.1.2 酒石酸銨質量濃度對生長量的影響

溫度為37℃，將液體培養(yǎng)基中的酒石酸銨分成6個質量濃度梯度進行實驗。經過培養(yǎng)和測定，得出表2的結論。酒石酸銨是培養(yǎng)基中的氮源，沒有酒石酸銨，白腐真菌的生長效果很不好。但是，隨著酒石酸銨質量濃度的增加，白腐真菌的生長量出現了一個峰值；過了峰值，生長量又隨著濃度的增加而減小。所以，酒石酸銨的最佳質量濃度為0.6g/L。

表2 酒石酸銨質量濃度與生長量的關系

2.1.3 磷酸二氫鉀質量濃度對白腐真菌的影響

溫度為37℃，將培養(yǎng)基中的磷酸二氫鉀的質量濃度分成6個水平進行實驗。經過培養(yǎng)和測定，得出表3的結論。起初，白腐真菌的生長量隨著磷酸二氫鉀質量濃度的增加而增加，在質量濃度為4g/L時生長量最大；過了最大值，生長量隨著質量濃度的增加而減小。所以，磷酸二氫鉀的最佳質量濃度為4g/L。

表3 磷酸二氫鉀質量濃度與生長量的關系

2.1.4 磷酸一氫鈉質量濃度對生長量的影響

室溫為37℃，將培養(yǎng)基中的磷酸一氫鈉的質量濃度分成6個水平，將等量的白腐真菌接種在6個培養(yǎng)基中。經過培養(yǎng)和測定，得出表4的結論。隨著磷酸一氫鈉質量濃度的增加，白腐真菌的生長量增加，在0.2g/L時得到最大值；隨后，隨著質量濃度的增加，生長量減少。所以，磷酸一氫鈉的最佳質量濃度為0.2g/L。

表4 磷酸一氫鈉質量濃度與生長量的關系

2.1.5 硫酸鎂質量濃度對白腐真菌生長量的影響

室溫為37℃，將培養(yǎng)基中的硫酸鎂分成6個水平進行實驗，得出表5的結論。最佳硫酸鎂的質量濃度為0.4g/L。但是，硫酸鎂對白腐真菌的生長影響不是特別明顯，還有待進一步研究，所以不對其進行正交化。

表5 硫酸鎂質量濃度與生長量的關系

2.1.6 氯化鈣質量濃度對生長量的影響

室溫為37℃，將培養(yǎng)基中的氯化鈣分成6個水平進行實驗。經過培養(yǎng)和測定，得出表6的結論。隨著氯化鈣質量濃度的增加，白腐真菌的生長量減少。所以，氯化鈣對白腐真菌有一定的抑制作用，對白腐真菌的生長不利。

表6 氯化鈣質量濃度與生長量的關系

2.2 正交實驗

2.1 實驗探討了各單因素（pH、酒石酸銨、磷酸二氫鉀、磷酸一氫鈉、硫酸鎂、氯化鈣）對白腐真菌生長量的影響，初步確定了單個實驗條件值，它只能反映單個實驗因素作用下白腐真菌生長量的變化趨勢。因此，為了探討在各因素綜合作用下白腐真菌處理高濃度DDNP廢水的最佳培養(yǎng)基條件，本實驗以葡萄糖（A）為碳源，磷酸二氫鉀（B）、磷酸一氫鈉（C）為磷源，酒石酸銨（D）為氮源，采取4因素3水平（見表7）正交實驗的方法對白腐真菌液體培養(yǎng)基進行優(yōu)化。正交實驗結果見表8。

表7 L9（34）正交實驗因素和水平

表8 L9（34）正交實驗結果分析

按照正交實驗表8配出9個培養(yǎng)基，分別接種相同量的菌體，培養(yǎng)5d后，稱量菌體的濕重，并記錄。通過表8可以看出，4號瓶的生長量最大。所以，最佳配比即為 A2B1C2D3，即葡萄糖10g/L，酒石酸銨0.7g/L，磷酸一氫鈉0.2g/L，磷酸二氫鉀1g/L。

3 結論

對有效處理高濃度DDNP廢水的白腐真菌培養(yǎng)基的優(yōu)化實驗研究可知，pH、酒石酸銨、磷酸二氫鉀、磷酸一氫鈉、硫酸鎂、氯化鈣對白腐真菌培養(yǎng)基中的生長量皆有影響；最佳的碳源、氮源和磷源為葡萄糖、酒石酸銨和磷酸二氫鉀及磷酸一氫鈉；白腐真菌培養(yǎng)基優(yōu)化的最佳配比為：葡萄糖10g/L，酒石酸銨0.7g/L，磷酸二氫鉀1g/L，磷酸一氫鈉0.2g/L，硫酸鎂0.4g/L，VB1 0.005g/L，硫酸亞鐵0.1g/L，硫酸鋅0.03g/L，硫酸錳0.005g/L。

利用白腐真菌處理高濃度DDNP廢水具有明顯的經濟效益和社會效益，在工業(yè)中已經利用白腐真菌來處理高濃度DDNP廢水。結果顯示，它不僅能降解硝基苯，還能降解硝基苯的次級代謝產物，說明白腐真菌可以完全降解硝基苯［15-20］。因此，對白腐真菌培養(yǎng)基的優(yōu)化研究更有重大的實際意義，可以使其在工業(yè)水處理中有著更廣闊的應用前景。

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