·論著·

基于植物生長調(diào)節(jié)劑萘乙酸和6-芐氨基嘌呤組合的紅花組織培養(yǎng)體系的優(yōu)化

薛英茹，李東巧，高越，郭美麗*(第二軍醫(yī)大學(xué)藥學(xué)院生藥學(xué)教研室,上海 200433)

[摘要]目的：建立高效的紅花(Carthmus tinctorius L.)離體組織培養(yǎng)體系，為紅花的基因操作搭建平臺。方法：以萌發(fā)6～8 d的紅花無菌苗子葉為外植體，選用MS基礎(chǔ)培養(yǎng)基，應(yīng)用萘乙酸(1-naphthylacetic acid,NAA)+6-芐氨基嘌呤(6-benzyl amino purine,6-BA)+激動素(kinetin,KT)為組織培養(yǎng)的植物生長調(diào)節(jié)劑，優(yōu)化紅花的組織培養(yǎng)體系。結(jié)果：紅花組織培養(yǎng)的最佳植物生長調(diào)節(jié)劑配方為：NAA 2.0 mg/L+6-BA 4.0 mg/L+KT 20.0 mg/L，添加活性炭(4 g/L)或硝酸銀(5 mg/L)，光照時間為16 h/d，光照強度9000 lx，培養(yǎng)溫度為(25±2) ℃，平均愈傷組織發(fā)生率高達86.4%，而且再生芽生長穩(wěn)定，重現(xiàn)性高。結(jié)論：本研究優(yōu)化建立了紅花的不定芽再生體系，為紅花基因操作平臺的建立奠定了基礎(chǔ)。

[關(guān)鍵詞]紅花；組織培養(yǎng)；萘乙酸；6-芐氨基嘌呤；激動素

[中圖分類號]R931.2[文獻標(biāo)志碼]A

DOI：10.5428/pcar20150203

基金項目國家自然科學(xué)基金(81173484,81473300)，上海市自然科學(xué)基金(13ZR1448200)

作者簡介薛英茹(女)，碩士生.

[收稿日期]2014-12-09

Optimization ofCarthamustinctoriusL. tissue culture system based on the combination of 1-naphthylacetic acid and 6-benzyl amino purine

XUE YingRu，LI DongQiao，GAO Yue，GUO MeiLi*(Department of Pharmacognosy，School of Pharmacy，Second Military Medical University，Shanghai 200433，China)

ABSTRACT[]Objective：To establish the regeneration system of safflower (Carthamus tinctorius L.),so as to create a platform of gene manipulation of safflower.Methods：Through tissue culture experiments，cotyledons germinated 6-8 days of safflower were selected as explants and cultured with Murashige and Skoog(MS) as the basal medium at (25±2) ℃ temperature with 16 h/d illumination and 9000 lx light intensity. Results：The optimum callus medium of safflower was MS basal medium supplemented with 1-naphthylacetic acid(NAA) 2.0 mg/L+6-benzyl amino purine(6-BA) 4.0 mg/L+kinetin (KT) 20.0 mg/L and addition of acticarbon(4 g/L) or silver nitrate(5 mg/L)，which made the callus mean rate as high as 86.4% and with higher regeneration bud grow stability and reproducibility. Conclusion：The research optimized adventitious shoot regeneration system and established the foundation for safflower gene manipulation platform.

[KEY WORDS]CarthamustinctoriusL.;tissue culture;1-naphthylacetic acid;6-benzyl amino purine;kinetin

[Pharm Care Res，2015，15(2)：91-94]

E-mail：xueyingru469376081@126.com;

李東巧(女)，碩士生.

E-mail：butterfly_qiao@163.com；兩人為共同第一作者

*通信作者(Corresponding author)：郭美麗，E-mail：mlguo@126.com

紅花(CarthamustinctoriusL.)是菊科一年或兩年生草本植物，紅花花冠是傳統(tǒng)的活血化瘀中藥，具有擴張冠狀動脈、抗凝、降血壓、耐缺氧、防治血栓、抗炎鎮(zhèn)痛等多種藥理作用，臨床應(yīng)用廣泛[1,2]。建立高效的紅花離體組織培養(yǎng)再生體系，對于紅花的基因改造具有極其重要的意義。國內(nèi)外有關(guān)紅花的組織培養(yǎng)工作一直有斷斷續(xù)續(xù)的報道，但由于紅花含有大量黃酮類成分，容易褐化，不同產(chǎn)地、不同紅花品種再生所需要的誘導(dǎo)條件不同，以及紅花自身的特性等，導(dǎo)致其再生芽生長非常困難[3,4]。因此，紅花再生體系的建立，一直是紅花組織培養(yǎng)的一個難題，也是紅花基因操作沒有取得突破性進展的重要原因。有文獻報道，在培養(yǎng)基中添加高濃度的賽苯隆(thidiazuron)可以提高紅花組織培養(yǎng)的生芽率[5-7]，但賽苯隆價格昂貴，不適用于后續(xù)實驗的研究和大規(guī)模的工業(yè)化生產(chǎn)。有關(guān)常用的外源植物生長調(diào)節(jié)物質(zhì)萘乙酸(1-naphthlacetic acid，NAA)、6-芐氨基嘌呤(6-benzyl amino purine,6-BA)進行紅花的組織培養(yǎng)雖有報道[8-13]，但均為零星研究，重現(xiàn)性差，難以作為穩(wěn)定的組織培養(yǎng)條件應(yīng)用于紅花的后續(xù)研究。因此，探索并優(yōu)化紅花的組織培養(yǎng)條件仍然是紅花研究中需要解決的一個關(guān)鍵性問題。本研究旨在應(yīng)用廉價的植物生長調(diào)節(jié)劑NAA、6-BA、激動素(kinetin,KT)，通過摸索不同植物生長調(diào)節(jié)劑濃度的配比，結(jié)合添加抑制組織褐化的活性炭或硝酸銀等，建立重現(xiàn)性好而且穩(wěn)定的紅花離體組織培養(yǎng)體系，為紅花的基因操作、遺傳轉(zhuǎn)化等搭建平臺。

1材料和培養(yǎng)條件

1.1儀器智能光照培養(yǎng)箱(南京貝帝實驗儀器有限公司)；SW-CJ-2FD型雙人單面凈化工作臺 (蘇州凈化設(shè)備有限公司)；手輪型不銹鋼立式滅菌鍋(上海達平儀器有限公司)；pH計(上海闊思電子有限公司)；TES數(shù)位式照度計(泰仕電子工業(yè)股份有限公司)。

1.2試藥烏魯木齊紅花品種種子(采自第二軍醫(yī)大學(xué)藥學(xué)院藥圃，經(jīng)第二軍醫(yī)大學(xué)藥學(xué)院生藥學(xué)教研室郭美麗教授鑒定)，種子經(jīng)消毒、萌發(fā)后獲得無菌苗；氫氧化鈉、乙醇(國藥化學(xué)試劑有限公司)；MS粉(上海日出生物科技有限公司)；瓊脂粉、6-BA、NAA、KT(美國Sigma公司)；雙蒸水(第二軍醫(yī)大學(xué)藥學(xué)院藥劑學(xué)教研室自制)；氯化汞(HgCl2，第二軍醫(yī)大學(xué)教保處)；硝酸銀、活性炭(北京索萊寶公司)。

1.3培養(yǎng)條件培養(yǎng)溫度為(25±2) ℃，光照時間16 h/d，光照強度9000 lx，濕度60%。

2方法和結(jié)果

2.1無菌材料的獲得種子經(jīng)流水預(yù)處理后，加入75% 乙醇處理30 s后用無菌水沖洗2次，每次5 min，再用0.1% HgCl2處理種子25 min，用無菌水沖洗4～5次，每次5 min。用無菌濾紙吸干表面水分，接種到無植物生長調(diào)節(jié)劑的MS固體培養(yǎng)基上，一個培養(yǎng)基瓶中約10粒種子。選取7 d左右無菌的紅花子葉為外植體，剪切成0.2～0.5 cm2的遠軸面接種在誘導(dǎo)培養(yǎng)基上。各種誘導(dǎo)培養(yǎng)基均以MS為基本培養(yǎng)基，附加不同濃度的NAA、6-BA、KT，放入智能光照培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每5 d換一次新鮮培養(yǎng)基。

2.3誘導(dǎo)紅花子葉不定芽的植物生長調(diào)節(jié)劑配比根據(jù)預(yù)實驗結(jié)果，設(shè)計不同濃度植物生長調(diào)節(jié)劑配比，設(shè)計方案見表1。每個配方接種60個外植體，各配方重復(fù)3次。為了減少褐化，嘗試在培養(yǎng)基中添加活性炭(4 g/L)和硝酸銀(5 mg/L)，觀察子葉再生芽的生長情況。在紅花子葉外植體不定芽的誘導(dǎo)過程中，作者前期(約2周)以6～7 d為一繼代單位進行繼代，后期以3～4 d為一繼代單位進行繼代。

愈傷發(fā)生率=(出愈傷組織塊數(shù)/有效外植體總數(shù))×100%

出芽率=(長芽外植體數(shù)/有效外植體總數(shù))×100%

2.4對紅花子葉愈傷誘導(dǎo)的影響紅花子葉外植體在添加不同濃度植物生長調(diào)節(jié)劑配比的培養(yǎng)基上培養(yǎng)，在配方2中愈傷最多，平均愈傷發(fā)生率達86.4%(表1)。紅花子葉外植體在配方2上培養(yǎng)15 d后愈傷較致密，呈青綠色(見圖1A)；培養(yǎng)23 d后愈傷致密，數(shù)量多，呈青綠色(見圖1B)。

2.5對紅花子葉出芽誘導(dǎo)的影響紅花子葉外植體在添加不同濃度配比的植物生長調(diào)節(jié)劑的培養(yǎng)基上培養(yǎng)，在配方2、配方3和配方4中長出再生芽，且在配方2中平均出芽率達12.5%(見表1)。子葉在配方2上培養(yǎng)29 d后再生芽生長良好，顏色青翠，長0.5～0.7 cm(見圖1C)；培養(yǎng)34 d后再生芽有3～4小簇，顏色青翠，長0.5～1.0 cm；在49 d后再生芽生長旺盛，長1.0～1.5 cm(見圖1D)。子葉在配方3中平均出芽率為3.4%(見表1)，培養(yǎng)49 d后再生芽細小，長約0.5 cm，與培養(yǎng)基接觸的部分有些褐化(見圖2A)。子葉在配方4中平均出芽率為6.7%，培養(yǎng)49 d后芽纖細，長約1.0 cm(見圖2B)。

表1　植物生長調(diào)節(jié)劑不同濃度配比對紅花子葉愈傷誘導(dǎo)和出芽誘導(dǎo)的影響

*P<0.05，**P<0.01，與配方1比較；△△P<0.01，分別與配方1、3、4、5比較；NAA：萘乙酸；6-BA：6-芐氨基嘌呤；KT：激動素

圖1　配方2培養(yǎng)15 d(A)、23 d(B)后愈傷生長情況及培養(yǎng)29 d(C)、49 d(D)后再生芽生長情況 Figure 1　Formula 2 callus formed from cotyledons explants after 15 d induction (A)，23 d induction (B),and adventitious buds presentation at adaxial cut ends of cotyledons explants after 29 d induction(C),49 d induction(D)

圖2　配方3(A)和配方4(B)培養(yǎng)49 d后再生芽生長情況 Figure 2　Formula 3(A)and formula 4(B) adventitious buds began to present at adaxial cut ends of cotyledons explants after 49 d induction

2.6添加活性炭或硝酸銀對子葉再生芽的影響子葉外植體在添加硝酸銀的培養(yǎng)基上培養(yǎng)50 d后再生芽生長旺盛，顏色青翠，褐化減少，有叢生現(xiàn)象；55 d后，再生芽生長旺盛，顏色青翠，褐化減少，有多處叢生現(xiàn)象(見圖3A)；在添加活性炭的培養(yǎng)基上55 d再生芽生長旺盛，褐化減少(見圖3B)。未添加硝酸銀和活性炭的培養(yǎng)基上55 d再生芽纖細(見圖3C)。

3討論

George等[12]于1982年提出，紅花組織培養(yǎng)與品種本身基因型差異相關(guān)，且依賴于外界培養(yǎng)基的供給。Orlikowska等[13]在1993年首次在MS培養(yǎng)基中添加NAA(0.1 mg/L)和6-BA(0.5 mg/L)，可誘導(dǎo)出叢生芽，且轉(zhuǎn)接到1/2 MS+NAA(1 mg/L)上生根，芽的生根率分別為31% 和67%，啟示了可以應(yīng)用外源植物生長調(diào)節(jié)劑供給內(nèi)源植物生長調(diào)節(jié)劑使之達到平衡。隨后的研究中，紅花組織培養(yǎng)中添加高濃度的賽苯隆在一定范圍內(nèi)提高了紅花組織培養(yǎng)的生芽率[6,7]，但賽苯隆價格昂貴，制約了后續(xù)實驗研究。本實驗室前期用已報道的高比率再生體系[6,10,13]進行重復(fù)時，皆沒有獲得再生芽，可能是由于紅花品種之間差異所致。在組織培養(yǎng)過程中，由于器官分化對植物生長調(diào)節(jié)劑需求的不定性，主要由生長素和細胞分裂素的比例控制。不同生長素和細胞分裂素種類和濃度以及兩者不同比例對愈傷組織和再生芽的誘導(dǎo)，與外植體供體植物種類、外植體本身的生理狀態(tài)或生長調(diào)節(jié)物質(zhì)敏感性密切相關(guān)，所以不同植物生長調(diào)節(jié)劑種類和不同比例之間的相互作用，會引起植物不同的生理效應(yīng)。KT主要促進細胞分裂和愈傷組織分化，不誘導(dǎo)愈傷組織的產(chǎn)生，但可以使愈傷組織處于一種良好的狀態(tài)，提高植株的再生頻率[14]。

圖3　添加硝酸銀(A)、活性炭(B)及未添加這兩者(C)55 d后再生芽生長情況 Figure 3　Adventitious bud growth at adaxial cut ends of cotyledons explants at day 55 after addition of sliver nitrate (A) and activated carbon (B)，and without addition of the two (C)

作者前期的預(yù)實驗，在培養(yǎng)基中添加0.25、0.5、1.0 mg/L濃度的NAA和1.0、2.0、4.0 mg/L濃度的6-BA，并進行隨機組合，發(fā)現(xiàn)6-BA的濃度對外植體愈傷的誘導(dǎo)及生長影響較大。在隨機配方NAA 0.5 mg/L+6-BA 2.0 mg/L+KT 20.0 mg/L中愈傷較多，且隨著NAA與6-BA濃度配比的加大，愈傷呈現(xiàn)質(zhì)地致密，顏色青綠色，能長出再生芽，再生芽顏色青翠，但生長緩慢。因此，在本實驗中，進一步增加了NAA和6-BA的濃度范圍。作者的研究表明，當(dāng)NAA濃度在2.0 mg/L，6-BA濃度在4.0 mg/L時，外植體愈傷生長較快，數(shù)量多且質(zhì)地緊密，再生芽生長旺盛，易于重復(fù)。

本研究結(jié)果表明，采用MS+2.0 mg/L NAA+4.0 mg/L 6-BA+20.0 mg/L KT的植物生長調(diào)節(jié)劑配比，光照時間為16 h/d，光照強度9000 lx，培養(yǎng)溫度為(25±2) ℃，濕度60%的條件，使紅花的平均愈傷發(fā)生率高達86.4%，且產(chǎn)生了穩(wěn)定的叢生芽，同時添加活性炭(4 g/L)或硝酸銀(5 mg/L)，減少了褐化現(xiàn)象，提高了叢生芽的生芽率。下一步，作者將重點進行紅花不定根的誘導(dǎo)工作，為紅花的基因操作搭建平臺。

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[修回日期]2015-03-19

[本文編輯]劉海濤姚春芳