培育顆粒對(duì)人絨毛滋養(yǎng)細(xì)胞侵襲與增殖的作用

王婧瑤1，孫麗萍1*，趙丕文1，梁欣韞2*

(1.北京中醫(yī)藥大學(xué)人體機(jī)能系，北京 100029；2.首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京婦產(chǎn)醫(yī)院中醫(yī)科，北京 100026)

摘要：目的觀察培育顆粒對(duì)人絨毛滋養(yǎng)細(xì)胞的侵襲和增殖功能的影響。方法取人妊娠5～10周正常胎盤絨毛,進(jìn)行滋養(yǎng)細(xì)胞培養(yǎng)。正常23～25 d雌性SD大鼠藥物灌胃，取藥理血清。培養(yǎng)液加20%血清，分組培養(yǎng)48 h后檢測(cè)指標(biāo)。用Transwell侵襲實(shí)驗(yàn)檢測(cè)培育顆粒對(duì)滋養(yǎng)細(xì)胞侵襲功能的影響，MTT法檢測(cè)培育顆粒對(duì)滋養(yǎng)細(xì)胞增殖能力的影響,流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)培育顆粒對(duì)滋養(yǎng)細(xì)胞增殖核抗原(PCNA)表達(dá)的影響。結(jié)果Transwell侵襲實(shí)驗(yàn)檢測(cè)結(jié)果表明,培育顆粒血清各劑量組與正常組侵襲細(xì)胞數(shù)均有差異,中劑量組侵襲細(xì)胞數(shù)最多。MTT法檢測(cè)結(jié)果表明，培育顆粒血清各劑量組與正常組吸光度均有差異,中劑量組吸光度最高。流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)結(jié)果表明，培育顆粒血清各劑量組與正常組PCNA陽(yáng)性率均有差異，中劑量組PCNA陽(yáng)性率最高。結(jié)論培育顆粒可促進(jìn)人絨毛滋養(yǎng)細(xì)胞侵襲與增殖功能，可能與負(fù)反饋調(diào)節(jié)有關(guān)。

關(guān)鍵詞：培育顆粒；侵襲；增殖；滋養(yǎng)細(xì)胞；負(fù)反饋調(diào)節(jié)

DOI::10.13463/j.cnki.jlzyy.2015.07.022

中圖分類號(hào)：R714.21文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A

文章編號(hào)：1003-5699(2015)07-0719-04

基金項(xiàng)目:國(guó)家自然科學(xué)基金青年

作者簡(jiǎn)介:王婧瑤(1987-)，女，碩士研究生，主要從事中醫(yī)藥與生殖研究。

*通信作者:孫麗萍，電話-13681179069,電子信箱-slp201070@163.com

梁欣韞，電話-(010)52276423,電子信箱-fredalxy@163.com

Influence of the Peiyu particles on invasion and proliferation of human trophoblast cell

WANG Jingyao1,SUN Liping1*,ZHAO Piwen1,LIANG Xinyun2*

(1.Function of Human Body Department Beijing University of Chinese Medicine,Beijing 100029,China;

2.TCM Department Beijing Obstetrics and Gynecology Hospital of Capital Medical University,Beijing 100026,China)

Abstract:ObjectiveTo observe the Effect of the Peiyu particles on invasion and proliferation capabilities of human trophoblast cell.MethodsPlacental villi from normal pregnancy of 5 to 10 weeks were taken to culture trophoblast cells.Twenty percent pharmacological serum obtained from Peiyu particles-administered normal female SD rats (aged 23 to 25 days) was added in nutrient solution for culture.After being divided into groups,trophoblast cells were cultured for 48 hours.Then,invasion cell number,absorbance and PCNA expression rate of trophoblast cell in all groups were analyzed by TW invasion assay,MTT assay,and flow cytometry,respectively.ResultsTW assay results show that invasion cell number of each dose group of Peiyu particles is different from that of the normal group,and the invasion cell number of medium dose group is the highest.MTT assay results show that each dose group of Peiyu particles is different from the normal group in absorbance with absorbance of medium dose group being the highest.Flow cytometry results also show that there are differences between each dose group of Peiyu particles and the normal group in PCNA expression rate,and the PCNA expression rate of medium dose group is the highest.ConclusionPeiyu particles can enhance invasion and proliferation abilities of human trophoblast cell,and its effect may be dose-dependent.

Keywords:Peiyu particles;invasion;proliferation；trophoblast cell;negative feedback to adjust

中醫(yī)認(rèn)為早孕期間自然流產(chǎn)主要由于腎氣不足，胎失所系，脾氣虛弱，胎失所養(yǎng)，臨床辨證以腎虛和脾腎兩虛多見。培育顆粒由北京婦產(chǎn)醫(yī)院趙松泉研制，組方包括桑寄生、菟絲子等補(bǔ)腎益精藥，山藥、黃精等健脾益氣藥，熟地黃、生地黃等滋陰養(yǎng)血藥。全方補(bǔ)養(yǎng)腎氣，健運(yùn)脾氣，滋陰養(yǎng)血，達(dá)到固胎的目的。前期臨床實(shí)驗(yàn)已證實(shí)培育顆粒對(duì)脾腎兩虛型早期先兆流產(chǎn)有較好的保胎作用[1]。人絨毛滋養(yǎng)細(xì)胞的侵襲與增殖功能是妊娠早期成功的關(guān)鍵，自然流產(chǎn)的發(fā)生常與絨毛滋養(yǎng)細(xì)胞侵襲和增殖功能不足有關(guān)。本實(shí)驗(yàn)研究培育顆粒對(duì)人絨毛滋養(yǎng)細(xì)胞的作用。

1實(shí)驗(yàn)材料

1.1試劑和耗材DMEM F12培養(yǎng)液、DPBS、抗PCNA熒光標(biāo)記抗體(invitrogen)，2.5%胰蛋白酶儲(chǔ)存液、Triton X-100、30%H2O2(biotopped)，Hank’s液、PBS緩沖液、DAB顯色試劑(Solarbio)，膠原酶Ⅰ(Gene-bio)，免疫組化試劑盒(博士德)，抗角蛋白7單克隆抗體(Epitomics)，抗波形蛋白單克隆抗體(中杉金橋)，基質(zhì)膠(BD)，DMSO(Amresco)，MTT(Sigma)，胎牛血清(EX cell)。Transwell-24膜嵌套TW小室(Corning)。

1.2動(dòng)物23～25 d雌性SD大鼠，斯貝福(北京)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物科技有限公司。許可證號(hào)：SCXK(京)2011-0004。

1.3藥物培育顆粒，首都醫(yī)科大學(xué)北京婦產(chǎn)醫(yī)院制劑，北京世紀(jì)壇醫(yī)院配制加工。地屈孕酮(達(dá)芙通)：雅培生產(chǎn)。

1.4儀器CO2培養(yǎng)箱(SANYO，MCO-18AIC)，超凈工作臺(tái)(北京亞泰隆實(shí)驗(yàn)技術(shù)中心，022-2522)，低溫離心機(jī)(SIGMA，3K15)，倒置顯微鏡(NIKON，TS100)，多功能熒光酶標(biāo)儀(TECAN，SAFIRE2)，流式細(xì)胞儀(BD，F(xiàn)ACS Canto II)。

2實(shí)驗(yàn)方法

2.1細(xì)胞培養(yǎng)取孕5～10周人工流產(chǎn)的正常胚胎的胎盤組織，洗凈血跡,收集絨毛并剪碎。用含有1%膠原酶Ⅰ和0.25%胰蛋白酶的Hank’s液消化，37 ℃，15 min，用與液消化同體積的20%胎牛血清的DMEN F12培養(yǎng)液終止消化，1 800 r/min室溫離心15 min,棄上清。20%胎牛血清的DMEN F12培養(yǎng)液制備制成細(xì)胞懸液，調(diào)整濃度為1 000～10 000 mL接種于培養(yǎng)皿中，37 ℃，5%CO2培養(yǎng)。24 h后觀察，部分細(xì)胞貼壁。

2.2滋養(yǎng)細(xì)胞純度鑒定吸盡培養(yǎng)液，Hank’s液清洗。加入4%多聚甲醛的溶液,固定48 h，PBS漂洗。0.5%Triton X-100 (DPBS新鮮配制)，室溫20 min，PBS漂洗。3%H2O2(蒸餾水新鮮配制)，室溫15 min，DPBS漂洗。免疫組化試劑盒中的血清封閉液，37 ℃，20 min,甩干封閉液。分別用含有鼠抗人細(xì)胞角蛋白7單克隆抗體和含有鼠抗人細(xì)胞波形蛋白單克隆抗體的一抗血清封閉液封閉，37 ℃，2 h，PBS漂洗。試劑盒中的生物素化孵育，37 ℃，20 min，PBS漂洗。SABC孵育，37 ℃，20 min，PBS漂洗。DAB顯色試劑1、2各50 μL，溶于900 μL PBS，避光顯色15 min，自來水沖洗。

2.3制備藥理血清將大鼠分組灌胃，地屈孕酮組，每次3 mg/kg。高劑量組，每次8 g/kg。中劑量組，每次4 g/kg。低劑量組，每次2 g/kg。對(duì)照組，蒸餾水，每次0.3 mL。每12 h灌胃1次，2次/d，3 d，第4天1次給全天量。1 h后取血，靜置1 h，3 000 r/min，離心10 min，取血清。0.22 μm微孔濾膜的一次性過濾器過濾除菌，分裝后-20 ℃保存。

2.4細(xì)胞分組培養(yǎng)取同一批傳代、相同密度、相同大小培養(yǎng)皿培養(yǎng)的細(xì)胞6組，吸盡20%胎牛血清DMEM F12培養(yǎng)液，Hank’s液清洗，加入無血清的DMEM F12培養(yǎng)液，培養(yǎng)12 h。其中5組分別加入20%大劑量組血清、20%中劑量組血清、20%小劑量組血清、20%地屈孕酮組血清、20%正常組血清，繼續(xù)培養(yǎng)48 h。

2.5Transwell小室侵襲實(shí)驗(yàn)在上室底鋪基質(zhì)膜，下室藥理血清濃度為20%，上室藥理血清濃度為15%，以保證藥理血清對(duì)細(xì)胞的營(yíng)養(yǎng)和特定作用，使下室細(xì)胞貼壁,用5%的血清濃度差保證細(xì)胞向營(yíng)養(yǎng)高的下室侵襲。作用48 h后，對(duì)下室與培養(yǎng)孔內(nèi)的細(xì)胞計(jì)數(shù)。

2.6MTT法檢測(cè)培育顆粒對(duì)人絨毛滋養(yǎng)細(xì)胞增殖活力的影響將細(xì)胞懸液接種于96孔培養(yǎng)板，37 ℃、5%CO2培養(yǎng)，至細(xì)胞全部貼壁。吸盡細(xì)胞液，Hank’s液清洗，加入無血清DMEM F12培養(yǎng)12 h。用各藥理血清分組處理，繼續(xù)培養(yǎng)48 h。加20 μL MTT溶液(5 mg/mL)，繼續(xù)孵育4 h。吸盡培養(yǎng)液，每孔加150 μL DMSO，震搖10 min，使紫色結(jié)晶物完全溶解。用多功能酶標(biāo)儀測(cè)定波長(zhǎng)為490 nm時(shí)吸光值。

2.7流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)培育顆粒對(duì)人絨毛滋養(yǎng)細(xì)胞PCNA表達(dá)的影響收集細(xì)胞,PBS清洗。加入600 μL PBS，制成懸液，加入4 ℃預(yù)冷的無水乙醇1 400 μL，4 ℃固定。24 h后2 000 r/min離心15 min，棄上清，PBS清洗。加1 800 μL PBS制成細(xì)胞懸液，再加入200 μL小牛血清，37 ℃孵育30 min，PBS清洗。含1%PCNA抗體的PBS液1 mL加入離心管重懸細(xì)胞，37 ℃孵育30 min，PBS清洗。每管加入0.5 mL PBS重懸細(xì)胞，上機(jī)檢測(cè)。

3實(shí)驗(yàn)結(jié)果

3.1人絨毛滋養(yǎng)細(xì)胞鑒定陽(yáng)性細(xì)胞表面為棕黃色,陰性細(xì)胞表面無色。細(xì)胞角蛋白7染色陽(yáng)性率大于90%，波形蛋白染色陰性率小于10%。表示所得細(xì)胞是絨毛滋養(yǎng)細(xì)胞。

3.2Transwell小室侵襲實(shí)驗(yàn)檢測(cè)培育顆粒對(duì)人絨毛滋養(yǎng)細(xì)胞侵襲功能的影響見表1。

組 別侵襲細(xì)胞數(shù)無血清組 0±0##培育顆粒低劑量組20.7±0.6# 培育顆粒中劑量組25.7±0.6# 培育顆粒高劑量組17.0±1.0# 對(duì)照組 12.3±0.6 地屈孕酮組 31.3±5.1#

注：與對(duì)照組比較，#P<0.05，##P<0.01

3.3MTT法檢測(cè)培育顆粒對(duì)人絨毛滋養(yǎng)細(xì)胞增殖功能的影響見表2。

組 別吸光度/A無血清組 0.110±0.005#培育顆粒低劑量組0.504±0.003#培育顆粒中劑量組0.557±0.008#培育顆粒高劑量組0.402±0.003#對(duì)照組 0.300±0.005 地屈孕酮組 0.603±0.008#

注：與對(duì)照組比較，#P<0.05

3.4流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)培育顆粒對(duì)人絨毛滋養(yǎng)細(xì)胞PCNA表達(dá)的影響見表3。

組 別PCNA陽(yáng)性率/%無血清組 4.0±0.6#培育顆粒低劑量組19.5±0.5#培育顆粒中劑量組28.2±0.4#培育顆粒高劑量組14.5±0.2#對(duì)照組 6.0±0.2 地屈孕酮組 28.3±0.4#

注：與對(duì)照組比較，#P<0.05

4討論

角蛋白是構(gòu)成上皮細(xì)胞骨架的蛋白，滋養(yǎng)層細(xì)胞是人胚胎絨毛組織中唯一的上皮細(xì)胞，而波形蛋白是內(nèi)皮細(xì)胞和間質(zhì)細(xì)胞的標(biāo)志蛋白，因此滋養(yǎng)層細(xì)胞表現(xiàn)為抗角蛋白染色陽(yáng)性、抗波形蛋白染色陰性[2-3]。不同類型細(xì)胞的角蛋白和廣譜的細(xì)胞角蛋白沒有滋養(yǎng)層細(xì)胞特異性，僅抗角蛋白7抗體對(duì)細(xì)胞滋養(yǎng)層細(xì)胞具有特異性，而且角蛋白7是唯一的不在間質(zhì)細(xì)胞中表達(dá)的角蛋白[4]。因此，滋養(yǎng)層細(xì)胞的純度鑒定可采用抗角蛋白7單克隆抗體和抗波形蛋白單克隆抗體來進(jìn)行。本實(shí)驗(yàn)角蛋白陽(yáng)性細(xì)胞90%以上,鑒定表明滋養(yǎng)細(xì)胞培養(yǎng)成功。

本實(shí)驗(yàn)采用血清藥理學(xué)[5]的方法研究培育顆粒組方對(duì)細(xì)胞的作用。由于中藥成分復(fù)雜，除了有效成分外，還有很多雜質(zhì)，藥物的酸堿度也會(huì)對(duì)體外實(shí)驗(yàn)的細(xì)胞產(chǎn)生影響。用含藥血清代替中藥粗提物作為藥物源，接近藥物在體內(nèi)作用環(huán)境[6]?，F(xiàn)代藥理研究表明，補(bǔ)腎益氣保胎中藥可提高小鼠血清孕激素含量[7]。有研究報(bào)道，補(bǔ)腎中藥具有提高患者血中孕酮含量的作用[8]。根據(jù)前期臨床實(shí)驗(yàn)，培育顆粒可提高患者血清HCG值、孕酮值[1]。

Transwell小室的上下室間以膜孔直徑為8.0 μm的聚碳酸酯膜相隔。在聚碳酸酯膜上室側(cè)鋪一層基質(zhì)膠，模仿體內(nèi)的細(xì)胞外基質(zhì)，上室細(xì)胞要通過聚碳酸酯膜進(jìn)入營(yíng)養(yǎng)成分較高的下室，必須先分泌基質(zhì)金屬蛋白酶將基質(zhì)膠溶解。計(jì)數(shù)進(jìn)入下室的細(xì)胞數(shù)量，可反映細(xì)胞的侵襲能力[9]。有研究表明，補(bǔ)腎中藥可增強(qiáng)滋養(yǎng)細(xì)胞侵襲功能[10]。本研究中，培育顆粒各組血清對(duì)滋養(yǎng)細(xì)胞的侵襲均有促進(jìn)作用，地屈孕酮組作用最強(qiáng)。培育顆粒各組中，中劑量組作用最強(qiáng)，高劑量組作用較中劑量組減弱，可能與負(fù)反饋調(diào)節(jié)有關(guān)。

活細(xì)胞線粒體中的琥珀酸脫氫酶使外源性MTT還原成不溶于水的藍(lán)紫色結(jié)晶甲瓚,數(shù)量與活細(xì)胞數(shù)成正比，二甲基亞砜(DMSO)可以溶解細(xì)胞中的甲瓚。在490 nm波長(zhǎng)處，用酶標(biāo)儀測(cè)定其光吸收值(A),可間接反映活細(xì)胞的數(shù)量[11]。本研究中，培育顆粒各血清對(duì)滋養(yǎng)細(xì)胞的均有促進(jìn)增殖作用。培育顆粒各組中，中劑量組作用最強(qiáng)，高劑量組作用較中劑量組減弱，可能與負(fù)反饋調(diào)節(jié)有關(guān)。

PCNA陽(yáng)性的細(xì)胞率可作為細(xì)胞增殖程度的指標(biāo)。有研究表明，自然流產(chǎn)患者滋養(yǎng)細(xì)胞PCNA表達(dá)降低[12-13]。本研究中，培育顆粒組各血清對(duì)滋養(yǎng)細(xì)胞均有促使PCNA表達(dá)增加的作用。培育顆粒各組中，中劑量組作用最強(qiáng)，高劑量組作用較中劑量組減弱，可能與負(fù)反饋調(diào)節(jié)導(dǎo)致體內(nèi)相關(guān)活性物質(zhì)減少有關(guān)。本研究表明，培育顆?？赏ㄟ^增強(qiáng)人絨毛滋養(yǎng)細(xì)胞的侵襲與增殖能力，對(duì)防治妊娠早期自然流產(chǎn)起到一定的作用，其機(jī)制除提高患者血清HCG值、孕酮值，可能還與體內(nèi)其他途徑相關(guān)。