高血壓肝火亢盛證動物模型生物學基礎研究

劉楊

(山東中醫(yī)藥大學附屬醫(yī)院心內(nèi)科，濟南 250014)

摘要：目的研究高血壓肝火亢盛證動物模型的生物學基礎。方法Wistar和自發(fā)性高血壓大鼠(spontaneously hypertensive rats，SHR)各20只，分別設為Wistar組和SHR組,觀察2組大鼠的宏觀表征、行為學及血壓變化，用免疫組化法及Elisa測定大鼠腦內(nèi)及血清中的NE含量。根據(jù)大鼠臨床證候診斷標準對動物表征的證候屬性進行判斷。結果2組大鼠收縮壓均會隨著周齡增加而增加，SHR大鼠在各周齡明顯高于Wistar大鼠，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；SHR大鼠隨著周齡增加其易激怒的評分會逐漸增加，旋轉耐受時間會隨著周齡的增加而減少，而Wistar大鼠評分波動幅度及旋轉耐受時間波動幅度不明顯，2組大鼠不同時間易激怒評分差異和旋轉耐受時間差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；隨著周齡的增加，2組大鼠5-HT在逐漸減小，NE在逐漸增加，SHR變化幅度明顯大于Wistar，2組差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。結論SRH大鼠在14～18周齡為肝火亢盛證的穩(wěn)定期，和大鼠血液和腦內(nèi)NE的含量有很大關系，可作為SHR肝火亢盛證的客觀指標。

關鍵詞：肝火亢盛證；自發(fā)性高血壓大鼠；生物學基礎

DOI:10.13463/j.cnki.jlzyy.2015.10.024

中圖分類號：R259文獻標志碼： A

文章編號：1003-5699(2015)10-1049-04

基金項目:山東省科技發(fā)展計劃項目(2014GSF119011);山東省中醫(yī)藥科技發(fā)展計劃(2013ZDZK-018);山東省中醫(yī)藥科技發(fā)展計劃(2011-083)。

作者簡介:劉楊(1981-)，男，碩士，主治醫(yī)師，主要從事中醫(yī)治療心血管疾病療效評價的研究。

收稿日期:(責任編輯:趙玉芝2015-07-07)

Biological base of anger hyperactivity hypertension animal model

LIU Yang

(Department of Cardiology,The Affiliated Hospital of Shandong University of Traditional Chinese Medicine,

Ji’nan 250014,China)

Abstract:ObjectiveTo study the biological basis of hyperactivity hypertension anger animal model.MethodsDynamic acquisition of Wistar and spontaneously hypertensive rats (spontaneously hypertensive rats,SHR),each with 20,were set Wistar group and SHR group,observed macroscopic characterization,behavior and changes in blood pressure of two groups rats,determinate NE content in brain and rat serum by immunohistochemistry Elisa.Judgment of animal attributes characterizing based on clinical symptoms in rats standards.ResultsThe two groups SBP increases with weeks,SHR rats was significantly higher than in the week-old Wistar rats,the difference was statistically significant (P<0.05);SHR rats with weeks increase irritability ratings will gradually increase,the rotation time will increase tolerance and reduce weeks of age,and Wistar rats rates fluctuations and volatility is not obvious rotation endurance time,two groups of rats at different times irritability rating differences and rotation endurance time was significantly (P<0.05);With the increase of weeks old,5-HT in the two groups were gradually reduced,NE gradually increased,SHR change was greater than that Wistar,groups the difference was statistically significant (P<0.05).ConclusionSRH rats 14-18 weeks of anger hyperactivity stabilization period,and the content of the NE of blood and brain in rats have a great relationship,as an objective indicator of SHR anger hyperactivity.

Keywords:anger hyperactivity;spontaneously hypertensive rats;biological basis

原發(fā)性高血壓會引起機體心腦血管等形成器質性的損害，導致腦卒中、心腎衰竭、冠心病等的出現(xiàn)，在臨床上有高致殘率和高致死率的特點。根據(jù)人類疾病來建立動物模型可有效的闡述疾病發(fā)病機理，并對人類疾病進行有效的預防和診斷，對治療方法的研究有很大的應用價值，結合病癥和動物模型可為中醫(yī)基礎和臨床提供良好的橋梁作用，其穩(wěn)定情況是進行中醫(yī)研究重要的前提條件[1-2]。自發(fā)性高血壓大鼠(SHR)動物模型和人類的原發(fā)性高血壓有被國際公認的極相似的發(fā)病機制。有研究結果顯示[3]，SHR體征、癥狀、器官及組織學病理和生化指標等都會隨著大鼠周齡的增加而發(fā)生相應的變化，然而目前關于自發(fā)性高血壓的中醫(yī)證候時間屬性的研究還有待完善。有課題研究顯示[4],將臨床病癥和模型相結合，以臨床疾病模型為基礎，可以取得良好的穩(wěn)定性和可靠性,在SHR模型中加入時間觀理念，對模型證候出現(xiàn)的具體時間有很好的把控，可體現(xiàn)中醫(yī)證動態(tài)性和階段性。此次研究通過觀察不同周齡SHR及Wistar的微觀指標、宏觀表征、行為學以及血液大腦中的NE含量變化,進而探討SHR的穩(wěn)定證候時間，以及和微觀指標的關聯(lián)，最終為臨床自發(fā)性高血壓診斷治療提供依據(jù)。

1材料和方法

1.1一般資料選擇20只SHR，均為8周齡大小，雄性，20只SHR血壓均在150～172 mmHg之間;另選京都種的Wistar大鼠20只均為8周齡大小，雄性，每只血壓均在95～115 mmHg之間，屬于清潔級(購自深圳衛(wèi)華實驗動物技術有限公司；許可證編號：SCXK(深)2008～2011)。大鼠均進行常規(guī)喂養(yǎng)，室內(nèi)空氣過濾，正壓通氣，人工光照明暗各12 h(7 am～7 pm)，恒溫(23±2) ℃，恒濕(50%±10%)。所有實驗動物研究全部符合國家《實驗動物管理條例》和《山東省實施〈實驗動物管理條例〉辦法》。第1周時間為適應性觀察,主要通過血壓測量、宏觀表征采集以及行為學的實驗訓練來選擇并篩除差異比較大的個體。

1.2方法主要儀器：采用日本BP-A無創(chuàng)測壓儀對大鼠尾動脈進行測量，深圳D-SB平衡旋轉儀測量大鼠對旋轉的耐受時間，NE則采用Elisa試劑盒進行測量，產(chǎn)自上海;一抗是小鼠抗大鼠的NE單克隆抗體，上海華天制藥有限公司提供；二抗是通用型，上海基因科技有限公司研制生產(chǎn)。

采用日本BP-A無創(chuàng)尾動脈測壓儀對處于安靜狀態(tài)下的大鼠進行血壓的測量。測量前連接好儀器，熱泵處于開啟狀態(tài)，熱泵溫度最好控制在36～36.5 ℃，并用固定器將大鼠固定在儀器中，預熱時間為10 min，過程嚴格按照測量儀使用說明書進行嚴格的規(guī)范操作，以保證取得更加正確的安靜狀態(tài)下的尾壓，進行3次連續(xù)測量,最后取其平均值，在正式的血壓測量前，每天應進行血壓測試的訓練，1次/d，連續(xù)進行7 d測量。

對大鼠的宏觀表征進行動態(tài)采集，主要包括大鼠的活動度、精神狀態(tài)、抓取的反抗性等一般狀態(tài)，舌苔顏色、光澤度，爪、耳朵血管的充盈程度，毛色、光澤度，大小便的質地、顏色和排便時間等。此外，對大鼠的易激怒情況進行分級和評分，觀察不同時間段大鼠的情緒變化。

將D-SB平衡旋轉儀改進后，對大鼠的平衡耐受時間進行測量，把大鼠安置在轉速為60 r/min的旋轉平臺之上，觀察大鼠自旋轉到跌落平臺的時間并進行記錄，2 min后，若大鼠仍然在平臺上，就停止測試,所有大鼠的測試時間統(tǒng)一規(guī)定在上午8點-10點。于第8周齡、10周齡、14周齡及18周齡對大鼠血清中的NE進行Elisa測量。采用免疫組織的化學法進行大鼠腦組織NE的測量，備用石蠟的切片要進行預熱和脫蠟水化，使用二步法對大鼠腦部NE進行檢測：預熱后進行脫蠟，酒精的梯度脫水，6 min微波修復，切片冷卻后，用0.3%的H2O2進行15 min孵育，5 min PBS沖洗需進行3次，加入NE一抗，孵育溫度為4 ℃，連夜孵育；加入辣根過氧化物酶標記過的二抗，30～40 min孵育，溫度恒溫下37 ℃，DAB進行顯色，復染使用蘇木素，隨后進行脫水和透明,中性的樹膠封片。采用PBS對陰性對照代替一抗來進行孵育，剩余步驟同前。在第12周齡、18周齡取大鼠血液5 mL，放置在真空采血管中，1～2 h溫室放置，4 ℃下15 min的離心作業(yè)，3 000 r/min。

1.3觀察指標觀察不同時間大鼠的收縮壓，根據(jù)易激怒分級對大鼠易激怒癥狀進行評分，觀察大鼠掉落平臺時間來判斷大鼠的旋轉耐受時間。參照文獻對大鼠的易激怒分級和評分進行觀察[5]：Ⅰ級：捉持大鼠頸部時，大鼠有驚跳、尖叫和躲避的現(xiàn)象，記1分；Ⅱ級：捉持大鼠頸部時，大鼠有咬人現(xiàn)象，記2分；Ⅲ級:提尾時，大鼠有尖叫和驚跳現(xiàn)象，且咬人，同籠打鬧現(xiàn)象嚴重，記3分；沒有上述情況的大鼠為無情況者，記0分。

2結果

2.1大鼠在不同時間的收縮壓比較2組大鼠收縮壓均會隨著周齡增加而增加，但是SHR大鼠在各周齡的收縮壓均明顯高于Wistar大鼠，2組大鼠在不同周齡收縮壓比較差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，見表1。

mmHg

2.2大鼠在不同時間的易激怒程度評分SHR大鼠隨著周齡增加其易激怒的評分會逐漸增加，而Wistar大鼠評分波動幅度不明顯,2組大鼠在不同時間易激怒評分比較差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，見表2。

分

2.3大鼠在不同時間的旋轉耐受時間SHR大鼠的旋轉耐受時間會隨著周齡的增加而減少,而Wistar大鼠的旋轉耐受時間波動幅度不明顯,2組大鼠不同周齡的旋轉耐受時間差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，見表3。

s

2.4大鼠在不同時間血清5-HT、NE比較較12周齡而言,2組大鼠在18周齡的5-HT均有所減小，NE均有所增加，2組大鼠5-HT、NE差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；且隨著周齡的增加，2組大鼠5-HT在逐漸減小，SHR減小更加明顯,SHR前后差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；而2組NE在逐漸增加，2組前后NE差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，見表4。

3討論

人類疾病的動物模型建立能明確的闡述發(fā)病機理，對疾病的預防、診斷及治療有非常重要的使用價值，將病癥和動物模型相結合是醫(yī)學研究的一個重要項目，如何制定可靠穩(wěn)定的病癥動物模型結合是中醫(yī)

表4　大鼠在不同時間血清5-HT、NE比較 　μg/L

研究中重要的一步[6]。辨證論證被認為是中醫(yī)治療中的一個基本原則，將病癥相結合又是辨證施治當中的關鍵，所以動物模型和病癥的結合就自然而然的成為了臨床和中醫(yī)基礎研究之間的重要橋梁。較理想的病癥和動物模型的結合應該具備以下幾個特點：1)和人類疾病有相應的類似點，對人類疾病變化有再體現(xiàn)作用；2)對人類疾病及某種代謝、機能和組織結構的變化有較可靠和特異性的反應；3)同時該模型應該有人類疾病臨床的主要癥狀，并且能夠經(jīng)得起一系列的檢驗和證實。原發(fā)性高血壓可引起人類心、腦、腎等器官的損害，導致冠心病、腦卒中和心、腎衰竭等疾病的發(fā)生，在臨床上有高致殘率、高死亡率的特點，對人類生活健康帶來了很大的威脅[7-8]。

西醫(yī)臨床認為，高血壓的發(fā)病機制中大鼠的交感神經(jīng)系統(tǒng)有很強的活性、水鈉儲留以及大鼠血管內(nèi)皮功能的障礙等特點。有研究顯示[9-10]，隨著大鼠周齡的增加,血壓會出現(xiàn)相應的改變，SHR大鼠在8～18周齡期間，其血壓會持續(xù)上升，在我們研究中也有同樣的現(xiàn)象，SHR的血壓從8周齡時的(165.22±8.73) mmHg上升到18周齡的(192.35±10.47) mmHg，變化非常明顯，而Wistar大鼠的血壓沒有大幅度的波動現(xiàn)象。隨著大鼠周齡的增加，其宏觀表征及行為會出現(xiàn)明顯的變化，而這些變化和NE含量的變化存在明顯的關系，宏觀表征中相對應的臨床癥狀的易激怒評分在第18周齡時達到了(2.89±0.79)分，明顯高于Wistar大鼠(0.26±0.02)分的易激怒評分，而相對應SHR的NE高達(42.94±5.04) μg/L，Wistar大鼠NE僅為(21.36±9.25) μg/L。此外，SHR臨床表現(xiàn)目赤、面赤、口干舌燥、耳爪部的血管數(shù)量在增加，充盈度也在持續(xù)增長，這些和隨著大鼠周齡增加而增加的NE有明顯的關系。有研究顯示[11-12]，腦內(nèi)NE保持動態(tài)的平衡和情緒變化之間有密切的關系，腦中NE增加會造成痛閾下降引起頭痛,相繼的出現(xiàn)躁狂、煩躁易怒、有攻擊意向等。SHR的NE明顯高于Wistar大鼠可能是因為肝火亢盛所導致的煩躁、易怒、頭痛等癥狀的重要機制。因此，血壓、大腦中NE升高可能是引發(fā)高血壓肝火亢盛證的重要生物學基礎，在今后臨床研究中應互相映證，為臨床上高血壓肝火亢盛尋找更加準確可靠的依據(jù)。

總之，高血壓肝火亢盛的發(fā)病機理和發(fā)展進程和血管中活性物質NE有很大關系，建立動物模型為進一步觀察證候生物學基礎提供良好的依據(jù)。

參考文獻：

[1]徐林.人類疾病的動物模型[J].動物學研究,2011,32(1):1-3.

[2]賈佼佼,白明,苗明三.基于腦缺血臨床病癥特點的動物模型分析[J].中藥新藥與臨床藥理,2015,26(3):416-419.

[3]沈智潔,張志輝,楊侃.高血壓實驗動物模型的研究進展[J].中國循環(huán)雜志,2014,29(3):232-234.

[4]SHAO W H,CHEN J J,FAN S H,et al.Combined metabolomics and proteomics analysis of major depression in an?animal model perturbed energy metabolism in the chronic mild stressed rat cerebellum[J].OMICS-A Journal of Integrative Biology,2015,19(7):383-392.

[5]薛曉興,李玉波,廉洪建,等.高血壓肝火亢盛證動物模型相關指標的研究[J].中國實驗方劑學雜志,2015,21(8):97-101.

[6]顏琳琳,周利紅,李琦.中醫(yī)血瘀證動物模型研究概況[J].中醫(yī)雜志,2014,55(3):255-258.

[7]張振服,劉啟德,楊蕾,等.高血壓肝陽上亢證大鼠模型的血壓節(jié)律特征及機理研究[J].中藥新藥與臨床藥理,2011,22(2):172-175.

[8]袁麗粉,杜勤,陸平,等.高血壓合并動脈粥樣硬化大鼠模型的建立[J].實用醫(yī)學雜志,2011,27(23):4197-4199.

[9]江虎軍,馮鋒,董爾丹.模式動物與人類疾病的動物模型[J].生命科學,2011,23(3):234-238.

[10]蔣嘉燁,羅珊珊,栗源,等.SHR高血壓進程中腎臟蛋白表達譜的變化[J].中國藥理學通報,2012,28(2):189-194.

[11]李虹,楊慧宇,肖傳實,等.不同周齡自發(fā)性高血壓大鼠動態(tài)血壓變化及阻力血管形態(tài)學研究[J].中國動脈硬化雜志,2011,27(3):245.

[12]楊曉紅.交感神經(jīng)系統(tǒng)與高血壓的研究進展[J].心血管病學進展,2013,34(5):641-643.