何林玲 王學(xué)東 李 麗 李 彪

富含Gln小麥水解蛋白對DSS誘導(dǎo)小鼠結(jié)腸炎的作用研究

何林玲1王學(xué)東1李 麗2李 彪3

（武漢輕工大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院1，武漢 430023）
（武昌工學(xué)院2，武漢 430065）
（安琪酵母股份有限公司3，宜昌 443000）

探討了富含谷氨酰胺（Gln）小麥水解蛋白對葡聚糖硫酸鈉（DSS）誘導(dǎo)小鼠結(jié)腸炎的影響。將24只小鼠分為正常對照組（Ⅰ組）、DSS誘導(dǎo)模型組（Ⅱ組）和營養(yǎng)液組（Ⅲ組）。觀察了臨床表現(xiàn)及結(jié)腸黏膜的病理組織變化，檢測了結(jié)腸組織的抗氧化活性，熒光定量PCR測定了結(jié)腸組織中炎癥因子的表達。結(jié)果表明，營養(yǎng)液處理后，減輕了由結(jié)腸炎造成的結(jié)腸黏膜的病理損傷，結(jié)腸組織中的IFN-γ和IL-6的表達較模型組低，而IL-10和TGF-β的表達差異不顯著，表明富含Gln的小麥水解蛋白可以促進促炎／抑炎因子的相對平衡，從而緩解腸道炎癥，是一種潛在的抗氧化和抗炎資源。

谷氨酰胺 DSS 小鼠結(jié)腸炎 炎癥因子

從氨基酸的組成來看，小麥蛋白中谷氨酸約占氨基酸總質(zhì)量分?jǐn)?shù)的35%，并且主要以谷氨酰胺（Gln）的形式存在，而Gln是動物血漿和組織中含量最豐富的游離氨基酸，約占總游離氨基酸的40% ～60%［1］。Gln是一種十分重要且具有特殊營養(yǎng)作用的條件性必需氨基酸及腸道必需氨基酸?？梢源龠M腸黏膜細(xì)胞的增殖，維護腸黏膜的屏障，是腸道修復(fù)最重要的營養(yǎng)物質(zhì)［2］。Gln同時可以調(diào)節(jié)免疫功能，參與機體免疫保護，無論口服或是靜脈補充都有助于腸道炎癥和黏膜損傷的改善，有利于腸道免疫功能的重建及細(xì)菌易位的發(fā)生［3］。Gln作為腸黏膜細(xì)胞合成的能源物質(zhì)及形成緊密連接的大分子的必要成分，可降低腸上皮細(xì)胞通透性，保護應(yīng)激時腸黏膜的屏障功能，另外還可以通過維持結(jié)腸黏膜形態(tài)及屏障功能的完整來提高機體的抗氧化能力，減緩炎癥反應(yīng)，從而使結(jié)腸炎造成的結(jié)腸黏膜損傷得到緩解［4］。有試驗小組通過免疫組學(xué)的方法檢測NF-κB的活性及HO-1的表達時發(fā)現(xiàn)：Gln可以減少結(jié)腸炎小鼠的腸道損傷，其保護機制是通過抗氧化、抗炎作用來阻礙NF-κB的激活，抑制MDA、蛋白酶3 及HO-1的表達［5］。

本試驗通過DSS誘導(dǎo)小鼠結(jié)腸炎的產(chǎn)生，模擬人類結(jié)腸炎，探索富含Gln小麥水解蛋白在防治結(jié)腸炎方面的功效。初步闡明其抗腸炎的分子機理，為合理的膳食提供指導(dǎo)，進一步為功能性食品的開發(fā)提供參考，同時又最大限度地利用了小麥蛋白資源，減少浪費，為小麥深加工提供發(fā)展方向。

1 材料與方法

1.1 主要材料與儀器

6周齡ICR小鼠、基礎(chǔ)飼料：湖北省實驗動物研究中心［合格證號：NO.42000600005398，許可證號：SCXK（鄂）2008-0005］；富含谷氨酰胺小麥水解蛋白營養(yǎng)液（谷氨酰胺質(zhì)量分?jǐn)?shù)31.2%）：實驗室自制；葡聚糖硫酸鈉（DSS，Dextran Sulfate Sodium 5000）：MPBIO公司；超氧化物歧化酶（SOD）試劑盒A003-1、還原型谷胱甘肽（GSH）試劑盒A006-2、丙二醛（MDA）試劑盒A003-1、髓過氧化物酶（MPO）試劑盒A044：南京建成生物工程研究所；WFG7200可見光光度計：尤尼柯上海儀器有限公司；TDZ5-WS醫(yī)用離心機：長沙平凡儀器儀表有限公司；qTOWER 2.0PCR儀：德國耶拿分析儀器股份公司。

1.2 小麥水解蛋白制備工藝流程

選用優(yōu)質(zhì)小麥面筋蛋白為原料，配成質(zhì)量分?jǐn)?shù)為4%的溶液，用雙步酶解法（先用堿性蛋白酶再用復(fù)合蛋白酶，2種加酶量比為1∶2）酶解，在此過程溫度控制為酶所需的最適溫度，用0.1 mol／L NaOH或HCl調(diào)節(jié)體系pH為最適pH值，達到酶解終點時，95℃下滅酶15 min，在4 000 r／min下離心分離得到上清液，最后通過超濾純化、懸蒸濃縮、冷凍干燥得到所需的小麥水解蛋白樣品。

1.3 實驗動物分組及動物模型的建立［6］

6周齡的ICR小鼠24只，體重（18±2）g，適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后開始試驗。將小鼠隨機分為3組（n＝8）：正常對照組、DSS模型組、小麥水解蛋白營養(yǎng)液組。Ⅰ組（正常對照組）：每日自由進飲用水及基礎(chǔ)飼料，不做任何處理；Ⅱ組（DSS模型組）：每日自由飲用5%DSS溶液替代飲用水，自由進食基礎(chǔ)飼料；Ⅲ組（小麥水解蛋白營養(yǎng)液組）：每日自由飲用5%DSS溶液替代飲用水，自由進食基礎(chǔ)飼料，每日灌胃30%小麥水解蛋白營養(yǎng)液。正常對照組、DSS模型組每日予等量無菌蒸餾水灌胃，試驗時間7 d?；A(chǔ)飼糧參照GB14924.1-200l實驗動物配合飼料通用質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)配合而成。實驗室控制條件為恒溫25℃，自然采光。

1.4 疾病活動指數(shù)（disease activity index，DAI）評分

24 h后觀察DSS模型組動物的行為變化及排便情況。待小鼠出現(xiàn)黏液稀便或血便時，便可初步確定模型建立成功。試驗過程中每日觀察小鼠的體重變化、大便性狀，并且每日觀察或用糞便隱血試紙檢測大便帶血情況。按DAI評分標(biāo)準(zhǔn)（表1）進行評分，將上述3項評分相加，得出每只小鼠的DAI評分。試驗過程中同時對小鼠的其他一般情況進行觀察，如懶動、體毛凌亂、精神狀態(tài)、進食、飲水和活動情況等。

表1 DAI評分標(biāo)準(zhǔn)

1.5 樣品的采集與處理

小鼠手術(shù)前禁食12 h，自由飲水。然后處死小鼠，沿腹中紅線切開腹壁，暴露腹腔組織，小心分離結(jié)腸（從回盲部到肛口，切取結(jié)腸，沿腸系膜縱向剖開腸段，用冰生理鹽水沖洗后，取部分結(jié)腸段進行蘇木素-伊紅（hematoxylin-eosin，HE）染色、勻漿檢測及熒光定量PCR檢測。

1.6 觀察指標(biāo)與檢測方法

1.6.1 組織學(xué)切片的制備及觀察

小鼠處死后，迅速切取0.5 cm結(jié)腸段，固定于4%多聚甲醛溶液中，常溫保存，常規(guī)石蠟包埋，切成8 mm厚的連續(xù)切片，進行HE染色，中性樹膠封片。在光學(xué)顯微鏡下觀察并拍照。

1.6.2 氧化指標(biāo)的測定［7］

采用黃嘌呤氧化酶法進行超氧化物歧化酶（SOD）活力的測定；采用二硫代二硝基苯甲酸法進行還原型谷胱甘肽（GSH）含量的測定；采用改良硫代巴比妥酸法進行丙二醛（MDA）含量的測定；采用鄰聯(lián)二茴香胺氧化法進行髓過氧化物酶（MPO）活性的測定。

1.6.3 熒光定量PCR測定結(jié)腸中炎癥細(xì)胞因子的表達［8］

小鼠處死后，迅速切取50 mg左右結(jié)腸段，保存在冷凍管中于-80℃保存待測，檢測結(jié)腸組織中炎癥細(xì)胞因子TGF-β、IFN-γ、IL-6、IL-10的表達情況。各基因引物信息如表2所示。

表2 基因的引物信息

1.7 數(shù)據(jù)處理

數(shù)據(jù)均采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（ˉx±s）表示，采用Excel統(tǒng)計軟件處理，多個樣本的均數(shù)比較用單因素方差分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 小鼠結(jié)腸損傷的病理組織學(xué)觀察結(jié)果

2.1.1 臨床表現(xiàn)及剖檢變化

小鼠在經(jīng)DSS誘導(dǎo)后食欲驟減，毛色枯槁，神情倦怠，偶有扭體反應(yīng)，并陸續(xù)出現(xiàn)稀便。灌服7 d后，Ⅰ組正常；Ⅱ組部分小鼠排黑色血便，肛門處有淡黃色膿惦物質(zhì)滲出，且有死亡現(xiàn)象；Ⅲ組上述癥狀有所緩解。剖檢發(fā)現(xiàn)Ⅰ組結(jié)腸黏膜完整，絨毛排列整齊，未見壞死、脫落；Ⅱ組大部分小鼠結(jié)腸壁顯著的腫脹增厚，腸黏膜壞死、脫落，滲出物及腸內(nèi)容物中混有血液；Ⅲ組上述癥狀減輕，其中Ⅲ組可見腸壁微腫脹，未見黏膜脫落和出血現(xiàn)象。通過對Ⅰ組、Ⅱ組、Ⅲ組小鼠的疾病活化指數(shù)進行評分，DAI評分值分別為：0.52±0.41、9.54 ±2.31、7.67 ±2.04、發(fā)現(xiàn)Ⅱ組小鼠DAI評分明顯高于Ⅰ組、Ⅲ組（P＜0.01），小鼠發(fā)生炎癥反應(yīng)，造模成功。給予小鼠一段時間的營養(yǎng)液灌胃處理，DAI評分顯著降低，小鼠結(jié)腸萎縮改善，結(jié)腸隱血、便血程度降低，炎癥細(xì)胞侵潤緩解，結(jié)腸炎癥得到改善。疾病活動指數(shù)（disease activity index，DAI）評分結(jié)果如圖1。

圖1 DSS誘導(dǎo)結(jié)腸炎DAI評分

2.1.2 病理組織學(xué)觀察

光鏡下觀察發(fā)現(xiàn)對照組（Ⅰ組）結(jié)腸絨毛邊緣整齊，致密，未見炎性細(xì)胞浸潤，見圖2a；模型組（Ⅱ組）結(jié)腸絨毛邊緣疏松不整，結(jié)締組織增生，且間質(zhì)增寬，黏膜及黏膜下層大量炎性細(xì)胞浸潤，黏膜上皮細(xì)胞中杯狀細(xì)胞數(shù)量顯著增多，見圖2b；營養(yǎng)液組（Ⅲ組）腸黏膜結(jié)構(gòu)清晰，黏膜上皮完整，炎性細(xì)胞浸潤減少，見圖2c。

圖2 小鼠結(jié)腸組織病理切片圖

2.2 小鼠結(jié)腸組織髓過氧化物酶活性（MPO）的檢測結(jié)果

MPO主要存在于炎癥細(xì)胞中，以中性粒細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)中最為多見，它的活性反映了結(jié)腸組織中炎癥細(xì)胞的浸潤程度。與對照組相比，DSS模型組動物結(jié)腸組織MPO活性顯著升高（P＜0.01），給予營養(yǎng)液后，Ⅲ組結(jié)腸組織MPO活性相對于模型組降低十分明顯（P ＜0.01，圖3）。

圖3 各組小鼠結(jié)腸組織中MPO活性變化（ˉx，n＝6）

2.3 小鼠結(jié)腸組織抗氧化功能指標(biāo)的檢測結(jié)果

SOD是自由基的天然清除劑，作為生物體細(xì)胞內(nèi)的主要抗氧化酶，可以保護細(xì)胞免受損傷。與對照組相比，模型組小鼠結(jié)腸組織中SOD活性會明顯降低（P＜0.01），營養(yǎng)液組小鼠的結(jié)腸組織SOD活性升高較為明顯（P＜0.05，表3）

GSH是一種小分子肽，是由三個氨基酸組成的，它可以將體內(nèi)有害的有毒的物質(zhì)有效的轉(zhuǎn)化為無害的物質(zhì)，排出體外。通常被稱作是機體內(nèi)重要的抗氧化劑和自由基清除劑。與對照組相比，模型組小鼠的結(jié)腸組織還原GSH含量明顯降低（P＜0.01），營養(yǎng)液組GSH的含量相對于模型組來說升高較為明顯（0.01＜P ＜0.05，表3）。

MDA是膜脂過氧化最重要的產(chǎn)物之一，它的產(chǎn)生能加劇膜的損傷，MDA含量的多少可以有效的顯示出機體被自由基破壞的情況。與對照組相比，模型組小鼠結(jié)腸組織中MDA含量顯著升高（P＜0.01），說明模型組小鼠結(jié)腸受到嚴(yán)重的損傷了，給予營養(yǎng)液后小鼠結(jié)腸炎中的MDA含量相對于模型組降低較為明顯（P＜0.05，表3）。

表3 小鼠結(jié)腸組織抗氧化指標(biāo)結(jié)果（ˉx，n＝6）

2.4 結(jié)腸組織中炎癥細(xì)胞因子的表達

2.4.1 RNA提取完整性分析

研究采用2%瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA提取質(zhì)量。用DEPC處理過的超純水配制的TAE緩沖液加入瓊脂糖凝膠，每孔上樣2.0μg總RNA樣本，取瓊脂糖凝膠EB染色，置于紫外燈下，觀察結(jié)腸組織中總RNA在5s、18s和28s的核糖體RNA條帶，可見清晰、明亮的18s、28sRNA條帶。5s核糖體RNA的分子量比較低，當(dāng)18s、28s的條帶亮度高于5s的條帶，則表明RNA樣本為高質(zhì)量的實驗樣品，如圖4所示。

圖4 2%瓊脂糖凝膠電泳來評估結(jié)腸組織mRNA的完整性

2.4.2 結(jié)腸組織中TGF-β、IFN-γ、IL-6和IL-10基因表達

實時定量PCR分析對照組、模型組及營養(yǎng)液組的小鼠結(jié)腸組織IFN-γ表達水平相對值分別為：0.232±0.012、1.086±0.054、0.194±0.010。小鼠結(jié)腸組織IL-6表達水平相對值分別為：2.469±0.123、3.531 ±0.177、1.790 ±0.090。小鼠結(jié)腸組織IL-10表達水平相對值分別為：1.384±0.069、2.064±0.103、1.593±0.080。小鼠結(jié)腸組織TGF-β表達水平相對值分別為：1.685±0.084、2.167±0.108、1.965±0.098。采用2-ΔΔCT法進行分析，如圖5所示，發(fā)現(xiàn)在正常機體內(nèi)，IFN-γ和IL-6表達水平較低，DSS誘導(dǎo)后，小鼠體內(nèi)的IFN-γ和IL-6的表達顯著升高，說明IFN-γ和IL-6的表達與炎癥反應(yīng)有著密不可分的關(guān)系，炎癥反應(yīng)的發(fā)生機制及體內(nèi)傳導(dǎo)的信號通路與IFN-γ和IL-6有關(guān)。營養(yǎng)液處理后，小鼠體內(nèi)的IFN-γ和IL-6的表達水平較DSS模型組降低，說明營養(yǎng)液可以通過控制IFN-γ和IL-6蛋白的表達，從而阻礙炎癥反應(yīng)發(fā)生的信號通路，從而防止炎癥的產(chǎn)生。同時對抑炎因子IL-10及TGF-β進行研究，發(fā)現(xiàn)模型組中的表達均高于對照組，說明雖然結(jié)腸炎腸道炎癥反饋反應(yīng)導(dǎo)致抑炎因子表達升高，但仍然存在抑炎因子的相對不足，炎癥／抑炎因子處于失衡狀態(tài)。經(jīng)營養(yǎng)液的干預(yù)后，炎癥因子表達的減少反饋導(dǎo)致抑炎因子表達減少，從而緩解了炎癥的發(fā)生。

圖5 各細(xì)胞因子的表達水平

3 討論

富含Gln小麥水解蛋白能夠有效降低模型組小鼠的宏觀炎癥指標(biāo)，降低DAI評分。對小鼠結(jié)腸組織切片進行HE染色，也觀察到模型組小鼠結(jié)腸上皮黏膜糜爛，損傷嚴(yán)重，淋巴細(xì)胞及伴中性粒細(xì)胞等浸潤，營養(yǎng)液組小鼠結(jié)腸損傷明顯減輕，上皮結(jié)構(gòu)相對完整，隱窩結(jié)構(gòu)完整，排列比較整齊，炎癥細(xì)胞浸潤得到緩解。

對促炎因子IL-6及INF-γ研究，發(fā)現(xiàn)經(jīng)富含Gln的小麥水解蛋白營養(yǎng)液的干預(yù)后，促炎因子表達明顯下降，表明促炎因子下降是腸道炎癥減輕的可能機制之一。同時對抑炎因子IL-10及TGF-β進行研究，發(fā)現(xiàn)模型組中的表達均高于對照組，與相關(guān)報道一致，說明雖然結(jié)腸炎腸道炎癥反饋反應(yīng)導(dǎo)致抑炎因子表達升高，但仍然存在抑炎因子的相對不足，使促炎／抑炎因子處于失衡狀態(tài)［9］。經(jīng)富含Gln的小麥水解蛋白營養(yǎng)液的干預(yù)后，炎癥因子表達的減少反饋導(dǎo)致抑炎因子表達減少，并且與炎癥減輕相一致。雖然細(xì)胞因子在結(jié)腸炎中的作用機制復(fù)雜，彼此間存在反饋與負(fù)反饋調(diào)節(jié)，構(gòu)成了一個復(fù)雜的反應(yīng)網(wǎng)絡(luò)體系，但富含Gln的小麥水解蛋白可以抑制過度的免疫反應(yīng)，減少細(xì)胞因子的過度表達，促進促炎／抑炎因子的相對平衡，從而緩解腸道炎癥。

Gln作為腸黏膜細(xì)胞代謝活動的主要能源及核苷酸生物合成的主要氮源，可以降低斷奶仔豬腹瀉率［10］。Gln對于放射引起的大鼠黏膜損傷有保護作用，且可增加此時腸黏膜DNA、蛋白質(zhì)的生物合成［11］。本試驗發(fā)現(xiàn)營養(yǎng)液組小鼠結(jié)腸黏膜較模型組完整，提示Gln對于維持結(jié)腸炎所導(dǎo)致的黏膜結(jié)構(gòu)受損具有保護作用，保護作用機理可能與Gln作用腸黏膜細(xì)胞的能源物質(zhì)加快腸黏膜上皮細(xì)胞的更新，進而緩解炎癥反應(yīng)造成的黏膜結(jié)構(gòu)損傷有關(guān)。Gln作為腸黏膜細(xì)胞合成的能源物質(zhì)及形成緊密連接的大分子的必需成分，可降低腸上皮通透性，保護應(yīng)激時腸的屏障功能?？梢酝ㄟ^維持結(jié)腸黏膜形態(tài)及屏障功能的完整、提高機體的抗氧化能力、緩慢炎癥反應(yīng)來對結(jié)腸炎所致的結(jié)腸損傷起到修復(fù)作用，從而使結(jié)腸炎造成的結(jié)腸黏膜損傷得到緩解［12］。

4 結(jié)論

本研究表明富含谷氨酰胺的小麥水解蛋白對DSS誘導(dǎo)的小鼠結(jié)腸炎有顯著的保護作用，營養(yǎng)液組的臨床表現(xiàn)及結(jié)腸黏膜的病理組織變化都顯著優(yōu)于模型組，營養(yǎng)液組結(jié)腸組織中的抗氧化活性也明顯增強，RT-PCR測定結(jié)腸組織中炎癥因子的表達也顯示富含Gln的小麥水解蛋白可以促進促炎／抑炎因子的相對平衡，從而緩解腸道炎癥，是一種潛在的抗氧化和抗炎資源。

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Effect of Wheat Protein Hydrolysate with Rich Glutamine on Mucosal Barrier of DSSInduced Colitis Mice

He Linling1Wang Xuedong1Li Li2Li Biao3
（Food Science and Engineering College Wuhan Polytechnic University1，Wuhan 430023）
（Wuchang Institute of Technology2，Wuhan 430065）
（Angel Yeast Co.，Ltd3，Yichang 443000）

In order to explore the influence of wheat protein hydrolysate rich in glutamine（Gln）on dextran sodium sulfate （DSS）induced colitis in mice，using DSSinduced mice to establish the colitis model，after the completion of colitis model hydrolyzed wheat protein rich in nutrient solution Gln was irrigated for continuous7 d，and mice would be put to death.Through observing the clinical manifestations and pathological tissue changes of colonic mucosa，colon tissue myeloperoxidase（MPO），superoxide dismutase（SOD），reduced glutathione（GSH），and malondialdehyde （MDA）of activity were detected；using the fluorescent quantitative PCR to determine the expression of cell inflammatory factors in the colon tissues.The results showed that MPO activity and MDA content in colon tissue were reduced after affected by wheat protein hydrolysate nutrient solution，and SOD activity and GSH content were increased，reducing colonic mucosa pathological damage caused by colitis.The expression of inflammatory factors also shows that wheat protein hydrolysate nutrient solution rich in Gln had repairing functions on colon injuries of DSSinduced mice.

glutamine，DSS，mice colitis，Inflammatory factors

S-3

A

1003-0174（2016）09-0007-06

武漢輕工大學(xué)研究生教育創(chuàng)新計劃（2013cx016）

2015-05-08

何林玲，女，1990年出生，碩士，食品科學(xué)

王學(xué)東，男，1979年出生，教授，食品科學(xué)