CS-ISPH-TPP亞微米顆粒的粒徑與表面電位影響因素研究

婁本濁

(陜西理工學(xué)院 物理與電信工程學(xué)院， 陜西 漢中 723000)

[摘要]以帶正電的幾丁聚醣(CS)與帶負(fù)電的三聚磷酸鈉(TPP)通過離子交聯(lián)作用包覆分離大豆蛋白質(zhì)水解物(ISPH)制成CS-ISPH-TPP亞微米顆粒，利用動態(tài)光散射法分析ISPH濃度、CS分子量及CS/TPP質(zhì)量比對亞微米顆粒的粒徑與表面電位的影響。結(jié)果表明，CS-ISPH-TPP亞微米顆粒的粒徑隨ISPH添加濃度的增加而增大，而表面電位則無明顯變化。CS-TPP與CS-ISPH-TPP亞微米顆粒的粒徑會隨CS分子量的增加而增大，且包覆ISPH顆粒的粒徑均大于未包覆的顆粒，而表面電位則介于41.9~44.2 mV之間。CS/TPP質(zhì)量比由6∶1減至4∶1時，顆粒粒徑會隨之增加，而由4∶1減至2∶1時，粒徑則變??；CS/TPP質(zhì)量比由6∶1減至3∶1時，顆粒表面均帶有高度的正電荷，繼續(xù)減至2∶1時，表面電位會出現(xiàn)驟降的情形。

[關(guān)鍵詞]動態(tài)光散射； CS-ISPH-TPP；納米顆粒；粒徑； 表面電位

[文章編號]1673-2944(2015)05-0073-06

[中圖分類號]O631.2; TQ645.9

收稿日期：2015-01-09

基金項目：國家自然科學(xué)基金資助項目(41105107)；陜西省自然科學(xué)基礎(chǔ)研究計劃項目(2012JM5014)

作者簡介：婁本濁(1982—)，男，山東省濟南市人，陜西理工學(xué)院講師，碩士，主要研究方向為光學(xué)技術(shù)的開發(fā)與應(yīng)用。

以幾丁聚醣(chitosan，CS)作為基材制備亞微米顆粒已被廣泛應(yīng)用在藥物傳遞中，CS可通過物理法與化學(xué)法將藥物吸附于表面或包覆在微納顆粒中。Ko等[1]利用CS與三聚磷酸鈉(sodium tripolyphosphate，TPP)的離子交聯(lián)作用制備500~710 nm的CS-TPP亞微米顆粒，并指出降低TPP溶液的pH值及增加CS分子量時可獲得表面平滑的球狀顆粒。Xu等[2]以CS-TPP包覆牛血清蛋白(bovine serum albumin，BSA)制備20~200 nm的亞微米顆粒，并指出所得顆粒的特性會受CS的濃度及BSA添加量的影響。Gan等[3]將CS-TPP亞微米顆粒應(yīng)用于基因傳遞上可獲得粒徑介于100~250 nm且表面帶高度正電荷的微納顆粒，并指出CS/TPP質(zhì)量比對亞微米顆粒的粒徑與表面電位有很大影響；粒徑與表面電位均隨CS/TPP質(zhì)量比增加而增大，而CS/TPP質(zhì)量比固定時表面電位會隨CS濃度增加而減小。Wu等[4]利用CS-TPP亞微米顆粒包覆甘草酸銨獲得表面帶正電荷的亞微米顆粒，利用動態(tài)光散射測得顆粒粒徑大于120 nm。Grenha等[5]將CS亞微米顆粒應(yīng)用于肺蛋白傳遞上，指出在水溶液中亞微米顆粒的粒徑與表面電位不會改變。Gan等[6]以CS-TPP亞微米顆粒包覆BSA得到200~580 nm之間且表面帶有高度正電荷的CS-BSA-TPP微納顆粒。Jang等[7]探討包覆VC的CS亞微米顆粒在水溶液中加熱處理的安定性時指出，當(dāng)CS與TPP濃度分別為1.5 mg/mL與0.6 mg/mL時可得粒徑約為170 nm的顆粒；當(dāng)VC濃度由0.1 mg/mL增至0.3 mg/mL時，顆粒粒徑會隨之增加，表面電位則隨之下降。Liu等[8]指出CS亞微米顆粒包覆環(huán)丙沙星時，在pH 4.8下CS與TPP濃度分別為2 mg/mL與1 mg/mL時可得粒徑約為300 nm的微納顆粒，且固定CS濃度并提高TPP濃度時可降低顆粒粒徑。

由以上文獻(xiàn)可得知，CS亞微米顆粒已被廣泛應(yīng)用在藥物、蛋白質(zhì)或基因上，而其特性會受到許多因素的影響，因此本文將利用動態(tài)光散射法詳細(xì)探討CS分子量、分離大豆蛋白質(zhì)水解物濃度及CS/TPP質(zhì)量比等因素對CS-ISPH-TPP亞微米顆粒的粒徑與表面電位的影響。

1基本原理

在動態(tài)光散射中，散射光強自相關(guān)函數(shù)強度G(2)(τ)與電場自相關(guān)函數(shù)g(1)(τ)之間滿足Siegert關(guān)系：

(1)

其中β為相干因子，τ為延遲時間。對單分散球形顆粒而言，其電場自相關(guān)函數(shù)為

(2)

則光強自相關(guān)函數(shù)可改寫為

(3)

其中Г為半寬衰減系數(shù)，它與平移擴散系數(shù)D之間滿足

(4)

其中k為散射矢量，且有k=[4π sin(θ/2)]/λ。利用Stocks-Einstein公式可計算出懸浮顆粒的平均流體力學(xué)半徑R，即

(5)

其中kB為玻爾茲曼常數(shù)，T為熱力學(xué)溫度，η為溶劑的黏滯系數(shù)。通過式(5)由平移擴散系數(shù)D就可以反演出流體力學(xué)半徑R。

進(jìn)行界面電位測量時，特定電壓下帶電粒子因靜電吸引力而朝相反電性的電極移動，由于黏滯力會抑制帶電粒子移動，當(dāng)這兩種力達(dá)到平衡時，帶電粒子會以固定速度移動。該速度與電場強度、溶液的介電常數(shù)、黏度及界面電位有關(guān)，利用動態(tài)光散射可測得該移動速度的大小。當(dāng)電場強度、溶液的介電常數(shù)及黏度已知時，即可根據(jù)Henry方程求得界面電位，即

(6)

其中μE為電泳移動率，ε為溶液的介電常數(shù)，ξ為顆粒的Zeta電位，η為溶液粘度，f(cR)為分散顆粒的參數(shù)。若分散顆粒為球形，且當(dāng)cR很小時，則有

影像學(xué)檢查 包括超聲、核素顯像、CT、磁共振成像(magnetic resonance imaging，MRI)等，超聲檢查目前是評估甲狀腺結(jié)節(jié)的首選方法。

(7)

而當(dāng)cR非常大時，則有

(8)

2實驗

表1給出了不同影響因素下所需CS-ISPH-TPP亞微米顆粒的配制方式，具體制備流程為：將1 mL大豆分離蛋白水解物(isolated soy protein hydrolysate，ISPH)溶液加至5 mL濃度為2 mg/mL幾丁聚糖(CS)溶液(pH 4.7)中攪拌10 min，再將其緩慢滴入2 mL三聚磷酸鈉(TPP)溶液(pH 9.0)攪拌15 min，使得混合液中CS/TPP質(zhì)量比為6∶1，之后添加20 μL甘油攪拌5 min以避免納米顆粒互相黏附，最后在15 ℃下以48 000g轉(zhuǎn)速離心30 min后即得CS-ISPH-TPP亞微米顆粒。

表1　不同影響因素下所需CS-ISPH-TPP亞微米顆粒的配制方式

使用激光光散射法粒徑及界面電位分析儀(Zetasizer 3000HS，Malvern，UK)測定亞微米顆粒的尺寸與表面電位。將CS-TPP與CS-ISPH-TPP亞微米顆粒懸浮于去離子水中，用超聲波細(xì)胞粉碎機將聚集顆粒震碎，靜置10~15 min后取上層溶液，以動態(tài)光散射法測定粒徑大小；將CS-TPP與CS-ISPH-TPP亞微米顆粒以去離子水稀釋至適當(dāng)濃度，測定其表面電位。所有樣品皆在室溫下測定3次，求其平均值。

3結(jié)果與討論

3.1　ISPH濃度的影響

圖1　 ISPH濃度對CS-ISPH-TPP亞微米顆粒粒徑的影響

圖1表示的是ISPH濃度對CS-ISPH-TPP亞微米顆粒粒徑的影響?？梢钥闯?，隨著ISPH濃度的增加，CS-ISPH-TPP亞微米顆粒的粒徑有變大的趨勢，這是由于CS-TPP包覆了更多ISPH的緣故。

CS上的NH3+可提高其對腸黏膜的吸附力及可暫時性打開腸黏膜上緊密連接的能力，有利于藥物、營養(yǎng)物質(zhì)等滲透吸收。表2給出了ISPH濃度對CS-ISPH-TPP亞微米顆粒表面電位的影響。數(shù)據(jù)顯示，隨著ISPH濃度的增加，CS-ISPH-TPP亞微米顆粒的表面電位并無明顯改變，顆粒表面均帶正電荷，介于42.1~43.7 mV之間。這是因為在酸溶液中，CS上的NH2被質(zhì)子化形成NH3+，此時將CS溶液滴入帶負(fù)電的TPP溶液中會中和反應(yīng)產(chǎn)生CS亞微米顆粒，而在顆粒表面上仍存在正電荷及未與TPP離子形成相互作用的NH3+。Gan等[6]指出當(dāng)亞微米顆粒包覆BSA后表面電位只有輕微的減少，這是因為CS鏈上尚有許多游離的胺基并未被BSA占據(jù)，因此蛋白質(zhì)吸附于CS表面并不會改變其分子表面電位。

表2　ISPH濃度對CS-ISPH-TPP亞微米顆粒表面電荷的影響

3.2　CS分子量的影響

圖2表示的是CS分子量對CS-TPP與CS-ISPH-TPP亞微米顆粒粒徑的影響?？梢园l(fā)現(xiàn)，CS-TPP與CS-ISPH-TPP亞微米顆粒的粒徑隨著CS分子量的增加而增大，且包覆有ISPH者的粒徑均大于未包覆者的粒徑。這是由于CS分子量越大，其鏈越長，因此鏈與鏈之間的立體空間障礙增大，所以亞微米顆粒粒徑較大。Wu等[4]研究指出隨著CS分子量的增加，其粒徑有隨之增大的趨勢；而比較分子量為200 kDa與24 kDa的CS包覆不同濃度的甘草酸銨時，指出當(dāng)以分子量200 kDa的CS包覆甘草酸銨時，顆粒粒徑會隨甘草酸銨濃度增加而增加，但以24 kDa的CS包覆甘草酸銨時，其顆粒粒徑增加并不明顯，這是由于低分子量的CS具有較高的溶解性，有助于亞微米顆粒膠體在溶液中的穩(wěn)定。

圖2　 CS分子量對CS-ISPH-TPP亞微米顆粒粒徑的影響

表3　 CS分子量對CS-TPP與CS-ISPH-TP亞微米顆粒表面電位的影響

3.3　CS/TPP質(zhì)量比的影響

圖3表示的是CS/TPP質(zhì)量比對CS-ISPH-TPP亞微米顆粒粒徑的影響。由圖可知，亞微米顆粒的粒徑會受CS/TPP質(zhì)量比影響而改變。當(dāng)CS的分子量為固定值131.1 kDa，CS/TPP質(zhì)量比由6∶1減至4∶1時，顆粒粒徑會隨之增加。這是由于TPP含量增加，幾丁聚醣的胺基與TPP產(chǎn)生鍵結(jié)機會變多，能形成更多的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，因此粒徑會增大。而當(dāng)CS/TPP的質(zhì)量比由4∶1減至2∶1時，其粒徑則呈現(xiàn)變小的趨勢。這是由于TPP含量增加CS鏈上的胺基幾乎都鍵結(jié)上TPP，因此CS上鏈與鏈之間的斥力降低，立體空間障礙變少，因此粒徑變小。另外，包覆ISPH的顆粒粒徑皆大于未包覆的顆粒，這是因為ISPH被鍵結(jié)或包覆進(jìn)CS-TPP亞微米顆粒中的緣故。Grenha等[5]指出CS/TPP質(zhì)量比由3.6∶1增至6∶1制備顆粒時，其粒徑隨之增加(300~390 nm)，他們認(rèn)為這是由于CS與TPP之間鍵結(jié)增加的緣故；而CS/TPP質(zhì)量比為6∶1與5∶1包覆胰島素時，包覆胰島素的顆粒粒徑均大于未包覆的顆粒，這是由于胰島素被包覆到其結(jié)構(gòu)中所致。Gan等[3]使用3種不同分子量的CS對不同比例的TPP制備亞微米顆粒(CS/TPP質(zhì)量比為3∶1~7∶1)，指出顆粒粒徑會隨CS分子量增加及CS/TPP質(zhì)量比增大而增大(100~250 nm)。本研究結(jié)果與文獻(xiàn)結(jié)果略有差異，筆者認(rèn)為TPP含量增加會使CS的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)變多，同時導(dǎo)致顆粒粒徑增加，故增加CS/TPP質(zhì)量比(5∶1與6∶1)也有可能使顆粒粒徑變小。

圖3　 CS/TPP質(zhì)量比對CS-ISPH-TPP亞微米顆粒粒徑的影響

表4給出了CS/TPP質(zhì)量比對CS-TPP與CS-ISPH-TPP亞微米顆粒表面電位的影響。表中顯示，CS/TPP質(zhì)量比由6∶1減至3∶1時，其表面電位雖有微小差異，但顆粒表面皆帶有高度的正電荷(未包覆42.6~46.7 mV，包覆43.7~47.6 mV)。當(dāng)CS/TPP質(zhì)量比減至2∶1時，未包覆及包覆ISPH的顆粒表面電位均出現(xiàn)驟降的情形(未包覆顆粒，由46.7 mV減至26.6 mV；包覆ISPH的亞微米顆粒，由47.6 mV減至24.0 mV)，這是由于CS/TPP質(zhì)量比減少至2∶1時，TPP含量大幅增加，故TPP易與CS鏈上的胺基產(chǎn)生鍵結(jié)，使CS的NH3+部位變少，表面電位降低。許多文獻(xiàn)皆指出CS-TPP亞微米顆粒的表面電位會受TPP的濃度及包覆物質(zhì)濃度等因素影響而降低：Grenha等[5]指出CS/TPP質(zhì)量比由6∶1減至3.6∶1所制備亞微米顆粒的表面電位會由45 mV減至34 mV，當(dāng)CS-TPP顆粒包覆胰島素后其表面電位也會降低；Gand等[3]指出CS/TPP質(zhì)量比由7∶1減至3∶1時表面電位隨之遞減，約由45 mV減至30 mV；Liu等[8]也指出隨著TPP濃度的增加(0.75~1.75 mg/mL)，所得微米顆粒的表面電位均有隨之下降的趨勢(約由45 mV減至32 mV)。但本研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)CS/TPP質(zhì)量比減少至2∶1時，未包覆及包覆ISPH的顆粒表面電位均會出現(xiàn)驟降的情形。這一特性會影響CS的生物特性(如生物黏著性)及其對腸道上皮細(xì)胞的緊密連接調(diào)控的能力，故本文認(rèn)為在制備CS-ISPH-TPP納米顆粒時CS/TPP重量不宜低于3∶1。

表4　CS/TPP質(zhì)量比對CS-TPP與CS-ISPH-TPP亞微米顆粒表面電位的影響

4結(jié)論

本研究分析了ISPH濃度、CS分子量及CS/TPP質(zhì)量比對CS-ISPH-TPP亞微米顆粒的粒徑與表面電位的影響。結(jié)果表明：

(1)用低分子量的CS與CS/TPP質(zhì)量比6∶1包覆不同濃度(1~9 mg/mL)的ISPH時，所得亞微米顆粒的粒徑隨ISPH添加濃度的增加而增大，而表面電位則無明顯變化。

(2)用固定濃度但分子量不同的ISPH與CS/TPP質(zhì)量比為6∶1制備亞微米顆粒時，所得CS-TPP與CS-ISPH-TPP亞微米顆粒的粒徑會隨CS分子量增加而增大，且包覆ISPH顆粒的粒徑均大于未包覆的顆粒，而表面電位則無明顯變化。

(3)用低分子量的CS，固定ISPH溶液濃度，不同CS/TPP質(zhì)量比制備亞微米顆粒時，CS/TPP質(zhì)量比由6∶1減至4∶1時，顆粒粒徑會隨之增加；而由4∶1減至2∶1時，粒徑則呈現(xiàn)變小的趨勢；由6∶1減至3∶1時，顆粒表面均帶有高度的正電荷，而減至2∶1時，顆粒表面電位會出現(xiàn)驟降的情形。

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[責(zé)任編輯：魏 強]

Study on the influence factors of particle size and zeta potential of CS-ISPH-TPP submicron particles

LOU Ben-zhuo

(School of Physics and Telecommunication Engineering, Shaanxi University of Technology,Hanzhong 723000, China)

Abstract:CS-ISPH-TPP nanoparticles were prepared by isolated soy protein hydrolysate being coated through ionic crosslinking between chitosan hydrolysate(CS) with negative charge and sodium tripolyphosphate(TPP) with positive charge. The effects of ISPH concentration, chitosan molecular weight and CS/TPP mass ratio on the size and zeta potential of these nanoparticles were investigated by dynamic light scattering method. The results showed that, the size of CS-ISPH-TPP nanoparticles increased with ISPH concentration increasing and there was no obvious change in zeta potential. The size of CS-TPP and CS-ISPH-TPP nanoparticles increased with chitosan molecular weight increasing and zeta potential lied during 41.9~44.2 mV. The size of CS-TPP and CS-ISPH-TPP nanoparticles increased for CS/TPP mass ratio decreasing from 6∶1 to 4∶1 and decreased for CS/TPP mass ratio decreasing from 4∶1 to 2∶1. The surface of CS-TPP and CS-ISPH-TPP nanoparticles possessed a high degree of positive charge for CS/TPP mass ratio decreasing from 6∶1 to 4∶1 and the zeta potential decreased rapidly for CS/TPP mass ratio decreasing from 4∶1 to 2∶1.

Key words:dynamic light scattering;CS-ISPH-TPP;submicron particle;particle size;zeta potential