紅花黃色素對乳腺癌耐藥細(xì)胞MCF-7/ADR縫隙連接蛋白Cx43的影響※

童彩玲楊瑞儀1黃梅陸慧敏

(廣州中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院乳腺科，廣東廣州510405)

【摘要】目的觀察紅花黃色素對乳腺癌耐藥細(xì)胞MCF-7/ADR縫隙連接蛋白Cx43的影響。方法取對數(shù)生長期的MCF-7/ADR細(xì)胞，以2×10`5cells/孔接種于6孔培養(yǎng)板，24 h后分為4組，每組3孔，其中3組分別加入紅花黃色素至終濃度25、50、100 mg/L，另一孔設(shè)為空白對照組，作用48 h。Western blot法檢測各組MCF-7/ADR細(xì)胞中Cx43表達(dá)水平。結(jié)果不同濃度紅花黃色素作用于MCF-7/ADR細(xì)胞48 h后，Cx43表達(dá)水平均增高，有明顯的劑量依賴關(guān)系，以50、100 mg/L濃度作用顯著(P<0.01)。結(jié)論紅花黃色素能提高乳腺癌耐藥細(xì)胞MCF-7/ADR縫隙連接蛋白Cx43的表達(dá)水平。

【關(guān)鍵詞】紅花；乳腺腫瘤；連接蛋白43；藥理作用；藥物篩選試驗(yàn)，抗腫瘤

doi:10.3969/j.issn.1002-2619.2015.05.030

【中圖分類號】R286.91；R737.9；R977.6；R73-354；R285.5

【文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼】A

【文章編號】1002-2619(2015)05-0725-03

Abstract【】ObjectiveTo observe the effects of Safflower yellow on gap junction protein Cx43 in drug resistant breast cancer cell line MCF-7/ADR.MethodsMCF-7/ADR cells of logarithmic growth phase were inoculated in six-well culture dishes (2×10`5 cells each hole)，and divided into 4 groups after 24 hours，3 holes in each group.3 groups were added Safflower yellow to the final concentration of 25，50，100 mg/L，respectively.The last group was blank control group.48 h after cultivating，the expression level of Cx43 in drug resistant breast cancer cell line MCF-7/ADR were detected by Western-blot.Results48 h after different concentration of Safflower yellow acted on MCF-7/ADR cells，the expression level of Cx43 was increased in a dose-dependent relationship and there were remarkable effects on the concentration of 50，100 mg/L (P<0.01).ConclusionSafflower yellow can improve the expression level of gap junction protein Cx43 in drug resistant breast cancer cell line MCF-7/ADR.

作者簡介：童彩玲(1975—)，女，副主任中醫(yī)師，博士。研究方向：中西醫(yī)結(jié)合治療乳房疾病。

收稿日期：(2014-05-08)

Effects of Safflower yellow on gap junction protein Cx43 in drug resistant breast cancer cell line MCF-7/ADRTONGCailing*，YANGRuiyi，HUANGMei，etal.*DepartmentofGalactophore，theFirstAffiliatedHospitalofGuangzhouUniversityofTraditionalChineseMedicine，Guangdong，Guangzhou510405

【Key words】 Safflower; Breast tumor; Cx43; Pharmacologic action; Drug screening test; Anti-tumor

※項(xiàng)目來源：2012年度廣東省自然科學(xué)基金博士啟動(dòng)項(xiàng)目(編號：S2012040006689)

1廣州中醫(yī)藥大學(xué)熱帶醫(yī)學(xué)研究所，廣東廣州510405

乳腺癌是女性最常見的惡性腫瘤之一，化療是乳腺癌治療的重要手段，以往對提高化療藥物療效的研究多從逆轉(zhuǎn)化療藥物的多藥耐藥入手。近年來研究發(fā)現(xiàn)，可通過增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞的縫隙連接(gap junction，GJ)功能，來增強(qiáng)化療藥物的細(xì)胞毒性[1]，為腫瘤治療開辟了新途徑。

GJ是細(xì)胞間進(jìn)行物質(zhì)交換的主要連接通道，由特殊的通道蛋白—連接蛋白(Connexin，Cx)組成。乳腺癌各種細(xì)胞株中GJ功能存在不同程度的降低或缺失，提高GJ功能可顯著增強(qiáng)阿霉素對乳腺癌的抗腫瘤作用[2]。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，紅花黃色素能上調(diào)心肌連接蛋白Cx43水平，對阿霉素心肌損傷具有一定的心臟保護(hù)作用[3]。本實(shí)驗(yàn)研究旨在探討紅花黃色素對乳腺癌耐藥細(xì)胞MCF-7/ADR縫隙連接蛋白Cx43的影響，結(jié)果如下。

1材料與方法

1.1藥物及試劑人乳腺癌耐阿霉素細(xì)胞株MCF-7/ADR(深圳市百恩維生物科技有限公司)；阿霉素(深圳萬樂藥業(yè)有限公司，批號1212E1)；紅花黃色素(山西華輝凱德制藥有限公司，批號201302035)。DMEM高糖培養(yǎng)基、胎牛血清、胰蛋白酶(美國Gibco公司)。Cx43兔單克隆抗體、辣根過氧化物酶標(biāo)記的山羊抗兔二抗、β-actin鼠單克隆抗體、辣根過氧化物酶標(biāo)記的山羊抗小鼠二抗(美國PTG公司)。Western及免疫沉淀(IP)細(xì)胞裂解液、二喹啉甲酸(BCA)蛋白濃度測定試劑盒、一抗二抗去除液(上海碧云天生物科技有限公司)。增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光(ECL)試劑盒(廣州美津生物技術(shù)有限公司)。

1.2實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1細(xì)胞培養(yǎng)將MCF-7/ADR接種于DMEM高糖培養(yǎng)液，內(nèi)含10%胎牛血清、100 g/mL鏈霉素、100 U/mL青霉素、1 μg/mL阿霉素，37 ℃、5%CO2培養(yǎng)。2~3 d后細(xì)胞融合達(dá)到80%~90%時(shí)1∶2或1∶3傳代培養(yǎng)。

1.2.2紅花黃色素處理取對數(shù)生長期的MCF-7/ADR細(xì)胞以2×105cells/孔接種于6孔培養(yǎng)板，24 h后分為4組，每組3孔，其中3組分別加入紅花黃色素至終濃度25、50、100 mg/L，作用48 h另1組設(shè)為空白對照組，術(shù)進(jìn)行任何處理。

1.2.3Western blot法檢測Cx43蛋白表達(dá)吸去各組細(xì)胞培養(yǎng)液，磷酸鹽緩沖液(PBS)沖洗細(xì)胞2遍后，用Western及IP細(xì)胞裂解液充分裂解，離心收集上清液，BCA法測定總蛋白濃度。取相同濃度的蛋白液進(jìn)行十二烷基磺酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠(SDS-PAGE)電泳分離，將分離的蛋白轉(zhuǎn)到聚偏二氟乙烯(PVDF)膜上，5%脫脂奶粉37 ℃封閉2 h，加入1∶2 500稀釋的Cx43兔單克隆抗體，4 ℃孵育過夜，洗膜，加入1∶8 000稀釋的辣根過氧化物酶標(biāo)記的山羊抗兔二抗，37 ℃孵育1 h，洗膜，與化學(xué)發(fā)光試劑ECL于暗室中進(jìn)行反應(yīng)，待膠片爆光，專業(yè)圖像分析顯影定影，掃描圖像，采用Image-Pro Plus 6.0專業(yè)圖像分析軟件分析條帶密度。PVDF膜用一抗二抗去除液洗膜去掉抗體，按上述方法重新封閉，加入1∶8 000稀釋的β-actin鼠單克隆抗體、辣根過氧化物酶標(biāo)記的山羊抗小鼠二抗進(jìn)行二次雜交，ECL顯色，掃描圖像，以作為內(nèi)參對照。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)方法采用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，用單因素方差分析(One-Way ANOVA)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性分析。

2結(jié)果

4組人乳腺癌耐阿霉素細(xì)胞株MCF-7/ADR Cx43蛋白表達(dá)比較見圖1、2。

圖1　4組人乳腺癌耐阿霉素細(xì)胞株MCF-7/ADR Cx43蛋白表達(dá) 注：1為空白對照組；2為紅花黃色素25 mg/L組；3為紅花黃色素50 mg/L組；4為紅花黃色素100 mg/L組

圖2　4組人乳腺癌耐阿霉素細(xì)胞株MCF-7/ADR Cx43蛋白表達(dá)比較 與空白對照組比較，** P<0.01

Western blot結(jié)果采用Image Pro Plus 6.0專業(yè)圖像分析軟件進(jìn)行定量分析，灰度值以累積吸光度值表示，結(jié)果以Cx43與β-actin的累積吸光度比值表示。由圖1、2可見，不同濃度紅花黃色素作用于MCF-7/ADR細(xì)胞48 h后，Cx43蛋白表達(dá)水平增高，有明顯的劑量依賴關(guān)系，以50、100 mg/L濃度作用顯著(P<0.01)。

3討論

乳腺癌是女性最常見的惡性腫瘤之一，以阿霉素為代表的蒽環(huán)類藥物在乳腺癌化療方案中有著舉足輕重的地位。但腫瘤細(xì)胞對阿霉素產(chǎn)生的耐藥及其心臟毒性，直接影響了其療效和廣泛使用。臨床研究發(fā)現(xiàn)，在阿霉素化療時(shí)加用紅花注射液可以預(yù)防和減輕阿霉素引起的急性心臟毒性，提高患者對阿霉素化療的耐受性和依從性[4-5]。實(shí)驗(yàn)研究表明，紅花黃素不僅能上調(diào)心肌連接蛋白Cx43水平，對阿霉素心肌損傷具有一定的保護(hù)作用[3]，而且對腫瘤細(xì)胞有較強(qiáng)的抑制作用[6]。

縫隙連接(GJ)是位于細(xì)胞膜上的一種特殊細(xì)胞連接，生物體內(nèi)相鄰細(xì)胞間主要通過GJ通道互相傳遞信號分子，從而控制細(xì)胞間的協(xié)調(diào)生長。近年來，GJ已成為較為公認(rèn)的腫瘤抑制基因，GJ介導(dǎo)的細(xì)胞間通訊功能可抑制腫瘤的發(fā)生和轉(zhuǎn)移[7]。GJ由特殊的通道蛋白—Cx組成，Cx是進(jìn)行細(xì)胞間通訊的物質(zhì)基礎(chǔ)，廣泛存在于心臟、肝臟、肌肉和皮膚等。目前在乳腺組織中檢測出Cx26、Cx32和Cx43 3種Cxs表達(dá)，其中又以Cx26和Cx43表達(dá)為主。有研究發(fā)現(xiàn)，在Hela細(xì)胞，Cx26/Cx32組成的GJ能增強(qiáng)順鉑的細(xì)胞毒性。順鉑能夠通過直接作用于Cx抑制GJ的通透性而降低順鉑的細(xì)胞毒性，這可能是其耐藥性產(chǎn)生的一種機(jī)制[8]。因此，Cx不失為一種逆轉(zhuǎn)化療耐藥的治療靶點(diǎn)，尋求能增強(qiáng)乳腺癌細(xì)胞Cx43表達(dá)的藥物，對提高阿霉素的抗腫瘤作用具有十分重要的意義。紅花黃色素是從活血化瘀中藥紅花中提取的有效成分之一。本研究結(jié)果顯示，紅花黃色素能使乳腺癌耐藥細(xì)胞MCF-7/ADR的縫隙連接蛋白Cx43表達(dá)水平增高，且有明顯的劑量依賴關(guān)系，為中醫(yī)藥在逆轉(zhuǎn)化療耐藥方面提供了新的研究思路。

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(本文編輯：曹志娟)