·論著·

人C型凝集素受體dectin-1單克隆抗體的制備

楊龍1，王英2，朱樂樂3，姜遠英1*，賈鑫明3*

(1.第二軍醫(yī)大學(xué)藥學(xué)院新藥研究中心，上海 200433；2.第二軍醫(yī)大學(xué)長海醫(yī)院皮膚科，上海 200433；3.同濟大學(xué)醫(yī)學(xué)院免疫學(xué)教研室，上海 200092)

[摘要]目的：克隆獲得并原核表達人dectin-1基因的胞外段，以其作為抗原，制備人C型凝集素受體dectin-1的單克隆抗體。方法和結(jié)果：利用RT-PCR技術(shù)從人的外周血中克隆獲得人dectin-1基因，克隆到pCDNA 3.0(+)載體中，獲得pCDNA3.0(+)-dectin-1質(zhì)粒。將dectin-1胞外段[dectin-1 (202 bp-744 bp)]克隆到pET28a(+)載體，構(gòu)建原核表達質(zhì)粒pET28a(+)-dectin-1(202 bp-744 bp)，轉(zhuǎn)到大腸桿菌E.coli BL21 (DE3)中，IPTG誘導(dǎo)目的片段原核表達，得到高效表達的dectin-1(202 bp-744 bp)，鎳柱親和層析純化后免疫BALB/c小鼠，取抗體滴度高的小鼠的脾細胞與小鼠骨髓瘤細胞SP2/0融合，獲得15株陽性雜交瘤細胞株，利用有限稀釋法進行單克隆雜交瘤細胞株的篩選，獲得5株單克隆細胞株。用單克隆細胞株制備小鼠腹水模型，經(jīng)辛酸-硫酸銨沉淀法純化獲得dectin-1的單克隆抗體。經(jīng)蛋白質(zhì)印跡法驗證，此單克隆抗體能有效地識別人和小鼠的dectin-1蛋白。結(jié)論：成功制備獲得dectin-1蛋白的特異、高效的單克隆抗體。

[關(guān)鍵詞]C型凝集素受體；dectin-1；單克隆抗體

[中圖分類號]R392.5，R967[文獻標(biāo)志碼]A

DOI：10.5428/pcar20150204

基金項目上海市科學(xué)技術(shù)委員會科研基金(12JC1408400)

作者簡介楊龍(男)，碩士生.

[收稿日期]2014-05-05

Preparation of monoclonal antibody of human C-type lectin receptors dectin-1

YANG Long1，WANG Ying2，ZHU LeLe3，JIANG YuanYing1*，JIA XinMing3*(1.New Drug Reseach and Development Center，School of Pharmacy，Second Military Medical University，Shanghai 200433,China；2. Department of Dermatology，Changhai Hospital，Second Military Medical University，Shanghai 200433，China；3. Department of Immunology，School of Medicine，Tongji University，Shanghai 200092,China)

ABSTRACT[]Objective：To clone and prokaryoticly express the extracellular region of human C-type lectin receptor dectin-1 and prepare monoclonal antibodies of human dectin-1. Methods and Results：The full-length human dectin-1 mRNA was cloned from peripheral blood monocytes by using RT-PCR and inserted into the pCDNA3.0(+) vector. The extracellular region of dectin-1[dectin-1 (202 bp-744 bp)] was cloned and inserted into pET28a(+) vector to get pET28a(+)-dectin-1 (202 bp-744 bp) vector. The recombinant pET28a-dectin-1 (202 bp-744 bp) vector was transformed into E.coli BL21 (DE3). The expression of objective protein was high when induced with IPTG. The objective protein was purified with Ni-NTA affinity chromatograph and was used to immunize BALB/c mice. The mice which generated higher titer of antibody in the serum were sacrificed.The splenocytes were separated and fused with SP2/0 cells to generate hybridoma cells. Fifteen strains of hybridoma cells were thus obtained. After further selection and cloning，5 strains of monoclonal hybridoma cells secreting monoclonal antibodies against dectin-1 were established. BALB/c mice was intraperitoneally injected into hybridoma cells to produce ascites. The dectin-1 monoclonal antibody was purified by standard protocol of octanoic acid-ammonium sulfate precipitation，which could specifically combine to dectin-1，no matter whether they were human dectin-1 or mouse dectin-1,when used in Western blotting. Conclusion：The specific monoclonal antibodies against dectin-1 were successfully obtained.

[KEY WORDS]C-type lectin receptor;dectin-1;monoclonal antibody

[Pharm Care Res，2015，15(2)：95-98,146]

E-mail：muyi53@163.com

*通信作者(Corresponding author)：姜遠英，E-mail：jiangyy@smmu.edu.cn；賈鑫明，E-mail：jiaxm@#edu.cn

C 型凝集素受體(C-type lectin receptor，CLR)是一類重要的模式識別受體(pattern recognition receptor，PRR)，主要配體是糖成分。由于真菌細胞壁中含有大量的糖，所以CLR在抗真菌免疫中發(fā)揮重要作用[1]。Dectin-1(dendritic cell-associated C-type lectin-1)屬于CLR超家族中的dectin-1亞家族，是研究最為廣泛的一種C型凝集素受體，在抗真菌固有免疫應(yīng)答中發(fā)揮重要作用[2]。Dectin-1基因位于人12號染色體(小鼠6號染色體)NKC(natural killer-gene complex)的端粒區(qū)[3]，其基因結(jié)構(gòu)在人和小鼠中高度保守，氨基酸同源性為73.9%。Dectin-1主要表達在樹突狀細胞和巨噬細胞等固有免疫細胞表面，dectin-1為Ⅱ型糖蛋白，其結(jié)構(gòu)包括胞質(zhì)區(qū)免疫受體酪氨酸激活基序(immunoreceptor tyrosine-based activation motif，ITAM)、跨膜區(qū)和胞外區(qū)碳水化合物識別結(jié)構(gòu)域(carbohydrate recognization domain，CRD)[4]。Dectin-1結(jié)合白念珠菌細胞壁分子β-glucan后，通過激活胞內(nèi)的ITAM，募集激活Syk激酶，誘導(dǎo)CARD9/Bcl10/MALT1形成復(fù)合體，進而激活NF-κB，表達TNF-α、IL-1β和IL-6等促炎細胞因子，啟動機體的抗真菌感染固有免疫應(yīng)答，并介導(dǎo)適應(yīng)性免疫應(yīng)答[5-8]。本研究通過克隆dectin-1胞外區(qū)序列并進行原核表達，以純化的dectin-1胞外段蛋白為抗原免疫小鼠，篩選獲得特異性分泌dectin-1抗體的單克隆雜交瘤細胞，制備功能性的抗dectin-1的單克隆抗體，為進一步研究dectin-1的生物學(xué)功能提供有效的工具。

1材料

1.1細胞株和實驗動物小鼠骨髓瘤細胞株SP2/0由第二軍醫(yī)大學(xué)藥學(xué)院新藥研究中心實驗室保存；6周齡BALB/c小鼠購自中國科學(xué)院上海實驗動物中心，動物生產(chǎn)合格證號：SCXK(滬)2012-0002；質(zhì)粒 pET28a (+)、pCDNA3.0及菌株E.coliDH5α與E.coliBL21(DE3)由本實驗室保存。

1.2主要試劑和器材RPMI 1640培養(yǎng)基、胎牛血清(FBS)、丙酮酸鈉、青霉素、鏈霉素、卡那霉素、trizol等，均購自Life Technologies公司；RNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒購自Promega公司；弗氏完全佐劑、弗氏不完全佐劑、HAT、HT、聚乙二醇(PEG)等均購自Sigma公司；HRP標(biāo)記的羊抗鼠IgG購自北京康為世紀公司；高結(jié)合力酶標(biāo)板購自Novagen公司；Galaxy 170 S CO2細胞培養(yǎng)箱購自德國Eppendorf公司；iMARK多功能酶標(biāo)儀購自Bio-Rad公司。PCR引物(見表1)由鉑尚公司合成。

2方法和結(jié)果

2.1pCDNA3.0(+)-dectin-1和pET28a(+)-dectin-1(202 bp-744 bp)重組表達質(zhì)粒的構(gòu)建與鑒定利用trizol方法抽提人外周血RNA，按照Promega公司的RNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒的操作步驟將抽提的RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA，以其為模板利用PCR技術(shù)擴增(擴增條件為：94 ℃ 10 min；94 ℃ 30 s，56 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，30個循環(huán)；72 ℃ 10 min；4 ℃ 保存)，獲得人全長的dectin-1基因，見圖1A。用BamHⅠ和XholⅠ雙酶切上述的dectin-1 基因和載體質(zhì)粒pcDNA3.1(+)，T4 DNA連接酶連接獲得dectin-1-pcDNA3.1(+)質(zhì)粒。再以pCDNA 3.0(+)-dectin-1質(zhì)粒為模板，設(shè)計引物進行PCR，獲得dectin-1基因胞外段[dectin-1(202 bp-744 bp)]，見圖1B。用BamHⅠ和XholⅠ雙酶切上述dectin-1(202 bp-744 bp)和載體質(zhì)粒 pET28a(+)；T4 DNA連接酶連接，獲得pET28a(+)-dectin-1(202 bp-744 bp)質(zhì)粒，見圖1C。挑取單克隆進行酶切鑒定及測序，測序結(jié)果與PubMed中的dectin-1基因(Gene ID:64581，http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gene/64581)的序列完全相同，表明將dectin-1(202 bp-744 bp)成功克隆到pET28a(+)質(zhì)粒中。

表1　引物列表

注：下劃線表示酶切位點

圖1　人dectin-1，dectin-1(202 bp-744 bp)及pET28a(+)-dectin-1(202 bp-744 bp)質(zhì)粒 Figure 1　Human dectin-1，dectin-1 (202 bp-744 bp) and pET28a(+)-dectin-1(202 bp-744 bp) plasmids A：dectin-1；B：dectin-1 (202 bp-744 bp)，M：Marker，1：dectin-1 (202 bp-744 bp)；C：pET28a(+)-dectin-1 (202 bp-744 bp)，M：Marker，1-9：9個不同的pET28a(+)-dectin-1 (202 bp-744 bp)

2.2Dectin-1胞外段蛋白的原核表達和純化將經(jīng)鑒定的重組質(zhì)粒pET28a(+) -dectin-1(202 bp-744 bp)轉(zhuǎn)化至E.coliBL21(DE3)中，取陽性單克隆接種于5 ml含卡那霉素的新鮮LB培養(yǎng)基中，37 ℃振蕩培養(yǎng)過夜；次日取2 ml上述菌液于40 ml新鮮LB中培養(yǎng)，加入終濃度為0.3 mmol/L的異丙基-β-D-半乳糖苷(IPTG)，26 ℃誘導(dǎo)10 h，4 ℃，15 805×g離心3 min。收集細菌，用PBS洗滌3次，再重懸于10 ml PBS中，超聲波裂解，10 976×g離心30 min。取80 μl上清液與20 μl的5×loading buffer，混勻，100 ℃金屬浴5 min；同時向沉淀中加入5 ml PBS(含6 mol/L尿素)，混勻，3951×g離心5 min后取80 μl上清液與20 μl的5×loading buffer混勻，100 ℃金屬浴5 min。分別將收集的上清液和沉淀的樣品進行SDS-PAGE 電泳，進行考馬斯亮藍染色和脫色，結(jié)果顯示目的片段[dectin-1 (202 bp-744 bp)]約17 ku，目的條帶主要在沉淀部分，說明以包涵體形式表達(圖2A-5)。取沉淀變性，用Ni-NTA His親和層析柱純化后復(fù)性，將獲得組分進行SDS-PAGE 電泳，考馬斯亮藍染色檢測，顯示獲得高純度蛋白(圖2B)。

圖2　Dectin-1胞外段重組蛋白誘導(dǎo)表達 及純化的SDS-PAGE電泳圖 Figure 2　SDS-PAGE electrophorograms of expression products and purified dectin-1 recombinant extracellular region protein A：Dectin-1胞外段重組蛋白誘導(dǎo)表達SDS-PAGE電泳圖；B：Dectin-1胞外段重組蛋白純化后SDS-PAGE電泳圖；M：Marker；1：沒有轉(zhuǎn)化質(zhì)粒的E.coli BL21；2：轉(zhuǎn)化pET28a(+)-dectin-1(202 bp- 744 bp)質(zhì)粒的E.coli BL21；3：0.3 mmol/L IPTG誘導(dǎo)3 h的E. coli BL21；4：0.3 mmol/L IPTG誘導(dǎo) 10 h E.coli BL21 上清液； 5：0.3 mmol/L IPTG誘導(dǎo)10 h E.coli BL21沉淀； 6：純化后的 dectin-1胞外段蛋白；IPTG：異丙基-β-D-半乳糖苷

2.3小鼠免疫和血清抗體滴度的測定取6周齡BALB/c小鼠3只，皮下注射純化后的抗原蛋白50 μg/只(根據(jù)蛋白質(zhì)濃度不同，體積不同)與等體積弗氏完全佐劑混勻的乳化物免疫小鼠；間隔2周后，皮下注射抗原蛋白(50 μg/只)與等體積弗氏不完全佐劑混勻的乳化物免疫小鼠，共5次(間隔均是2周)。最后1次免疫后第10天(d 10)測定小鼠血清抗體滴度。小鼠尾部取血，4 ℃靜置過夜，1756×g離心10 min。收集上清液，并做1/500、1/1000、1/2000、1/4000、1/8000、1/16 000、1/32 000、1/64 000梯度稀釋。各取100 μl加入酶標(biāo)板中，4 ℃孵育過夜；PBST洗板后加入HRP標(biāo)記的羊抗小鼠二抗(1∶5000稀釋)，37 ℃孵育1 h；洗滌后加入TMB顯色液，顯色至適當(dāng)顏色后用終止液進行終止反應(yīng)，并用酶標(biāo)儀在450 nm波長處讀取吸光度值。

如圖3A所示，2號小鼠血清中抗體效價較高。用3只小鼠的血清檢測抗原蛋白，蛋白質(zhì)印跡法結(jié)果顯示，3只小鼠血清都可特異性地結(jié)合抗原蛋白，2號和3號小鼠血清結(jié)合較好(圖3B)。故選擇2號小鼠脾臟細胞與骨髓瘤細胞SP2/0 按5∶1的比例進行融合，建立雜交瘤細胞株。

圖3　Dectin-1免疫小鼠血清抗體測定 Figure 3　Identification of dectin-1 antibodies (mouse serum) activity A：Elisa法檢測dectin-1血清抗體滴度；B：蛋白質(zhì)印跡法 檢測dectin-1血清抗體的結(jié)合活性； ○：m1； ●：m2； △：m3

2.4Dectin-1雜交瘤細胞單克隆的篩選、鑒定選擇免疫效果最好的2號小鼠做雜交瘤融合。最后一次免疫2周后，2號小鼠腹腔注射抗原蛋白50 μg(不加佐劑)，進行加強免疫。腹腔注射后d 4摘眼球取血，處死動物，取脾臟，分離脾細胞，按照常規(guī)操作步驟將脾細胞和小鼠骨髓瘤細胞株SP2/0融合。用HAT選擇性培養(yǎng)基對融合細胞進行篩選，建立雜交瘤細胞株，并用間接Elisa法檢測細胞上清液中抗體效價，將強陽性細胞克隆化。隨后用有限稀釋法進行亞克隆篩選，若一個單克隆連續(xù)2～3次亞克隆，得到的所有克隆均為陽性時，可認定該單克隆細胞能穩(wěn)定分泌特異性抗體，將該細胞建株，擴增保存或供制備小鼠腹水用。初步篩選結(jié)果如圖4A所示，獲得15株dectin-1陽性雜交瘤細胞，其中有6株單克隆細胞上清在450 nm處吸光度值較高，提示具有較高效價，對其進行蛋白質(zhì)印跡檢測，結(jié)果顯示有5株單克隆細胞上清液與抗原蛋白結(jié)合較高(圖4B)。

圖4　分泌dectin-1抗體的雜交瘤細胞篩選鑒定 Figure 4　Selection of hybridomas secreting dectin-1 antibody A：Elisa法檢測單克隆雜交瘤細胞上清液中抗體滴度；B：蛋白質(zhì) 印跡法檢測5株單克隆雜交瘤細胞上清液與抗原蛋白的結(jié)合 能力；-：未免疫小鼠血清；+：抗原免疫小鼠陽性血清

2.5小鼠腹水制備、抗體純化、小鼠單克隆抗體的鑒定選取3株單克隆細胞株制備小鼠腹水。另取6周齡BALB/c小鼠，每只小鼠腹腔注射0.5 ml 弗氏不完全佐劑免疫，10 d后將經(jīng)篩選能穩(wěn)定分泌單克隆抗體的雜交瘤細胞株以2×105個/只的量進行腹腔注射。腹腔注射雜交瘤細胞株后14 d抽取腹水，用辛酸-硫酸銨沉淀法純化獲得dectin-1(202 bp-774 bp)的單克隆抗體，4 ℃透析過夜后測定抗體濃度，并保存待鑒定。

用蛋白質(zhì)印跡法檢測dectin-1抗體的特異性反應(yīng)性。文獻報道dectin-1參與真菌的識別，并可以被誘導(dǎo)而致高表達[9]，故提取1例真菌感染病人單核細胞和骨髓細胞的總蛋白，1例健康志愿者的外周血單核細胞的總蛋白。蛋白質(zhì)印跡法顯示，3株單克隆抗體都能與人dectin-1蛋白特異性結(jié)合，圖5A-1、圖5A-2、圖5A-3分別顯示3株單克隆抗體與健康人外周單核細胞總蛋白、真菌感染病人外周單核細胞、真菌感染病人骨髓細胞總蛋白特異性結(jié)合，圖5A-2和5A-3的3個條帶的灰度比圖5A-1的3個條帶要深，說明dectin-1在真菌感染病人的外周單核細胞和骨髓細胞高表達。由于人dectin-1和小鼠dectin-1的編碼序列有很高的同源性，提取野生型小鼠骨髓來源的巨噬細胞(bone marrow-derived macrophage，BMDM)，用白念珠菌刺激小鼠BMDM，30 min后抽提BMDM總蛋白。以3株制備的單克隆抗體為一抗，蛋白質(zhì)印跡法顯示，制備的抗體可以識別BMDM中的dectin-1蛋白(圖5B)。上述結(jié)果說明制備的3株抗體均可以特異性識別人和小鼠的dectin-1分子。

圖5　Dectin-1單克隆抗體對內(nèi)源性 dectin-1的識別能力檢測 Figure 5　Western blot analysis and detection of natural dectin-1 by dectin-1 monoclonal antibody A：Dectin-1單克隆抗體檢測人外周血單核細胞和骨髓細胞中dectin-1的表達；B：Dectin-1單克隆抗體檢測小鼠BMDM中dectin-1的表達；1：健康人外周血單核細胞總蛋白； 2：真菌感染 病人外周血單核細胞總蛋白；3：真菌感染病人骨髓細胞總蛋白

3討論

Dectin-1是介導(dǎo)機體抗真菌感染固有免疫應(yīng)答的重要受體，在巨噬細胞和樹突狀細胞等固有免疫細胞上高度表達。研究表明，dectin-1可以識別白念珠菌酵母態(tài)，啟動固有免疫應(yīng)答效應(yīng)，發(fā)揮抗白念珠菌感染作用[5-8]。

Dectin-1胞外段的CRD主要參與配體的識別，其在C型凝集素受體家族中高度的保守，dectin-1的胞外段除能識別β-葡聚糖外，還能識別T細胞表面的未知的內(nèi)源性配體，促進T細胞增殖[4]。另有研究表明，dectin-1能夠識別凋亡細胞，介導(dǎo)凋亡細胞的吞噬，表明在凋亡細胞的表面也有dectin-1能夠識別的配體[10]。本實驗克隆了包括CRD在內(nèi)的人dectin-1的整個胞外區(qū)片段，構(gòu)建了pET28a(+)-dectin-1(202 bp-744 bp)質(zhì)粒。該表達質(zhì)粒在E.coliBL21(DE3)中可高效表達重組蛋白。利用純化的目的蛋白免疫小鼠來制備抗體，通過一系列的Elisa和抗原蛋白質(zhì)印跡法驗證，獲得了5株單克隆細胞株。通過進一步的篩選，3株抗體可以識別小鼠的BMDM以及人的外周血單核細胞中的dectin-1分子。研究表明，在真菌感染過程中，dectin-1可以被誘導(dǎo)高表達[9]，用3株制備的抗體檢測真菌感染病人的外周血單核細胞和骨髓細胞的總蛋白，發(fā)現(xiàn)3株抗體都能有效地檢測到dectin-1表達的上升。提示制備抗體可以用于檢測真菌感染病人

及其愈后。對于dectin-1等C型凝集素受體的深入研究將有助于對機體的免疫調(diào)節(jié)和穩(wěn)態(tài)維持的深入認識，從而對真菌感染和自身免疫性疾病的治療、疫苗的研制，以及新藥的研發(fā)等起指導(dǎo)作用。而dectin-1特異性抗體的成功制備，對于深入研究dectin-1在抗真菌免疫中的作用有很大幫助。

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[修回日期]2015-03-15

[本文編輯]貢沁燕