補(bǔ)骨脂素對胃癌細(xì)胞株BGC-803增殖和凋亡的影響及其機(jī)制

閆偉偉1,3,章永紅1,劉軍樓1*,吳堅2,鄒璽2,劉沈林2,楊繼兵1,于希忠1

(1.南京中醫(yī)藥大學(xué),南京 210023;2.南京中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院,南京210029;

3.南陽市第一人民醫(yī)院,南陽 473010)

摘要：目的研究補(bǔ)骨脂素對人胃癌BGC-803細(xì)胞的增殖和凋亡的影響并探討其機(jī)制。方法以不同濃度的補(bǔ)骨脂素作用于體外培養(yǎng)的胃癌細(xì)胞BGC-803，不同時間后，采用MTT法檢測藥物對腫瘤細(xì)胞生長抑制率，流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡率,激光共聚焦顯微鏡觀察F-actin形態(tài)學(xué)變化。結(jié)果補(bǔ)骨脂素對人胃癌細(xì)胞株BGC-803具有明顯的生長抑制作用，并與藥物劑量及處理時間成正相關(guān)。補(bǔ)骨脂素作用于細(xì)胞24、48、72 h后的IC50分別為92.6、25.54、7.68 μg/mL。流式細(xì)胞儀檢測結(jié)果顯示給藥組早期凋亡的百分率顯著高于對照組，細(xì)胞骨架蛋白F-actin呈現(xiàn)解聚狀態(tài)。結(jié)論：補(bǔ)骨脂素可抑制胃癌BGC-803細(xì)胞增殖，誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡，其機(jī)制可能是藥物引起了細(xì)胞骨架蛋白F-actin解聚。

關(guān)鍵詞：補(bǔ)骨脂素；胃癌；抑制增殖；細(xì)胞凋亡；細(xì)胞骨架蛋白

DOI:10.13463/j.cnki.jlzyy.2015.10.028

中圖分類號：R285.5文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A

文章編號：1003-5699(2015)10-1064-04

基金項目:江蘇高校優(yōu)勢學(xué)科建設(shè)工程(中西醫(yī)結(jié)合)資助項目(PAPD)；江蘇省中醫(yī)藥局課題資助項目(JD11038)。

作者簡介:閆偉偉(1988-)，男，2012級碩士研究生，主要從事中醫(yī)腫瘤病學(xué)研究。

收稿日期:(責(zé)任編輯：趙玉芝2015-03-30)

*通信作者:劉軍樓，電話-13585148565，電子信箱-liujunlou1975@126.com

Psoralen on proliferation and apoptosis of gastric cancer cell line BGC-803 and its mechanism

YAN Weiwei1,3,ZHANG Yonghong1,LIU Junlou1,WU Jian2,ZOU Xi2,LIU Shenlin2,YANG Jibing1,YU Xizhong1

(1.Nanjing University of Chinese Medicine,Nanjing 210023,China;

2.The First Hospital Affiliated to Nanjing University of Chinese Medicine,Nanjing 210029,China;

3.The First People's Hospital of Nanyang,Nanyang 473010,Henan Province,China)

Abstract:ObjectiveThis experiment aims at observing the inhibition effects of Psoralen and apoptosis on human gastric carcinoma BGC-803 cells,discusses the possible mechanisms.MethodsBGC-803 cells in culture medium were treated with different concentrations of Psoralen.After different time period,the inhibitory rate of the cells was measured by MTT assay.Cell apoptotic rate was detected by flow cytometry (FCM).The morphological changes of F-actin were observed by laser confocal microscopy.ResultsThe growth of human gastric carcinoma BGC-803 cells was significantly inhibited by Psoralen,as the concentration increasing and the work time extending,the inhibition grows,which could be concluded as time-dose dependence.IC50 of Psoralen was respectively 92.6,25.54,7.68 μg/mL after 24 hours,48 hours,72 hours.The early apoptotic rate of BGC-803 cells was significantly higher than the control group’s.F-actin cytoskeletal protein was showed from polymerization to depolymerization after Psoralen treatment.ConclusionPsoralen can obviously inhibit the proliferation and induce apoptosis of BGC-803 cells.The mechanisms may involve the depolymerization of F-actin after treatment with Psoralen.

Keywords:psoralen;gastric carcinoma;antiproliferation;apoptosis;cytoskeletal protein

胃癌是嚴(yán)重威脅人類健康的重大疾病之一，發(fā)病率及死亡率逐年增加，對社會及家庭帶來了沉重的壓力及負(fù)擔(dān)[1-5]。中醫(yī)藥治療惡性腫瘤毒副作用低且療效顯著，對防治胃癌有較大的潛力與優(yōu)勢。中藥補(bǔ)骨脂為豆科植物，性辛、苦、溫，入腎、脾經(jīng)，具有補(bǔ)腎壯陽，納氣平喘，暖脾止瀉等作用，主要用于治療腎虛陽痿、腰膝冷痛、脾腎陽虛之五更泄瀉等?，F(xiàn)代研究發(fā)現(xiàn),補(bǔ)骨脂主要提取物之一補(bǔ)骨脂素(Psoralen)對JB6皮膚癌細(xì)胞株、膀胱癌細(xì)胞株、肝癌細(xì)胞株、人乳腺癌細(xì)胞株等多種腫瘤細(xì)胞均有明顯的生長抑制作用[6-7]。鮮見文獻(xiàn)報道補(bǔ)骨脂素對胃癌細(xì)胞有抑制作用，但對其作用機(jī)制尚無文獻(xiàn)報道，也未見補(bǔ)骨脂素作用于細(xì)胞骨架蛋白的研究報道。本文研究補(bǔ)骨脂素對人胃癌BGC-803細(xì)胞的增殖、凋亡及細(xì)胞骨架蛋白F-actin的影響，探究其可能機(jī)制，為其進(jìn)一步應(yīng)用于臨床治療胃癌提供有力的實驗依據(jù)。

1材料和方法

1.1實驗藥物及細(xì)胞株補(bǔ)骨脂素購自澤朗醫(yī)藥科技有限公司(純度≥98%)；人胃癌BGC-803細(xì)胞株由江蘇省中醫(yī)院腫瘤內(nèi)科實驗中心惠贈。BGC-803細(xì)胞用含10%小牛血清的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)于25 mL塑料培養(yǎng)瓶中，37 ℃，體積分?jǐn)?shù)為5%CO2培養(yǎng)箱常規(guī)培養(yǎng)。補(bǔ)骨脂素用DMSO溶解后加入三蒸水，配制成含10% DMSO濃度為100 mmol/L的母液，-4 ℃保存，應(yīng)用時加培養(yǎng)基稀釋成目標(biāo)濃度(DMSO的終濃度≤0.01%，無明顯細(xì)胞毒作用)。

1.2實驗試劑小牛血清(杭州四季青)；DMEM高糖培養(yǎng)基(賽默飛世爾);胰蛋白酶+EDTA、MTT試劑盒(凱基生物)；Annexin V-FITC細(xì)胞凋亡檢測試劑盒(BD)；DMSO(Sigma)：CytoPainter Phalloidin-iFluor 594 Reagent (Abcam)。

1.3主要儀器設(shè)備MCO-20A IC二氧化碳培養(yǎng)箱(SANYO)，超凈工作臺，MDF-382超低溫冰箱(SANYO)，IX50型倒置顯微鏡(Olympus)，Biophometer分光光度計(EPPENDORF)，5417型低溫高速離心機(jī)(EPPENDORF)，F(xiàn)ACScan型流式細(xì)胞儀(Becton Dickinson)，激光共聚焦顯微鏡(Leica)等。

1.4實驗方法

1.4.1細(xì)胞增殖抑制率的測定(MTT法)采用噻唑藍(lán)(MTT)還原法進(jìn)行檢測：取對數(shù)生長期BGC-803細(xì)胞，用培養(yǎng)基將細(xì)胞稀釋至最終濃度為0.4×105/mL,然后混合均勻以每孔100 μL接種于無菌的96孔培養(yǎng)板中，繼續(xù)培養(yǎng)12 h后待細(xì)胞完全貼壁，移除上清液，分別加入含100、50、25、12.5、6.25 μg/mL補(bǔ)骨脂素的DMEM培養(yǎng)基100 μL，每種濃度均設(shè)6個平行孔；對照組加入不含藥物的DMEM培養(yǎng)基100 μL。繼續(xù)將培養(yǎng)板置于孵箱中分別培養(yǎng)至24、48、72 h后，于終止培養(yǎng)前4 h，分別向各孔均加入5 mg/mL MTT溶液20 μL，然后放至孵箱內(nèi)繼續(xù)培養(yǎng)4 h后棄上清液，各孔加入DMS0 150 μL后將培養(yǎng)板避光置于振蕩器上振蕩5～10 min溶解藍(lán)色結(jié)晶,以酶標(biāo)儀于550 nm處讀取各孔吸光度值(A550)，計算細(xì)胞生長抑制率與IC50。細(xì)胞生長抑制率(%)=[對照組A值—實驗組A值]/對照組A值×100%。實驗重復(fù)3次。

1.4.2流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡取對數(shù)生長期細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞濃度為1×105/mL，然后混合均勻，按每孔2 mL接種于無菌的六孔板中。培養(yǎng)12 h后待細(xì)胞完全貼壁后移除上清液，分別加入含50、30、25、20 μg/mL補(bǔ)骨脂素的DMEM培養(yǎng)基2 mL，空白對照組加入不含藥物的DMEM培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)。藥物處理細(xì)胞48 h終止培養(yǎng)，棄上清液，加入含EDTE的胰酶0.5 mL消化3 min后，加入含小牛血清的DMEM培養(yǎng)液終止消化，并用移液器將細(xì)胞移至10 mL離心管內(nèi)，以1 000 r/min，5 min離心后移除上清液，向試管內(nèi)加入500 μL Binding Buffer輕輕吹打，使細(xì)胞重懸均勻，然后加入5 μL PI試劑和5 μL Annexin V-FITC試劑，混勻后避光孵育15 min，然后用流式細(xì)胞儀檢測。

1.4.3免疫熒光顯微鏡下觀察補(bǔ)骨脂素對BGC -803細(xì)胞骨架結(jié)構(gòu)的影響具體操作步驟為：1)細(xì)胞爬片：將蓋玻片清洗后高溫滅菌，烘干后平放到六孔板內(nèi)，將BGC-803細(xì)胞用含10%小牛血清的DMEM培養(yǎng)液在37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng),待細(xì)胞生長良好進(jìn)入對數(shù)期后收集細(xì)胞，用DMEM培養(yǎng)液將細(xì)胞稀釋，利用細(xì)胞計數(shù)板在顯微鏡下計數(shù)，直到細(xì)胞濃度為1×105/mL，然后混合均勻,按每孔2 mL接種于無菌的六孔板中。培養(yǎng)12 h后待細(xì)胞完全貼壁，移除上清液，PBS清洗3次后分別加入含50、30、25、20 μg/mL補(bǔ)骨脂素的DMEM培養(yǎng)基2 mL,空白對照組加入不含藥物的DMEM培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)。2)細(xì)胞固定：藥物處理細(xì)胞48 h后停止培養(yǎng),用PBS漂洗3次，然后向蓋玻片上滴加4%的多聚甲醛200 μL，將六孔板放至冰上固定30 min后，用PBS漂洗3次，然后用棉簽吸除蓋玻片周圍的水份，加入0.1% Triton 100 μL，以覆蓋蓋玻片為度，靜置5 min后用PBS再漂洗3次。3)染色：加入100 μL 1×Phalloidin工作液室溫放置90 min，常溫下PBS漂洗3次后于熒光顯微鏡上觀察并攝影。

2結(jié)果

2.1補(bǔ)骨脂素對BGC-803細(xì)胞的生長抑制作用不同濃度的補(bǔ)骨脂素(6.25～100 μg/mL)分別作用于BGC-803細(xì)胞24、48、72 h，與對照組比較，結(jié)果顯示:補(bǔ)骨脂素對人胃癌細(xì)胞株BGC-803的增殖有明顯的抑制作用，并有時間及濃度的依賴性。隨著藥物濃度的遞增及處理時間的增加，其對細(xì)胞的抑制率也顯著上升(P<0.01)；在處理時間相同的情況下,當(dāng)藥物濃度達(dá)到100 μg/mL時，對BGC-803細(xì)胞的抑制作用達(dá)到最強(qiáng)。結(jié)果見表1,根據(jù)公式分別計算出補(bǔ)骨脂素作用人胃癌細(xì)胞株BGC-803 24、48、72 h后各自IC50值，結(jié)果見表2。

表1　補(bǔ)骨脂素對人胃癌細(xì)胞株BGC-803的抑制率 ± s)

注：和對照組相比，#P<0.05,##P<0.01

表2　不同時間補(bǔ)骨脂素作用于人胃癌細(xì)胞株BGC-803的IC 50值μg/mL

2.2流式細(xì)胞儀檢測補(bǔ)骨脂素對人胃癌BGC-803細(xì)胞的凋亡比率以50、30、25、20 μg/mL的補(bǔ)骨脂素作用于BGC-803細(xì)胞48 h后，用流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡情況，藥物濃度為20 μg/mL時，早期凋亡率達(dá)到8.34%；并且隨著藥物濃度的增加，早期凋亡率由8.34%，分別增加至9.47%、28.13%和60.16%。與空白對照組3.11%相比，均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。

2.3激光共聚焦顯微鏡觀察細(xì)胞骨架蛋白F-actin的形態(tài)學(xué)變化細(xì)胞經(jīng)藥物處理48 h后可見：同等培養(yǎng)條件下，鬼筆環(huán)肽(phalloidin)能和細(xì)胞的纖維肌動蛋白F-actin特異性的結(jié)合，由FITC-phalloidin標(biāo)記的細(xì)胞F-actin呈橘紅色熒光，空白對照組細(xì)胞生長狀態(tài)良好，周圍生有多個偽足，細(xì)胞大致呈梭形或者多邊形生長，細(xì)胞內(nèi)骨架清晰完整，染色均勻，呈網(wǎng)狀分布，緊密地排列在細(xì)胞核周圍及細(xì)胞膜內(nèi)側(cè)，并可見細(xì)胞內(nèi)大量骨架蛋白從細(xì)胞膜一側(cè)貫穿至另一側(cè)，與細(xì)胞質(zhì)緊密相連,排列整齊有序。而分別經(jīng)濃度為25、30、50 μg/mL補(bǔ)骨脂素處理后的細(xì)胞，鏡下可見細(xì)胞周圍偽足數(shù)目明顯減少，呈蜷縮狀態(tài)。細(xì)胞內(nèi)骨架蛋白排列紊亂，熒光染色較淺，表明骨架蛋白數(shù)量較少，排列雜亂無章，并且細(xì)胞質(zhì)之間無相連骨架蛋白，且細(xì)胞骨架蛋白排列隨著藥物濃度的增加越來越紊亂，數(shù)量也越來越少，與未加藥物組相比，明顯出現(xiàn)了細(xì)胞骨架的解聚。

3討論

目前胃癌的治療主要以手術(shù)及放化療為主，手術(shù)是胃癌根治的主要途徑，但是關(guān)于術(shù)后的復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移、病人體質(zhì)的恢復(fù)及放化療后的毒副反應(yīng)的耐受程度，西醫(yī)對癥處理療效仍不理想。近些年關(guān)于中醫(yī)藥抗腫瘤的研究取得了巨大的進(jìn)展，并且在中醫(yī)藥的復(fù)方及單味藥的研究方面取得了豐富的經(jīng)驗。

本實驗以胃癌細(xì)胞株BGC-803為研究對象，應(yīng)用多種方法觀察補(bǔ)骨脂素對腫瘤細(xì)胞的影響。結(jié)果顯示，補(bǔ)骨脂素能夠抑制胃癌細(xì)胞的增殖并且藥物劑量和作用時間呈正相關(guān)；進(jìn)一步觀察補(bǔ)骨脂素對胃癌細(xì)胞凋亡的影響，發(fā)現(xiàn)給藥組早期凋亡的百分率顯著高于對照組，證實其能夠誘導(dǎo)細(xì)胞的凋亡，說明其抑制腫瘤細(xì)胞增殖作用可能與誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡有關(guān)。

細(xì)胞骨架是細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)成分組成的網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)，包括微管、微絲和中間纖維。微絲是3種骨架結(jié)構(gòu)中最細(xì)的，主要由actin組成，以游離球狀actin(G-actin)或聚合纖維狀actin(F-actin)形式存在。RAO J等[8]研究表明，actin聚合/解聚狀態(tài)的改變，即actin骨架重組，對惡性腫瘤細(xì)胞的形態(tài)和表型有非常重要的調(diào)節(jié)作用,認(rèn)為干預(yù)細(xì)胞骨架微絲actin重組可作為抗癌藥物的作用靶點，也可作為研發(fā)新的抗腫瘤藥物的依據(jù)。本實驗通過F-actin抗體免疫熒光染色法觀察Psoralen對腫瘤細(xì)胞骨架蛋白影響，研究結(jié)果提示藥物干預(yù)后引起了F-actin聚合/解聚狀態(tài)的改變，主要可能是藥物引起了F-actin解聚,導(dǎo)致F-actin相對減少而G-actin相對增加，從而呈現(xiàn)細(xì)胞內(nèi)骨架蛋白排列紊亂，細(xì)胞質(zhì)熒光染色減弱。

大量的研究證明，補(bǔ)骨脂素對多種腫瘤細(xì)胞的生長都有抑制作用，其主要機(jī)制包括影響細(xì)胞的DNA合成、誘導(dǎo)細(xì)胞產(chǎn)生凋亡、阻滯細(xì)胞周期、抑制腫瘤血管生成、預(yù)防腫瘤轉(zhuǎn)移等。目前尚無補(bǔ)骨脂素誘導(dǎo)胃癌細(xì)胞凋亡機(jī)制的報道。細(xì)胞凋亡時actin細(xì)絲發(fā)生斷裂，actin網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)遭到破壞，這是細(xì)胞凋亡時形態(tài)改變的一個典型特征，那么通過改變這一典型特征是否就能導(dǎo)致細(xì)胞凋亡呢？對此，WHITE S R等[9]作了深入的研究。他們用細(xì)胞松弛劑D抑制氣管1HAEo細(xì)胞和主支氣管上皮細(xì)胞actin的延伸,或通過Jaspakinolide促進(jìn)actin的聚集，發(fā)現(xiàn)改變actin的整體性會導(dǎo)致細(xì)胞在5 h內(nèi)出現(xiàn)典型的凋亡形態(tài)學(xué)改變。該研究提示，actin可能是細(xì)胞凋亡早期的調(diào)控物之一，進(jìn)一步研究表明，通過改變actin穩(wěn)定狀態(tài)，可以導(dǎo)致凋亡的發(fā)生[10-11]。F-actin的解聚是凋亡過程中所必須的，其解聚出現(xiàn)在凋亡小體形成之前。actin是Caspases蛋白水解酶的作用底物，當(dāng)Caspases攻擊actin時，可將其切斷降解為15kD和31kD兩個片段，使之不能重新聚合，并由于15kD片段的形成而引起細(xì)胞凋亡形態(tài)的改變[12]。本研究發(fā)現(xiàn)，Psoralen可抑制胃癌細(xì)胞株BGC-803增殖，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡，同時藥物干預(yù)后引起了actin狀態(tài)的變化,即細(xì)胞骨架蛋白F-actin解聚，分析其作用機(jī)制可能是藥物引起了F-actin解聚從而導(dǎo)致了凋亡的發(fā)生。至于F-actin解聚是否由于Caspases蛋白水解酶作用尚有待進(jìn)一步研究。

國內(nèi)外尚無補(bǔ)骨脂素作用于細(xì)胞骨架蛋白抗腫瘤的實驗報道，上述研究結(jié)果表明，補(bǔ)骨脂素可抑制抑制胃癌細(xì)胞的增殖，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡，其作用機(jī)制可能是藥物干預(yù)后引起了F-actin解聚從而導(dǎo)致了凋亡的發(fā)生。本研究結(jié)果提示，補(bǔ)骨脂素作為一種有良好活性的抗癌中藥制劑提取物，具有很好的臨床應(yīng)用和開發(fā)價值，但其抗癌作用機(jī)理有待進(jìn)一步深入研究。

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