·論著·

津力達顆粒對1型糖尿病大鼠生長激素-胰島素樣生長因子-1軸的作用

盧曉曉，王超群，劉子毓，鄒俊杰，劉志民*(第二軍醫(yī)大學長征醫(yī)院內分泌科，上海 200003)

[摘要]目的：探討津力達顆粒對1型糖尿病大鼠生長激素-胰島素樣生長因子-1(GH/IGF-1)軸的作用。 方法： 采用鏈脲佐菌素(STZ) 60 mg/kg腹腔注射制備1型糖尿病SD大鼠模型，隨機分為7組：糖尿病模型組、低/中/高劑量津力達組、中劑量津力達+通心絡組、二甲雙胍組、沙格列汀組，另設正常對照組，每組5只。分別予以藥物或安慰劑灌胃給藥，8周后測定空腹血糖(FBG)、糖化血紅蛋白(HbA1C)、空腹胰島素(FINS)、C肽、生長激素(GH)、胰島素樣生長因子-1(IGF-1)、胰島素樣生長因子結合蛋白-1(IGFBP-1)；實時(real-time)測定肝臟生長激素受體(GHR)mRNA。結果：與模型組相比，中、高劑量津力達組的FBG、HbA1C顯著降低(P<0.05，P<0.01),FINS、C肽顯著升高(P<0.05，P<0.01)；各藥物治療組血清GH顯著降低(P<0.01)，IGF-1顯著升高(P<0.01)。結論： 津力達顆?？筛纳艷H/IGF-1軸紊亂。

[關鍵詞]1型糖尿病；津力達顆粒；生長激素；胰島素樣生長因子；大鼠

[中圖分類號]R977.15,R965[文獻標志碼]A

DOI：10.5428/pcar20150206

基金項目國家重點基礎研究發(fā)展計劃(“973”計劃，2005CB523304)

作者簡介盧曉曉，碩士生. E-mail:1990-lxx@163.com

[收稿日期]2015-01-14

Effects of Jinlida granules on growth hormone/insulin-like growth factor-1 axis in type 1 diabetic rats

LU XiaoXiao，WANG ChaoQun，LIU ZiYu，ZOU JunJie，LIU ZhiMin*(Department of Endocrinology，Changzheng Hospital，Second Military Medical University，Shanghai 200003，China)

ABSTRACT[]Objective：To investigate the effect of Jinlida granules on the regulation of growth hormone/insulin-like growth factor-1 (GH/IGF-1) axis in type 1 diabetic rats. Methods： Type 1 diabetic SD rats were induced by intraperitoneal injection of streptozotocin(STZ) 60 mg/kg. The diabetic rats were randomly divided into 7 groups:the diabetic model group，the low/median/high doses of Jinlida granules groups，the median Jinlida + Tongxinluo group，the metformin group and the saxagliptin group,each consisting of 5 rats. Another 5 normal rats were assigned as control. The rats were administered drugs or placebo by gavage，respectively. After 8 weeks，diabetic parameters were detected，including fasting blood glucose(FBG)，glycosylated hemoglobin Alc (HbA1C)，fasting insulin(FINS)，C peptide，growth hormone(GH),IGF-1，insulin-like growth factor binding protein-1 (IGFBP-1). Hepatic growth hormone receptor(GHR) mRNA was detected by real-time PCR. Results：Compared with the levels of the diabetic model group,the levels of FBG and HbA1C were significantly decreased(P<0.05,P<0.01) in median and high dose Jinlida groups,and the levels of FINS and C peptide were significantly increased(P<0.05,P<0.01). Decreased serum GH levels were also detected in the median and high dose Jinlida groups,as compared with that of the diabetic model group(P<0.01)，and IGF-1 level was increased(P<0.01). Conclusion： Jinlida granules could improve the disorder of GH/IGF-1 axis in diabetic rats.

[KEY WORDS]type 1 diabetes mellitus；Jinlida granules；growth hormone；insulin-like growth factor;rats

[Pharm Care Res，2015，15(2)：103-106]

*通信作者(Corresponding author)：劉志民，E-mail：zmliu_cz@hotmail.com

糖尿病(diabetes mellitus)系胰島素絕對或相對不足引起的、以慢性高血糖為特征的代謝性疾病。隨著糖尿病的進展可引起多系統(tǒng)損傷，體內各激素水平均有不同程度的改變[1]。既往研究表明，糖尿病發(fā)生時，循環(huán)中生長激素(growth hormone，GH)水平升高，伴胰島素樣生長因子-1(insulin-like growth factor-1，IGF-1)水平降低，即GH/IGF-1軸紊亂[2]，而該軸的紊亂，又會導致胰島素敏感性降低，血糖水平持續(xù)升高[3]。津力達顆粒以人參、桂枝、山藥、黃精、蒼術、佩蘭、葛根等為主藥，從中醫(yī)角度改善水谷精微運化，從而發(fā)揮降糖作用[4]。本研究探討不同劑量的津力達顆粒對1型糖尿病模型大鼠GH/IGF-1軸的作用。

1材料和方法

1.1實驗動物雄性Sprague-Dawley (SD)大鼠，6～8周齡，體重180～220 g，共60只，購自第二軍醫(yī)大學實驗動物中心(動物生產許可證號：SCXK(滬)2012-0003；使用許可證號：SYXK(滬)2012-0003)。大鼠飼養(yǎng)環(huán)境溫度(20～25) ℃，濕度：40%～70%，12/12 h晝夜節(jié)律(人工光)，自由攝食、飲水，分籠飼養(yǎng)，5只/籠。

1.2藥品和試劑津力達顆粒、通心絡超微粉(石家莊以嶺藥業(yè)股份有限公司)；二甲雙胍(中美上海施貴寶有限公司)；沙格列汀(阿斯利康制藥有限公司)；鏈脲佐菌素(streptozotocin,STZ，低溫、避光)、羥甲基纖維素鈉(CMC-Na)、檸檬酸及檸檬酸鈉(美國Sigma公司)；葡萄糖(Glu)測試盒、糖化血紅蛋白(HbA1C)測試盒(南京建成生物工程研究所)；胰島素、C肽放射免疫分析試劑盒(北京北方生物技術研究所)；GH、IGF-1、胰島素樣生長因子結合蛋白-1(insulin-like growth factor binding protein-1，IGFBP-1)酶聯免疫分析試劑盒(武漢基因美生物科技有限公司)；SYBR Green PCR試劑盒、逆轉錄試劑盒(Thermo公司)；RNaseⅠ(Fermentas公司)；PCR引物(上海捷瑞公司)；Trizol(Invitrogen公司)；還原磷甘油醛脫氫酶(GAPDH，CST公司)；DEPC處理水(上?；鶢栴D生物科技有限公司)；氯仿、無水乙醇、異丙醇、10%水合氯醛(國藥集團上海公司)。

1.3造模和分組SD大鼠適應性喂養(yǎng)3 d后，予以禁食、不禁水12 h，稱重后隨機抽取5只大鼠作為正常對照組(NC)，其余大鼠均腹腔注射STZ 60 mg/kg (用0.1 mmol/L的檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液配制成混懸液，pH 4.2～4.5，現配現用，30 min內用完)。3 d后尾靜脈采血，檢測FGB，選擇FGB>16.7 mmol/L為標準，判斷是否成模(去除死亡、不達標者，剩余35只大鼠)。采用隨機數字表法將35只高血糖模型大鼠隨機分為7組：糖尿病模型組(DM)、低劑量津力達組(JL)、中劑量津力達組(JM)、高劑量津力達組(JH)、中劑量津力達+通心絡組(JM+T)、二甲雙胍組(Met)、沙格列汀組(Sax)，每組5只。

1.4給藥劑量和方法津力達低、中、高劑量分別為0.75、1.5、3.0 g/kg，中劑量津力達+通心絡劑量為：1.5 g/kg津力達+0.4 g/kg通心絡，二甲雙胍為50 mg/kg，沙格列汀為1 mg/kg，均以0.5% CMC-Na膠體溶液配制，NC及DM組大鼠則給予等容量的0.5% CMC-Na。給藥方法：每日灌胃1次(1 ml/100 g)，持續(xù)8周。

1.5取樣和檢測指標

1.5.1生化指標藥物干預8周后，全部大鼠禁食、不禁水12 h后稱重。腹腔注射10%水合氯醛 0.4 ml/100 g麻醉動物，腹主動脈采血，靜置、離心、分離血清于-20 ℃保存，檢測FBG、HbA1C、空腹胰島素(FINS)、C肽、GH、IGF-1、IGFBP-1。

1.5.2肝臟生長激素受體mRNA的檢測留取大鼠部分肝臟組織，置液氮罐中速凍，-80 ℃凍存。采用實時(real-time) PCR檢測肝臟生長激素受體(growth hormone receptor，GHR)的mRNA，以GAPDH為內參。步驟：Trizol法提取樣品總RNA→合成單鏈cDNA→實時定量PCR擴增→數據分析。引物：Primer F 5′ TGCTTTGCCTTTGCCTGAC 3′，Primer R 5′ ACATTCACTCTCACGCTCTCC 3′，183 bps。

2結果

2.1大鼠一般狀況改變正常對照組大鼠一般狀況良好，精神佳，反應靈敏，毛發(fā)光澤，體重增加，攝食、飲水及小便無明顯改變。糖尿病模型組大鼠一般狀況較差，精神不振，毛發(fā)雜亂無光澤，反應遲緩，活動量減少，出現“三多一少”癥狀?；顨r體重NC組(427.5±14.4) g，DM組(221.0±8.6) g，津力達各組 233～277 g；各藥物干預組大鼠一般狀況改善程度不同。

2.2FBG、HbA1C、FINS、C肽水平改變同正常對照組相比，模型組FBG、HbA1C水平升高，有統(tǒng)計學差異(P<0.01)；FINS、C肽水平降低，有統(tǒng)計學差異(P<0.01)。與模型組相比，中劑量津力達組、高劑量津力達組、中劑量津力達+通心絡組、二甲雙胍組、沙格列汀組FBG水平降低(P<0.05，P<0.01)；中劑量津力達組、高劑量津力達組、中劑量津力達+通心絡組、二甲雙胍組HbA1C水平降低(P<0.05，P<0.01)；低劑量津力達組、中劑量津力達組、高劑量津力達組、中劑量津力達+通心絡組、二甲雙胍組FINS水平升高(P<0.05，P<0.01)；各藥物治療組C肽水平均升高(P<0.05，P<0.01)。詳見表1。

2.3GH、IGF-1、IGFBP-1水平改變與正常對照組相比，模型組GH、IGFBP-1水平升高，有統(tǒng)計學差異(P<0.01)，IGF-1水平下降，有統(tǒng)計學差異(P<0.01)。同模型組相比，各藥物治療組GH水平均降低(P<0.01)，IGF-1水平均升高(P<0.01)；低劑量津力達組、高劑量津力達組、中劑量津力達+通心絡組IGFBP-1水平降低(P<0.05，P<0.01)。詳見表1。

2.4肝臟GHR mRNA水平改變與正常對照組相比，模型組肝臟GHR mRNA水平降低(P<0.05)；與模型組相比，中劑量津力達+通心絡組、二甲雙胍組肝臟GHR mRNA水平升高(P<0.05，P<0.01)。見圖1。

表1各組大鼠FBG、FINS、C肽、HbA1C、GH、IGF-1、IGFBP-1水平的變化

Table 1Changes in the levels of FBG，FINS，C peptide，HbA1C，GH，IGF-1，IGFBP-1 in various groups of rats

組別FBG(cB/mmol·L-1)FINS(zB/μIU·ml-1)C肽(ρB/ng·ml-1)HbA1C(%)GH(ρB/μg·L-1)IGF-1(ρB/μg·L-1)IGFBP-1(ρB/μg·L-1)NC5.87±0.5566.50±0.769.69±0.231.51±0.2911.44±0.9829.31±0.8078.94±4.02DM14.99±1.11**20.93±2.42**2.70±0.30**3.64±0.43**28.51±1.31**8.17±0.41**147.28±6.62**JL13.25±0.9230.08±3.02△5.49±1.47△△3.12±0.2125.49±0.72△△13.56±0.69△△132.10±8.73△JM12.10±0.33△38.77±1.41△△4.38±0.61△2.34±0.19△22.80±0.46△△14.01±0.38△△152.94±10.22JH11.17±0.64△△43.59±3.30△△7.09±0.47△△1.81±0.52△△19.36±0.49△△16.45±1.03△△117.43±4.90△△JM+T9.94±0.37△△56.07±4.11△△7.45±0.61△△1.33±0.16△△18.81±0.77△△23.44±0.90△△119.91±8.43△△Met8.87±0.23△△63.21±2.76△△4.47±1.21△△1.35±0.22△△14.89±1.04△△19.98±0.81△△138.67±4.17Sax12.39±0.63△32.49±5.178.86±0.31△△2.96±0.3022.31±0.77△△14.43±0.83△△145.26±5.31

**P<0.01，與正常對照組比較；△P<0.05，△△P<0.01，與糖尿病模型組比較；FBG：空腹血糖；FINS：空腹胰島素；HbA1C：糖化血紅蛋白；GH：生長激素；IGF-1：胰島素樣生長因子-1；IGFBP-1：胰島素樣生長因子結合蛋白-1；NC：正常對照組；DM：糖尿病模型組；JL、JM、JH：津力達低、中、高劑量組 (0.75、1.5、3.0 g/kg)；JM+T：津力達 (0.75 g/kg)+通心絡(0.4 g/kg) 組；Met：二甲雙胍組；Sax：沙格列汀組

圖1　肝臟生長激素受體 mRNA水平的改變 Figure 1　Changes in the levels of liver growth hormone receptor mRNA NC:正常對照組;DM:糖尿病模型組;JL、JM、JH:津力達低、中、高劑量組(0.75、1.5、3.0 g/kg)；JM+T:津力達(0.75 g/kg)+通心絡(0.4 g/kg)組;Met:二甲雙胍組;Sax:沙格列汀組； *P<0.05,與 正常對照組比較； △P<0.05, △△P<0.01，與糖尿病模型組比較

3討論

垂體前葉細胞分泌的GH具有促進組織生長、調節(jié)物質代謝等作用，可促進肝葡萄糖合成、拮抗胰島素、抑制葡萄糖的利用，從而升高血糖[5]。正常情況下，GH的水平受多種機制調節(jié)：下丘腦通過生長激素釋放激素(growth hormone-releasing hormone，GHRH)和生長抑素對GH進行雙向調節(jié)，同時GH的下游信號產物IGF-1也可負反饋調節(jié)GH[1,6]。IGF-1是GH與細胞表面GHR結合后產生的，具有類胰島素作用[7]，循環(huán)中IGF-1主要來自肝臟。GH/IGF-1軸可共同調節(jié)機體內分泌代謝系統(tǒng)，對維持糖代謝的穩(wěn)定有重要作用[8,9]。GHR、生長激素結合蛋白(growth hormone binding protein，GHBP)、IGFBPs等也可調節(jié)GH及IGF-1的水平及生物活性。1型糖尿病和2型糖尿病均存在GH/IGF-1軸的紊亂，該軸的異常與血糖控制不佳、胰島素抵抗、胰島素用量增加相關。長期高血糖狀態(tài)下，多種因素可升高GH水平[6,10]。研究表明，糖尿病病人對GHRH刺激存在過度反應，且胰島素對肝細胞GHR的表達有促進作用，故患糖尿病時，循環(huán)內胰島素水平降低或胰島素抵抗，致肝GHR表達減少，而循環(huán)中高GH也降低肝臟GHR表達，導致肝臟GH抵抗，最終導致IGF-1合成減少[11]，削弱了對GH的負反饋作用，GH持續(xù)處于高水平狀態(tài)。不僅如此，糖尿病時循環(huán)中IGFBP-1水平升高，過多的IGFBP-1則形成磷酸化IGFBP-1,磷酸化的 IGFBP-1具有IGF-1高親和力，可致循環(huán)內游離IGF-1減少[12]。

糖尿病在祖國醫(yī)學范疇中屬“消渴癥”，系“脾”(即胰腺)功能異常，水谷精微運化失調，致煩渴、小便頻數、倍食而消瘦。中醫(yī)“脾”具有運化水谷和津液的作用，可產生精微(精氣)，體內的衛(wèi)氣來自水谷運化后的精微，可附行經脈，輸布全身，外至皮毛，內至臟腑?！捌ⅰ惫δ芙∪趴杀ＷC正常的水谷運化及輸布。津力達顆粒包括人參、黃芪、黃精、玉竹、蒼術、佩蘭、茯苓、黃連、桂枝等多味中藥，其中人參、玉竹等可益脾養(yǎng)陰，蒼術、桂枝等可化濕溫脾，通過“健脾運精”，恢復“脾”之生機，改善營養(yǎng)、水津的轉化及輸布，從而達到降低血糖，減少消渴癥狀之效[4]。已有研究表明，津力達顆粒對胰島B細胞具有保護作用，可增加胰島素的分泌，改善胰島素抵抗[13]。

本研究通過檢測FBG、FINS、C肽、HbA1C等指標，以反映大鼠血糖及胰島素的功能變化。結果發(fā)現，模型組FBG、HbA1C升高，FINS、C肽降低，而中、高劑量津力達顆粒治療后各指標較模型組均有改善，且高劑量組效果優(yōu)于中劑量組，表明津力達顆?？山档脱?，改善胰島細胞功能。中劑量津力達+通心絡組降糖作用及升高FINS、C肽作用明顯優(yōu)于單用中劑量津力達組，表明通心絡也有相同作用，合用后作用相加。通過檢測GH、IGF-1、IGFBP-1及肝GHR，以反映大鼠GH/IGF-1軸的變化。結果發(fā)現，模型組血清GH、IGFBP-1水平明顯升高，IGF-1水平明顯降低，同時伴肝臟GHR表達降低。表明1型糖尿病大鼠體內GH/IGF-1軸紊亂，GH持續(xù)高水平及低IGF-1水平與血糖控制不佳相關。低、中、高津力達顆粒治療后均使GH水平降低、IGF-1水平增加，且藥效隨著劑量的增加而增強，表明津力達顆粒對GH/IGF-1軸紊亂有改善作用，可降低GH水平，改善GH抵抗，升高IGF-1從而有利于降低血糖，改善胰島素抵抗。高劑量津力達組還可降低IGFBP-1水平，間接增加游離IGF-1含量，提示津力達顆?？赏ㄟ^修復GH/IGF-1軸功能，從而降低血糖。中劑量津力達顆粒與通心絡的復方治療可降低GH、IGFBP-1水平，升高IGF-1含量，使肝GHR表達上調，且作用明顯高于中劑量津力達組，表明通心絡也有調節(jié)GH/IGF-1軸的作用，兩者合用后作用相加，可進一步促進GH/IGF-1軸功能的恢復，但其機制有待研究。從總體療效來看，高劑量津力達組、中劑量津力達+通心絡復方治療組與二甲雙胍組相近，可以肯定津力達顆粒的降糖作用。此外，中藥制劑的作用為多靶點，津力達與通心絡的合用可提高療效，減少不良反應，改善糖尿病癥狀及其并發(fā)癥。

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[修回日期]2015-02-06

[本文編輯]吳銘權