·論著·
用HPLC法同時測定比格犬血漿中地西泮、去甲西泮和氟馬西尼的濃度
李文清,鄒豪,鐘延強(qiáng)*(第二軍醫(yī)大學(xué)藥學(xué)院藥劑學(xué)教研室,上海 200433)
[摘要]目的:建立測定比格犬血漿中地西泮、去甲西泮和氟馬西尼濃度的HPLC法。方法:采用Kromasil 100-5 C18色譜柱(250 mm×4.6 mm,5 μm);以氯硝西泮為內(nèi)標(biāo),甲醇(A)-水(B)-四氫呋喃(C)為流動相(55∶40∶5),流速1.0 ml/min,檢測波長254 nm;柱溫25 ℃。結(jié)果:地西泮、去甲西泮和氟馬西尼在濃度范圍為0.025~1.000 μg/ml時線性良好(r=0.999 9,0.999 0,0.998 9),日內(nèi)和日間RSD均<6%(n=5),回收率接近100%。結(jié)論:本方法準(zhǔn)確、快速、簡便,可用于比格犬血漿中地西泮、去甲西泮和氟馬西尼濃度的同時測定。
[關(guān)鍵詞]含量測定;地西泮;去甲西泮;氟馬西尼;色譜法,高效液相
[中圖分類號]R927.2,R971.3[文獻(xiàn)標(biāo)志碼]A
DOI:10.5428/pcar20150212
作者簡介李文清(男),碩士生.E-mail:lwqlpp@163.com
doi1.2藥品和試劑氯硝西泮對照品、去甲西泮對照品(瑞典Hunge University Hospital臨床藥理室贈送),地西泮對照品(含量>98%,山東信誼制藥有限公司),氟馬西尼對照品(含量>98%,湖南華納大藥廠有限公司),比格犬空白血漿(第二軍醫(yī)大學(xué)實(shí)驗動物中心);碳酸氫鈉為化學(xué)純,甲醇、磷酸、乙醚、二氯甲烷為色譜純(國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司);去離子水(第二軍醫(yī)大學(xué)藥學(xué)院藥劑學(xué)教研室自制)。
[收稿日期]2015-01-15
Simultaneous determination of diazepam,nordazepam and flumazenil in Beagle dog plasma by HPLC method
ABSTRACT[]Objective:To establish an HPLC method for simultaneous content determination of diazepam,nordazepam and flumazenil in Beagle dog plasma. Methods: The analysis was performed on Kromasil 100-5 C18 column(250 mm×4.6 mm,5 μm).Clonazepam was used as an internal standard.The mobile phase was composed of methanol(A)-water(B)-tetrahydrofuran(C)(55∶40∶5) at a flow rate of 1.0 ml/min.The detection wavelength was 254 nm and the column temperature was 25 ℃.Results: Diazepam,nordazepam and flumazenil were in good linearity within the ranges of 0.025-1.000 μg/ml (r=0.999 9,0.999 0,0.998 9).Intra-day and inter-day RSD were both less than 6%(n=5).Recovery rates were nearly 100%. Conclusion: The HPLC method is accurate,rapid,simple and could be used for simultaneous determination of diazepam,nordazepam and flumazenil in Beagle dog plasma.
[KEY WORDS]content determination;diazepam;nordazepam;flumazenil;chromatography,high performance liquid
[Pharm Care Res,2015,15(2):126-128]
*通信作者(Corresponding author):鐘延強(qiáng),E-mail:yqzhong68@163.com
1儀器和試藥
1.1儀器Column Oven L-2300/Auto Sample L-2200 HPLC儀(日本Hitachi公司);Kromasil 100-5 C18色譜柱(瑞典Kromasil公司);ROTANTA 460R離心機(jī)(德國Hettich公司);VORTEX-QILINBEIER6渦旋儀(江蘇省海門市其林貝爾儀器制造有限公司);AL104萬分之一電子天平(瑞士Mettler Toledo公司)。
2方法和結(jié)果
2.1色譜條件Kromasil 100-5 C18色譜柱(250 mm×4.6 mm,5 μm);流動相:甲醇(A)-水(B)-四氫呋喃(C)=55∶40∶5,用磷酸調(diào)pH=2.2;流速1.0 ml/min;柱溫25 ℃;檢測波長254 nm;進(jìn)樣量10 μl。
2.2標(biāo)準(zhǔn)儲備溶液及內(nèi)標(biāo)儲備溶液的配制精密稱取地西泮、去甲西泮、氟馬西尼對照品和氯硝西泮對照品(內(nèi)標(biāo))各10 mg,分別置于100 ml容量瓶中,以甲醇溶解并稀釋至刻度,分別配成100 μg/ml的標(biāo)準(zhǔn)儲備溶液,置-4 ℃保存。臨用前再混合,并稀釋至所需濃度。
采用SPSS 22.0統(tǒng)計軟件分析數(shù)據(jù)。符合正態(tài)分布者則采用兩獨(dú)立樣本t檢驗,以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差進(jìn)行統(tǒng)計描述;不符合正態(tài)分布者則采用秩和檢驗,以中位數(shù)及四分位間距進(jìn)行統(tǒng)計描述;重復(fù)測量設(shè)計的計量資料比較采用重復(fù)測量設(shè)計的方差分析;計數(shù)資料比較采用χ2檢驗,以例(百分率)表示。P<0.05表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。
2.3血樣處理取比格犬血漿0.4 ml,加入標(biāo)準(zhǔn)儲備溶液和內(nèi)標(biāo)儲備溶液各0.04 ml,用碳酸氫鈉飽和溶液0.4 ml堿化,渦旋30 s后加入乙醚∶二氯甲烷(60∶40)的萃取液,渦旋3 min。取上清液揮干,殘渣加100 μl甲醇溶解,進(jìn)樣10 μl,測定樣品峰面積。
2.4專屬性實(shí)驗在此色譜條件下,血漿雜質(zhì)對4種藥物無干擾,且4種藥物色譜峰分離良好(見圖1)。氟馬西尼、氯硝西泮、去甲西泮、地西泮的保留時間分別為4.15、7.61、11.44、13.28 min。
2.5線性關(guān)系考察取空白血漿0.4 ml,精密加入一定量混合標(biāo)準(zhǔn)儲備溶液及內(nèi)標(biāo)儲備溶液,配成3種藥品濃度均分別為0.025、0.05、0.10、0.125、0.25、0.50、1.00 μg/ml血漿樣品,并按2.3項下方法處理后進(jìn)樣。以待測藥品與內(nèi)標(biāo)峰面積之比(A)對血漿濃度(c)進(jìn)行線性回歸,求出各種藥品的標(biāo)準(zhǔn)曲線方程(見表1)。
圖1 氟馬西尼、去甲西泮、地西泮的HPLC譜圖 Figure 1 HPLC photograms of flumazenil, nordazepam and diazepam A:空白血漿;B:血漿樣品;1:氟馬西尼; 2:內(nèi)標(biāo)氯硝西泮;3:去甲西泮;4:地西泮
表1 3種藥品的標(biāo)準(zhǔn)曲線方程
2.6提取回收率、方法回收率和最低檢測限取空白血漿0.4 ml,準(zhǔn)確加入一定量混合標(biāo)準(zhǔn)儲備溶液及內(nèi)標(biāo)儲備溶液,配成低、中、高3種濃度的血漿樣品作為提取回收率實(shí)驗用的含藥血漿(3種藥品濃度均為0.05、0.10、0.50 μg/ml),按2.3項下方法處理,萃取后藥品進(jìn)樣所得的峰面積與對應(yīng)濃度藥品標(biāo)準(zhǔn)儲備溶液直接進(jìn)樣所得峰面積的比值即為提取回收率,具體見表2。
表2 回收率和精密度實(shí)驗結(jié)果
取空白血漿0.4 ml,同法配成相同濃度的血漿樣品,按2.3項下方法處理,測定峰面積(A),代入表1標(biāo)準(zhǔn)曲線方程中計算濃度。標(biāo)準(zhǔn)曲線方程計算得到的濃度與樣品實(shí)際濃度的比值即為方法回收率。每種濃度在1 d內(nèi)平行測5次,連續(xù)測5 d,計算方法回收率及精密度,具體見表2。
以低濃度對照品混入血漿后,測得相應(yīng)藥物的濃度與其響應(yīng)值作為比較,并以信噪比(S/N)=3為臨界值來計算最低檢測限。計算得氟馬西尼的最低檢測限為7 ng/ml,地西泮與去甲西泮的最低檢測限為6 ng/ml。
2.7穩(wěn)定性取空白血漿0.4 ml,同法制備低、中、高濃度血漿樣品并按2.3項下方法處理,分別考察室溫下放置24 h、-20 ℃下放置14 d、反復(fù)凍融3次處理后的穩(wěn)定性,結(jié)果顯示所有穩(wěn)定性實(shí)驗中其RSD均<8%,表明血漿中地西泮、去甲西泮、氟馬西尼在上述3種條件下穩(wěn)定性良好。
3討論
樣品前處理方法直接關(guān)系到檢測結(jié)果的準(zhǔn)確性。本研究對血漿的前處理方法進(jìn)行了考察,在正常劑量下,地西泮、去甲西泮及氟馬西尼在體內(nèi)的濃度很小,選用液液萃取的方法可以實(shí)現(xiàn)血漿中藥品的富集,有助于提高檢測靈敏度。選用乙醚∶二氯甲烷(60∶40)為萃取液,提取效率高且易揮干,在254 nm波長處雜質(zhì)干擾小。
地西泮在人體內(nèi)的代謝產(chǎn)物眾多,其中去甲西泮為有藥理活性的代謝產(chǎn)物之一,對于中國人來說更是唯一與地西泮消除相關(guān)的代謝產(chǎn)物。由于種屬差異,地西泮在比格犬體內(nèi)的半衰期比人短很多[7],與人相同的是,在比格犬體內(nèi),去甲西泮也是與地西泮消除相關(guān)的代謝產(chǎn)物。氟馬西尼是一種苯二氮受體拮抗劑,對苯二氮受體具有很強(qiáng)的親合力,可競爭性拮抗苯二氮類藥物與受體結(jié)合,從而減弱該類藥物的藥理作用,廣泛應(yīng)用于臨床。因此,同時監(jiān)測3種藥物的血藥濃度具有重要的臨床意義。
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[修回日期]2015-03-06
[本文編輯]陽凌燕