王強++彭日民++朱品++竺錫武

摘要 該文概述了植物病毒載體的類型，應用病毒載體表達外源蛋白，分析和利用基因功能方面的進展。

關鍵詞 病毒載體；外源蛋白；基因功能

中圖分類號 S476+.1 文獻標識碼 A 文章編號 1007-5739（2015）20-0086-03

Advancement on Research and Application of Plant Virus Vectors

WANG Qiang 1 PENG Ri-min 1 ZHU Pin 2 ZHU Xi-wu 1，2 *

（1 Institute of Agricultural and Biological Technology，Hunan University of Humanities，Loudi Hunan 417000； 2 Institute of Biological Engineering，Zhejiang University of Technology）

Abstract This paper outlined the types of plant virus vector and the process of applying viral vector to express foreign proteins，as well as analyze and utilize gene functions.

Key words virus vector；foreign protein；gene functions

基因表達載體的構建是基因工程中的核心。病毒載體是基因表達載體的類型之一，是利用病毒的基因組序列元件構建的真核基因轉錄工具，其目的是將目的基因導入受體細胞并可以表達。病毒載體與基因遺傳轉化相比，病毒載體表達水平高，表達量可達基因遺傳轉化的100多倍[1]；試驗快速，從載體的構建到植物的表達周期短；植物病毒寄主多，且一般都有很強的侵染能力和一定的寄主范圍，可對一種寄主植物的多個品種或多個寄主接種，大大方便用于分析不同種植物的基因功能或在不同種植物或不同品種中表達外源蛋白。病毒載體作為一門新興的技術快速發(fā)展，國內(nèi)外的科學工作者也在進一步開發(fā)并探析它的機理，并不斷拓寬應用范圍，以提升病毒載體的潛在價值。目前已經(jīng)構建了多種病毒載體運用于植物分子生物學領域。下面僅就植物病毒載體的類型以及在外源蛋白表達、基因沉默、基因功能研究及其他領域應用方面的概況作一綜述。

1 病毒載體的類型

根據(jù)植物病毒載體構建時病毒基因組的結構變化特點，可分為置換型、插入型、互補型病毒載體[2]。置換型載體主要是將病毒基因組中的某個基因的ORF框序列與外來基因ORF序列置換。早期置換型載體中被置換的病毒基因多為CP基因。最早的置換型病毒載體誕生于20世紀80年代，1984年，加拿大蒙特利爾大學的Brisson[3]等人，用DHFR基因替換掉了CaMV（花椰菜花葉病毒）的ORF II（蚜傳因子）基因，成功表達了細菌二氫葉酸還原酶基因（DHFR），并且對于病毒的系統(tǒng)性侵染沒有影響。而當插入更大外源基因時，會出現(xiàn)片段的丟失，經(jīng)研究表明CaMV可插入片段的上限為250 bp[4]。近幾年來開發(fā)出將一個外源基因序列置換多個病毒基因序列的載體，如Tobacoo mosaic virus（TMV）的TRBO載體[5]。由于病毒基因組序列中有一部分被置換，置換型病毒載體將改變病毒本身已有的部分功能，如病毒復制量、病毒可移動能力等，從而影響外源基因表達量。

插入型載體的構建主要是將外源基因序列插入病毒基因組的非編碼區(qū)，或者將外源基因編碼序列與復制酶基因以外的其他基因（如CP基因）同框融合而實現(xiàn)在病毒基因組編碼區(qū)插入外源基因，從而實現(xiàn)外來基因表達等功能。在球面或二十面體病毒中，由于其病毒粒子的形態(tài)特征，導致不能插入較大的外源片段，但是在諸如TMV、PVY、ZYMV等桿狀病毒中，有研究報道可插入片段的上限為1.8 kb[6]。Shivprasad[7]等利用重復病毒外殼蛋白亞基因組啟動子的方法，成功在煙草中表達了綠色熒光蛋白，并且病毒載體穩(wěn)定繁殖，不會出現(xiàn)丟失的現(xiàn)象。他在TMV U1株系中插入了TMGMV U5株系的CP亞基因組啟動子，而其他病毒株系的啟動子序列因為同源性很高，都出現(xiàn)了基因重組，造成片段丟失的現(xiàn)象。

互補型病毒載體是將外源基因插入缺陷型病毒或用外源基因置換病毒的某個基因構建而成，利用轉基因植株或輔助病毒補充提供失活基因產(chǎn)物，實現(xiàn)病毒的復制和擴散。這種載體有安全的優(yōu)點，但也有載體不穩(wěn)定的問題[8]。

根據(jù)病毒載體接種植物后病毒在植物中是否可移動可將病毒載體分為可移動載體和不可移動載體2大類?？梢苿虞d體即改造后的病毒在植物接種葉中形成病毒粒子后，可長距離移動至植物的其他葉等部位。不可移動載體即改造后的病毒載體只能在植物接種葉中形成病毒并繁殖，不能長距離移動至植物的其他部位。早期開發(fā)的病毒載體均為可移動載體，如Potato virus X（PVX）的PVX載體[9]、Tobacco rattle virus（TRV）的TRV載體[10]、Tobacoo mosaic virus（TMV）的TMV載體[11]。近年來為了提高葉片中目的外源蛋白表達量，也為了減少病毒擴散可能引起它種寄主植物致病等生物安全問題，許多學者開發(fā)了不可移動的病毒載體，這些不可移動的病毒載體同時也不對寄主植物產(chǎn)生致病癥狀，如TMV的TRBO載體[5]、Foxtail mosaic virus（FoMV）的FECT/40載體[12]、Cucumber mosaic virus（CMV）的C2-H1載體即CMV-no2b載體[13]。

2 病毒載體用于外源蛋白表達的研究

病毒載體構建的早期目的主要用于外源蛋白表達。利用植物病毒載體表達外源基因的方法主要有2種：一是在體外轉錄攜帶目的基因的侵染性cDNA克隆，將病毒基因組cDNA進行基因取代、插入融合等[14]，外源基因被加入后，便置于原核啟動子下游，然后以其轉錄物RNA直接侵染植物或者用基因槍的方法將病毒載體轉入植物中完成侵染，接種植物后病毒在寄主細胞內(nèi)自主增殖進行外源基因的表達[15]；二是將侵染性病毒的基因組cDNA克隆插入到Act2、CaMV35S轉錄啟動子等下游構建攜帶目的基因的侵染性重組病毒體，采用農(nóng)桿菌轉化法侵染植物，從而在寄主細胞內(nèi)完成一系列轉錄、合成及裝配過程，實現(xiàn)外源基因的表達過程。Marillonnet等在前人的基礎上建立了農(nóng)桿菌滲透（Agro-infiltration）接種技術，便使得病毒載體用于外源蛋白表達達到了一個令人滿意的水平，使外源蛋白的表達又踏上了一個新臺階[16]。endprint

至今用于表達藥用蛋白的主要病毒載體及表達的藥用蛋白或抗原如下[13，17-18]：豇豆花葉病毒（cowpea mosaic virus，CPMV）表達的口蹄疫病毒（FMDV）VP1抗原、人免疫缺陷病毒（HIV-1）gp41抗原、人鼻病毒（HRV-14）抗原、犬細小病毒（CPV）抗原、慢性肺炎病菌（Pseudom aeruginosa）外層臘蛋白F抗原、stahylococcus aureus D2 domain肽、瘧疾抗原、水貂腸炎病毒（MEV）抗原、對傳染性腸胃炎病毒（TGEV）具有特異性小分子免疫蛋白（SIP）、乙型肝炎病毒核心抗原（HBcAg）。TMV載體表達的有血管緊張素轉化酶抑制劑（ACEI）、流感病毒血凝素、人免疫缺損病毒（HIV-1）抗原、瘧疾抗原、鼠帶狀瘡疹ZP3糖蛋白、口蹄疫病毒（FMDV）VP1抗原、α-天花粉蛋白、38C13鼠B細胞淋巴瘤單鏈抗體、腸癌病毒單抗、口蹄疫病毒（FMDV）VP1、牛孢疹病毒I型（BHV-1）gDC、豬傳染性腹瀉病毒（PEDV）中和表位；TBSV表達的人免疫缺損病毒（HIV-1）V3環(huán)抗原、犬細小病毒（CPV）抗原；PVX載體表達的有人免疫缺損病毒（HIV-1）gp41抗原、輪狀病毒VP6抗原、人類乳突病毒16（HPV-16）E7蛋白抗原、人乳鐵蛋白N葉、人粒細胞巨噬細胞集落剌激因子（GM-CSF）、肺結核抗原ESAT-6；ALMV載體表達的有呼吸道合胞病毒（RSV）G蛋白抗原；PPV病毒載體表達的兔出血熱病毒（RHDV）VP60抗原；三葉草黃脈病毒Clover yellow vein virus（ClYVV）載體表達可溶性甲烷單加氧酶C亞單位（sMMO-C）；CMV載體表達的aFGF蛋白等。

3 病毒載體用于分析或利用外源基因功能

植物病毒載體除了用于表達疫苗抗原、抗體和藥用蛋白生產(chǎn)外，還可用于表達外源基因，分析基因功能，分析外源蛋白與植物中蛋白質的相互作用。例如，含番茄葉霉病菌avr9無毒基因的PVX重組表達載體通過農(nóng)桿菌浸潤接種帶有抗病（R）基因cf-9的番茄植株葉，番茄植株會發(fā)生過敏反應，表明R基因表達的產(chǎn)物可與avr9基因產(chǎn)物發(fā)生了直接的相互作用[19]。

植物病毒載體也可用于植物利用外源基因的功能。Shen等[20]將抗除草劑草丁膦的基因Bar插入到雙生病毒玉米線條病毒（MSV）中，再利用農(nóng)桿菌介導的方法來侵染玉米，就能在轉基因玉米植株表達而出現(xiàn)抗除草劑的性狀。但該病毒載體接種后仍保持原病毒的特性，對轉基因玉米植株依然產(chǎn)生致病性，因此尚不能用于生產(chǎn)實際中。

4 病毒載體用于分析被沉默基因的功能

病毒介導的基因沉默（VIGS）是根據(jù)植物對RNA病毒獨特的防御機制發(fā)展而來的一種技術，因其操作簡便、效率高、周期短、避免植物轉化、克服基因重復等特點，可以在不同的遺傳背景下工作，對基因的分析更清楚，漸漸成為了研究植物基因功能的一種有效方法。在正向遺傳學及反向遺傳學發(fā)現(xiàn)和鑒定基因功能的研究方面發(fā)揮著重要作用，越來越多的植物病毒被改造成有效的沉默載體，在植物生長發(fā)育、抗逆、信號轉導等功能研究方面取得了顯著的進展[21]。1997年，Van Kammen等[22]最早對VIGS進行了定義，最初的意義是用來描述植物受病毒侵染后產(chǎn)生的癥狀恢復現(xiàn)象。后來，VIGS專指利用重組病毒載體攜帶外源基因侵染植物后，隨著病毒的復制和移動特異性的誘導植物沉默自身內(nèi)源基因的一種現(xiàn)象[23-24]。1995年，Kumagai[25]等人，以煙草花葉病毒（Tobacco mosaic virus，TMV）為載體進行改造，他在TMV中插入了一段從煙草cDNA反轉錄出來的（phytoene desaturase，PDS）序列，利用這個攜帶PDS序列的病毒載體侵染煙草后，植物出現(xiàn)系統(tǒng)性褪綠的光漂白現(xiàn)象，同時PDS的mRNA水平也出現(xiàn)顯著性降低。結果說明植物出現(xiàn)漂白現(xiàn)象是由于PDS表達水平下降導致的，而PDS是類胡蘿卜素合成過程中的關鍵酶，對植物有著光保護作用。1998年，Ruiz等[26]采用PVX馬鈴薯X病毒（Potato X virus）載體攜帶PDS的序列的方法，也引發(fā)植物出現(xiàn)了相同的光漂白現(xiàn)象。后來，人們利用改造的VIGS載體對植物進行目的性的基因沉默，抑制內(nèi)源基因的表達，從而達到研究植物基因功能的作用。1998年，Kjemtrup等[27]利用雙生病毒科的番茄金色花葉病毒（STMV）為VIGS載體插入鎂離子螯合酶（magnesium chelatase）的關鍵基Su（Sulfur）和轉熒光蛋白基因luc（lucif-erase），從而引起了植物出現(xiàn)葉片黃化和轉luc植物不再發(fā)出熒光的表型。2001年，Ratcliff等[28]，報道了以煙草脆裂病毒 TRV構建的VIGS載體，相比于PVX、TMV、TGMV有許多優(yōu)點，其中TRV的 VIGS 載體相比于PVX對植物的癥狀影響較輕，并且在沉默效率、侵染范圍、持久性方面都比PVX更加完善。2002年，Liu等[29]利用煙草脆裂病毒（Tobacco rattle virus，TRV）在番茄中進行了VIGS試驗，可以對已經(jīng)公布的番茄 EST文庫進行功能研究分析。目前，TRV是應用范圍最廣的VIGS病毒載體，不僅其誘導植物的沉默效率高，而且更容易誘導分生組織的基因沉默，目前在煙草、番茄等茄科植物中均有大量的報道。TRV載體目前有3個版本，最初由Ratcliff等[30]構建的版本，Liu等[31]的pYL156、pYL279修改版本以及 Valentine等[32]構建的 TRV-2b版本。其中，Liu等[31]的 pYL156和pYL279版本，為了使病毒在植株內(nèi)大量擴增，該病毒還加入了2個35 S啟動子，并且在C端還加入了核酶。而TRV-2b的版本病毒載體中含有TRV RNA2中的2b序列。目前，TRV的病毒載體已在番茄、煙草、棉花（Gossypium spp.）、牽?；╗33]、擬南芥和罌粟（opium poppy）[34]等多種植物上被應用。2002年，Holzberg等[35]利用大麥條紋花葉病毒BSMV攜帶PDS片段，成功引起了大麥的白化現(xiàn)象，抑制了大麥PDS基因的表達，這是首次利用VIGS載體在單子葉植物上實現(xiàn)了基因沉默。2006年，Ding等[36]用雀麥花葉病毒（Brome mosaic virus，BMV）進行改造，同樣成功地在水稻、玉米等單子葉植物中完成了對基因沉默的研究。endprint

5 小結與展望

總而言之，植物病毒載體目前主要的應用體現(xiàn)在以下幾個方面：一是用于分析基因功能，特別是分析被沉默基因的功能的較多，即用于病毒誘導的基因沉默；二是用于表達藥物蛋白。植物病毒載體用于利用外源基因功能的研究很少，如病毒載體在用于表達抗性基因增強植物抗性方面的研究報道很少，原因可能主要是由于病毒的擴散和致病性引起安全性問題，難以實際應用。

植物病毒載體穩(wěn)定性相對較差，病毒載體中插入或置換的外源基因大小受到限制，病毒載體的接種方法較為昂貴和繁瑣，可移動病毒載體存在一定的安全性問題，這些問題都阻礙病毒載體的應用和發(fā)展，因此植物病毒載體仍有待進一步研究改進。

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