薯蕷丸對(duì)慢性腎衰竭大鼠紅細(xì)胞計(jì)數(shù)、血紅蛋白及腎組織轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β1的影響※

雷根平郭亞平1李小會(huì)曾小晴2王婷陳大威3

(陜西中醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院腎病一科，陜西咸陽712000)

※項(xiàng)目來源：陜西省二〇一二年科學(xué)技術(shù)研究發(fā)展計(jì)劃(二)

(編號(hào)：2012JC2-09)

1陜西省榆林市中醫(yī)醫(yī)院腎病中心，陜西榆林719000

2陜西中醫(yī)學(xué)院2011級(jí)碩士研究生，陜西咸陽712046

3陜西中醫(yī)學(xué)院2013級(jí)碩士研究生，陜西咸陽712046

【摘要】目的觀察薯蕷丸對(duì)慢性腎衰竭(CRF)大鼠紅細(xì)胞計(jì)數(shù)(RBC)、血紅蛋白(Hgb)含量及腎組織轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β1(TGF-β1)表達(dá)的影響。方法將70只雄性SD大鼠分為假手術(shù)組10只及手術(shù)組60只。手術(shù)組均采用5/6腎切除方法制備CRF模型，再隨機(jī)分為3組即著蕷丸組(13只)、包醛氧淀粉組(14只)及模型組(13只)。薯蕷丸組以1.8 g/(kg·d)、包醛氧淀粉組以2 g/(kg·d)相應(yīng)藥液定時(shí)灌胃，假手術(shù)組及模型組每日同時(shí)間以等容積0.9%氯化鈉注射液灌胃。6周后測(cè)大鼠血清RBC、Hgb含量，制作腎組織蘇木精—伊紅(HE)染色切片觀察病變程度，免疫組化法測(cè)大鼠腎組織TGF-β1的表達(dá)情況。結(jié)果假手術(shù)組、薯蕷丸組及包醛氧淀粉組RBC、Hgb含量均高于模型組(P<0.05，P<0.01)，薯蕷丸組RBC、Hgb含量高于包醛氧淀粉組(P<0.05)。HE切片顯示模型組病變程度明顯，薯蕷丸組及包醛氧淀粉組病變程度較模型組均有所好轉(zhuǎn)，薯蕷丸組病變輕于包醛氧淀粉組。假手術(shù)組、薯蕷丸組及包醛氧淀粉組腎組織TGF-β1陽性表達(dá)量低于模型組(P<0.05，P<0.01)，且薯蕷丸組低于包醛氧淀粉組(P<0.05)。結(jié)論薯蕷丸可升高CRF大鼠RBC及Hgb含量，降低大鼠腎組織TGF-β1水平，減輕腎臟病變。

【關(guān)鍵詞】薯蕷丸；腎功能衰竭，慢性；大鼠；動(dòng)物實(shí)驗(yàn)；紅細(xì)胞；血紅蛋白類；轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β1

doi：10.3969/j.issn.1002-2619.2015.06.025

作者簡(jiǎn)介：雷根平(1966—)，男，主任醫(yī)師。研究方向：腎臟病的臨床與實(shí)驗(yàn)研究。

【中圖分類號(hào)】R692.5；R331.122；R446.112.4

【文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼】A

【文章編號(hào)】1002-2619(2015)06-0867-04

Abstract【】ObjectiveTo observe the effect of Shuyu pill on the contents of red blood cells (RBC)，hemoglobin(Hgb) and expression of nephridial tissue transforming growth factor beta 1(TGF-β1) in rats with chronic renal failure(CRF). Methods70 male SD rats were divided into sham operation group，model group，Shuyu pill group and oxyamyli tectus aldehydum group. CRF model in model group，Shuyu pill group and oxyamyli tectus aldehydum group were induced by 5/6 nephrectom. Rats in Shuyu group and oxyamyli tectus aldehydum group received 1.8 g/ (kg·d) and 2 g/ (kg·d) of Shuyu pill via gastrogavage respectively. The other rats received isasteric 0.9% sodium chloride injection by gastrogavage. After 6 weeks of experiment，the levels of RBC and Hgb were detected，pathological change of kidney-tissue by HE staining were observed，and expression of TGF-β1 were measured by immunohistochemistry. ResultsThe contents of RBC and Hgb in sham operation group，Shuyu pill group and oxyamyli tectus aldehydum group were higher than those in model group (P<0.05，P<0.01). The contents of RBC and Hgb in Shuyu pill group were higher than those in oxyamyli tectus aldehydum group (P<0.05). Pathological change of kidney-tissue was obvious in model group. Lesion extent in Shuyu pill group and oxyamyli tectus aldehydum group was less than that in model group. Positive expression quantity of TGF-β1 of nephridial tissue in sham operation group，Shuyu pill group and oxyamyli tectus aldehydum group were lower than those in model group (P<0.05，P<0.01). Pathological change of kidney-tissue and positive expression of TGF-β1 in Shuyu pill group were lower than those in oxyamyli tectus aldehydum group (P<0.05). ConclusionShuyu pill can enhance RBC and Hgb in rats with CRF，and decrease expression of TGF-β1 in kidney-tissue.

收稿日期：(2014-05-30)

Effects of Shuyu pill on erythrocyte，hemoglobin and nephridial tissue transforming growth factor beta 1 in rats with chronic renal failureLEIGenping*，GUOYaping，LIXiaohui，etal.*DepartmentofNephrologyOne，AffiliatedHospitalofShaanxiUniversityofChineseMedicine，Shaanxi，Xianyang712000

【Key words】Shuyu pill；Renal failure；Chronic；Rats；Animal experiment；Red blood cells；Hemoglobin；Transforming growth factor beta 1

慢性腎衰竭(chronic renal failure，CRF)是指各種原發(fā)或繼發(fā)性腎臟疾病，不可逆轉(zhuǎn)的使腎單位逐步喪失和腎功能持續(xù)損害，出現(xiàn)體內(nèi)代謝潴留、水電解質(zhì)紊亂、酸堿平衡失調(diào)，全身各系統(tǒng)逐漸受累為主要特征的臨床癥狀綜合征[1]，是臨床疑難重癥之一。CRF發(fā)病及進(jìn)展機(jī)制復(fù)雜，其中細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)發(fā)揮著重要作用。轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β1(TGF-β1)是目前為止發(fā)現(xiàn)的在纖維和結(jié)締組織ECM發(fā)生、發(fā)展過程中最重要的細(xì)胞因子之一[2]。中醫(yī)藥在保護(hù)腎功能、延緩CRF進(jìn)展方面有獨(dú)特療效。我們?cè)谂R床治療CRF過程中，以中醫(yī)辨證論治為指導(dǎo)，結(jié)合多年臨床心得，認(rèn)為CRF的基本病機(jī)為本虛標(biāo)實(shí)，并提出“慢性腎功能衰竭虛實(shí)相因”病機(jī)理論和“整體緩調(diào)，虛實(shí)同治”的治療原則[3]，采用經(jīng)方薯蕷丸治療CRF患者，取得了很好的療效[4]。本實(shí)驗(yàn)通過觀察薯蕷丸對(duì)CRF模型大鼠紅細(xì)胞計(jì)數(shù)(RBC)、血紅蛋白(Hgb)含量及腎組織TGF-β1的影響，探討其保護(hù)腎功能、延緩CRF進(jìn)展的可能機(jī)制。

1材料與方法

1.1材料

1.1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物健康SD雄性大鼠70只，9周齡，清潔級(jí)，體質(zhì)量(200±10) g。均購(gòu)自西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，動(dòng)物合格證號(hào)SCXK(陜)2012-003。

1.1.2藥品與試劑薯蕷丸藥物組成：山藥30 g，當(dāng)歸、桂枝、神曲、生地黃、大豆黃卷各10 g，甘草28 g，人參、阿膠各7 g，川芎、白芍藥、白術(shù)、麥門冬、杏仁、防風(fēng)各6 g，柴胡、桔梗、茯苓各5 g，干姜3 g，白蘞2 g，大棗100枚。將上藥研成細(xì)粉，由陜西中醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院藥房制成濃縮丸，6 g/丸，溶入蒸餾水33 mL中制成混懸液，每mL含薯蕷丸0.18 g。包醛氧淀粉(5 g/袋，天津太平洋制藥有限公司，國(guó)藥準(zhǔn)字H12021136)，溶入蒸餾水30 mL中制成混懸液，每mL含包醛氧淀粉0.20 g。TGF-β1試劑盒由邁凱雯生物科技(香港)有限公司提供。

1.1.3儀器QPJ-1B型生物病理旋轉(zhuǎn)式切片機(jī)(天津愛華醫(yī)療器械有限公司)；HD-310型組織自動(dòng)包埋機(jī)(湖北慧達(dá)儀器有限公司)；攤片烘片烤片機(jī)(PPTHK-21B型，上海精密儀器儀表有限公司)；FYL-YS-100L型恒溫箱(北京福意電器有限公司)；DHG202-00A型實(shí)驗(yàn)室烤箱(上虞市道墟鎮(zhèn)音花儀器廠)；CH-2型Olympus光學(xué)顯微鏡(日本奧林巴斯公司)；Image-Pro Plus 5.0型圖像分析軟件(美國(guó)Media Cybernetics公司)；XH-6020型免疫計(jì)數(shù)器(西安核儀器廠)；TD4K-Z型臺(tái)式低速離心機(jī)(濟(jì)南福的機(jī)械有限公司)；MYTHIC-22-AL型五分類血細(xì)胞分析儀(深圳市庫貝爾生物科技有限公司)；BI-2000醫(yī)學(xué)圖像分析系統(tǒng)(成都泰盟科技公司)。

1.2實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1造模及分組70只SD雄性大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后，隨機(jī)分為2組。假手術(shù)組10只，手術(shù)組60只。手術(shù)組參照文獻(xiàn)[5]的方法造模，術(shù)前禁食12 h，不禁水。腹腔注射10%水合氯醛(35~40 mg/100 g體質(zhì)量)麻醉，分別剪除左腎上下各1/3左右皮質(zhì)，復(fù)位殘腎；1周后第2次手術(shù)，行右腎全切術(shù)。假手術(shù)組：先暴露左腎，不行手術(shù)切除，1周后行右腎暴露。手術(shù)組大鼠喂養(yǎng)5周，存活大大鼠(40只)，再隨機(jī)分為3組：模型組(13只)、包醛氧淀粉組(14只)、薯蕷丸組(13只)。

1.2.2給藥方法薯蕷丸組按臨床成人用量6倍(20 g/kg)配制劑量濃度，1.8 g/(kg·d)灌胃，即10 mL，每日1次。包醛氧淀粉組均每日同時(shí)間予0.20 g/mL包醛氧淀粉懸混液，2 g/(kg·d)灌胃，即10 mL，每日1次；假手術(shù)組及模型組予等容積0.9%氯化鈉注射液灌胃。共灌胃6周。

1.3觀察指標(biāo)及方法RBC、Hgb檢測(cè)：灌胃6周后，將大鼠用10%水合氯醛(給藥量為0.3~0.4 g/kg)腹腔注射麻醉，并行下腔靜脈取血2 mL，裝入抗凝管，反復(fù)顛倒數(shù)次使血與抗凝劑充分混勻，使用紅細(xì)胞分析儀計(jì)數(shù)。腎組織病理切片：取血后打開腹腔，剖取左側(cè)腎臟，以10%甲醛溶液固定，石蠟包埋，留作病理檢查標(biāo)本，采用蘇木精—伊紅(HE)染色。HE染色步驟：①分別放入二甲苯Ⅰ、二甲苯Ⅱ脫蠟各5 min；②分別按順序放入無水乙醇、95%乙醇、90%乙醇、80%乙醇、70%乙醇各1 min；③蒸餾水沖洗1 min；④蘇木素染色5 min；⑤流水沖洗1 min洗去多余蘇木素；⑥1%鹽酸-乙醇分化5 s后以蒸餾水迅速?zèng)_洗2 s，再以1%氨水返藍(lán)5 s；⑦流水、蒸餾水各沖洗1 min后用0.5%伊紅液染色1 min；⑧蒸餾水沖洗2 s，80%乙醇2 s；⑨分別置于95%乙醇Ⅰ、95%乙醇Ⅱ中各2 min；⑩分別按順序放入無水乙醇Ⅰ、無水乙醇Ⅱ、二甲苯Ⅰ、二甲苯Ⅱ、二甲苯Ⅲ各3 min；中性樹脂封片。后予光鏡下觀察腎臟組織病理變化。TGF-β1采用免疫組織化學(xué)法檢測(cè)：應(yīng)用病理圖像分析系統(tǒng)進(jìn)行圖像采集和半定量分析，根據(jù)每張切片陽性反應(yīng)顆粒的顏色深淺(黃色及棕褐色)及占細(xì)胞總數(shù)(面積)的比例來測(cè)量結(jié)果，為了方便計(jì)算與比較，視野內(nèi)顆粒越多、顏色越深、面積越廣，則陽性積分越高。

2結(jié)果

2.1大鼠死亡情況手術(shù)組從造模到分組開始，由于手術(shù)失敗及術(shù)后感染，共死亡大鼠20只。其中第1次手術(shù)死亡12只，術(shù)后感染死亡4只；第2次手術(shù)死亡4只，術(shù)后感染死亡4只。剩余40只隨機(jī)分為3組，模型組13只，薯蕷丸組13只，包氧淀粉組14只，從分組灌胃開始到實(shí)驗(yàn)結(jié)束，由于CRF及并發(fā)癥，共死亡大鼠4只，其中模型組死亡1只，薯蕷丸組死亡1只，包醛氧淀粉組死亡2只。

2.24組大鼠RBC、Hgb比較見表1。

表1　4組大鼠RBC、Hgb比較

由表1可見，假手術(shù)組、薯蕷丸組及包醛氧淀粉組RBC、Hgb含量均高于模型組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05，P<0.01)。薯蕷丸組RBC、Hgb含量高于包醛氧淀粉組(P<0.05)。

2.34組大鼠腎組織病理改變HE切片顯示，假手術(shù)組基本正常(見封3，圖1)；模型組個(gè)別腎小球體積增大，少部分可見腎小球硬化、腎小管萎縮，系膜細(xì)胞與基質(zhì)增多，腎間質(zhì)纖維化伴炎性細(xì)胞浸潤(rùn)(見封3，圖2)。薯蕷丸組及包醛淀粉組病變程度較模型組均有所好轉(zhuǎn)，其中薯蕷丸組減輕明顯(見封3，圖3)，且優(yōu)于包醛氧淀粉組(見封3，圖4)。

2.44組大鼠腎組織TGF-β1表達(dá)情況見表2，封3(圖5、6、7、8)。

表2　4組大鼠腎組織TGF-β 1表達(dá)情況

由表2可見，假手術(shù)組、薯蕷丸組及包醛氧淀粉組腎組織TGF-β1陽性表達(dá)量均低于模型組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05，P<0.01)。薯蕷丸組TGF-β1陽性表達(dá)量低于包醛氧淀粉組(P<0.05)。

3討論

5/6腎切除術(shù)是應(yīng)用最廣泛的CRF造模方法，該模型穩(wěn)定有效，重復(fù)性好，能較好的模擬CRF的發(fā)病過程，因此我們采用5/6腎切除模型作為薯蕷丸研究CRF的模型。有研究顯示，腎小球硬化、腎間質(zhì)纖維化是終末期腎病(ESRD)的病理基礎(chǔ)，ECM合成和降解系統(tǒng)失衡與腎小球硬化、腎間質(zhì)纖維化密切相關(guān)[6]。TGF-β1是最重要的促ECM合成與積聚的因子之一，也是腎小球硬化的重要介質(zhì)[7]。它在纖維化的發(fā)生中具有雙重作用，正常表達(dá)時(shí)能發(fā)揮免疫功能，調(diào)節(jié)細(xì)胞的生長(zhǎng)、分化并抑制炎癥和細(xì)胞增生而起正面作用；而過度表達(dá)則可能導(dǎo)致組織纖維化。同時(shí)，TGF-β1被認(rèn)為是基質(zhì)金屬蛋白酶和基質(zhì)金屬蛋白酶抑制物系統(tǒng)最重要的調(diào)控因子[8]。因此，對(duì)抗TGF-β1以阻止腎臟纖維化對(duì)治療CRF具有重要意義，也成為一個(gè)公認(rèn)的治療靶點(diǎn)。RBC、Hgb是目前臨床上最常用評(píng)價(jià)貧血的指標(biāo)之一，CRF往往伴有腎性貧血。故本實(shí)驗(yàn)選用TGF-β1、RBC及Hgb作為觀察指標(biāo)。本研究結(jié)果顯示，薯蕷丸及包醛氧淀粉均能升高CRF大鼠RBC、Hgb水平，降低腎組織TGF-β1的表達(dá)，減輕腎臟病理表現(xiàn)，其中薯蕷丸組作用更為明顯。通過本實(shí)驗(yàn)可得出，薯蕷丸保護(hù)腎功能、延緩CRF進(jìn)展，其可能機(jī)制為：①通過提升RBC、Hgb水平，改善腎臟病理狀態(tài)；②抑制或降低TGF-β1在腎組織中過度表達(dá)，以抑制其致腎臟纖維化，減輕其腎小管—間質(zhì)損害，延緩和防止腎小球進(jìn)一步硬化，改善腎臟病變的進(jìn)程。

我們認(rèn)為，CRF的病機(jī)為“虛實(shí)相因”。所謂虛實(shí)相因，是指CRF的虛實(shí)病機(jī)互為因果，虛實(shí)混淆，循環(huán)反復(fù)，纏綿難愈[9]。正因?yàn)镃RF存在病機(jī)上的“虛實(shí)相因”，具有病機(jī)的復(fù)雜性、病位的廣泛性等特點(diǎn)，故治療CRF應(yīng)求助于復(fù)方、大復(fù)方來提高療效，遵從“整體緩調(diào)，虛實(shí)同治”的治療原則，選用經(jīng)方薯蕷丸。該方組方特點(diǎn)為有7對(duì)藥組組成，分別為山藥、生地黃、麥門冬、蜂蜜構(gòu)成滋陰補(bǔ)腎藥組，人參、茯苓、大棗、白術(shù)、甘草構(gòu)成健脾益氣藥組，白芍藥、當(dāng)歸、阿膠、川芎構(gòu)成養(yǎng)血活血藥組，杏仁、桔梗構(gòu)成宣肺藥組，柴胡、大豆黃卷構(gòu)成疏肝藥組，桂枝、干姜構(gòu)成溫陽散寒藥組，防風(fēng)、桂枝構(gòu)成祛風(fēng)除濕藥組。全方以培補(bǔ)脾腎、氣血雙補(bǔ)、滋陰溫陽、養(yǎng)血活血、扶正祛邪為主，具有補(bǔ)陽不宜辛熱、養(yǎng)陰不宜滋膩、活血不宜破血、祛風(fēng)不宜開破、藥量輕重有別、清熱不宜苦寒、補(bǔ)益重在氣血、守中兼顧四臟、補(bǔ)扶不忘流通等九大特點(diǎn)，對(duì)慢性復(fù)雜性疾病尤其是CRF具有深遠(yuǎn)的臨床指導(dǎo)意義。

近年來中醫(yī)藥治療腎組織纖維化已突顯出明顯的優(yōu)勢(shì)。本實(shí)驗(yàn)研究由于樣本小，觀察時(shí)間短等，存在一定不足，但本實(shí)驗(yàn)研究表明薯蕷丸對(duì)腎功能有一定保護(hù)作用，亦印證了腎組織中TGF-β1參與CRF的發(fā)生發(fā)展過程?？傊哂信嘌a(bǔ)脾腎、養(yǎng)血活血、扶正祛邪功效的薯蕷丸可以通過降低腎組織中TGF-β1及提高 RBC、Hgb水平，減輕腎臟病理改變，保護(hù)腎功能，延緩CRF進(jìn)展，同時(shí)為中醫(yī)藥防治CRF提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)和理論基礎(chǔ)。

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(本文編輯：李珊珊)