過表達BMP9對人肺鱗狀細胞癌細胞NCI-H520遷移和侵襲的影響*

王靜，鄧芳，李亞，范夢恬，郭楊柳，施瓊△

(重慶醫(yī)科大學檢驗醫(yī)學院臨床檢驗診斷學教育部重點實驗室，重慶 400016)

[摘要]目的： 探討骨形態(tài)發(fā)生蛋白9(bone morphogenetic protein 9，BMP9)對人肺鱗狀細胞癌細胞NCI-H520遷移和侵襲的影響及其機制。方法: 采用RT-PCR和Western blot法分別檢測NCI-H520細胞和正常人支氣管上皮(HBE)細胞中BMP9的mRNA和蛋白表達水平；用AdBMP9感染NCI-H520細胞，RT-PCR和Western blot法驗證BMP9的變化；應用劃痕愈合實驗檢測各組細胞的遷移能力， Transwell小室檢測遷移和侵襲能力，并用RT-PCR和Western blot法檢測遷移相關因子基質金屬蛋白酶2 (MMP2) 的mRNA和蛋白水平。Western blot法檢測BMP-Smad 經典通路中Smad1/5的磷酸化水平(p-Smad1/5)。用BMP特異性拮抗劑AdNoggin與AdBMP9共處理NCI-H520細胞，檢測p-Smad1/5及細胞遷移能力的變化。結果: BMP9在NCI-H520細胞中的mRNA和蛋白水平均比在HBE細胞中低；AdBMP9感染的NCI-H520細胞中 BMP9的mRNA和蛋白水平均明顯升高，細胞遷移和侵襲能力均明顯下降，MMP2的mRNA和蛋白水平下降，且p-Smad1/5的表達水平明顯上調。在NCI-H520細胞中，Noggin能有效逆轉BMP9導致的p-Smad1/5升高和細胞遷移抑制能力。 結論: 外源性BMP9轉入肺鱗癌細胞NCI-H520可明顯抑制其遷移侵襲的能力，該抑制作用可能與BMP-Smad信號通路的激活有關。

[關鍵詞]骨形態(tài)發(fā)生蛋白9； 肺鱗狀細胞癌； 細胞遷移； 細胞侵襲

[中圖分類號]R735.7; R730.23 [文獻標志碼]A

doi:10.3969/j.issn.1000-4718.2015.11.001

[文章編號]1000-4718(2015)11-1928-05

[收稿日期]2015-08-07[修回日期] 2015-10-12

[基金項目]*國家自然科學基金資助項目(No. 81170514; No. 81470318)

通訊作者△Tel： 0531-82169867； E-mail： yuyuandoctor@163.com

Effect of BMP9 over-expression on migration and invasion of human lung squamous-cell carcinoma NCI-H520 cellsWANG Jing, DENG Fang, LI Ya, FAN Meng-tian, GUO Yang-liu, SHI Qiong

(KeyLaboratoryofClinicalLaboratoryDiagnostics,MinistryofEducation,CollegeofLaboratoryMe-dicine,ChongqingMedicalUniversity,Chongqing400016,China.E-mail:anniesq8718@aliyun.com)

ABSTRACT[]AIM: To investigate the effect of bone morphogenetic proteins 9 (BMP9) on the migration and invasion abilities of human lung squamous-cell carcinoma NCI-H520 cells and its mechanism. METHODS: The expression of BMP9 at mRNA and protein levels in the NCI-H520 cells and human bronchial epithelial (HBE) cells was detected by RT-PCR and Western blot. The NCI-H520 cells were transfected with the recombinant adenovirus AdBMP9 and the expression of BMP9 at mRNA and protein levels was validated by RT-PCR and Western blot. The migration and invasion abilities of the NCI-H520 cells were determined by wound-healing and Transwell assays. The mRNA and protein levels of the migration-related factor matrix metalloproteinase 2 (MMP2) were detected by RT-PCR and Western blot. The level of phosphorylated Smad1/5 (p-Smad1/5) was detected by Western blot. Meanwhile, NCI-H520 cells were treated with BMP specific antagonist AdNoggin and AdBMP9. The level of p-Smad1/5 and the cell migration ability were measured by Western blot, wound-healing and Transwell assays. RESULTS: The expression of BMP9 at mRNA and protein levels was lower in NCI-H520 cells than that in HBE cells. After AdBMP9 was stably transfected into the NCI-H520 cells, the expression of BMP9 at mRNA and protein levels was significantly up-regulated, cell migration and invasion abilities were significantly decreased, and the mRNA and protein levels of MMP2 were decreased. Meanwhile, the level of p-Smad1/5 was increased. Noggin reversed BMP9-caused the increase in p-Smad1/5 and the decrease in cell migration ability. CONCLUSION: Over-expression of BMP9 inhibits the migration and invasion abilities of lung squamous-cell carcinoma NCI-H520 cells. The activation of BMP-Smad signaling pathway may be involved in this inhibitory process.

[KEY WORDS]Bone morphogenetic protein 9; Lung squamous-cell carcinoma;cell migration; Cell invasion

肺癌是全球最常見的惡性腫瘤之一，每年新增的肺癌患者已超過 120 萬人,是惡性腫瘤引起死亡的首要原因[1]。非小細胞肺癌(non-small-cell lung cancer，NSCLC)包括腺癌、鱗狀細胞癌和大細胞肺癌，約占肺癌總數(shù)的 85%左右[2]。據(jù)統(tǒng)計，肺鱗癌近十年的發(fā)病率成倍增長，特別是在大中城市[3]。而侵襲和轉移是造成非小細胞肺癌患者療效差和死亡的主要原因[4]。因此，探討非小細胞肺癌侵襲、轉移的分子生物學機制可望為其臨床治療提供新的策略。

骨形態(tài)發(fā)生蛋白(bone morphogenetic protein，BMP)是轉化生長因子β超家族中的一員，對胚胎發(fā)育及維持體內組織器官的平衡等具有重要的生物學作用[5]。BMP主要通過與I型、Ⅱ型受體結合，激活Smad1/5/8使其磷酸化水平升高，與Smad4結合后入核激活下游的轉錄因子；拮抗劑Noggin可與BMP特異性結合，阻止BMP與細胞表面受體結合從而抑制BMP發(fā)揮生物學效應[6]。近年來，有關BMP信號通路與腫瘤發(fā)生的研究報道逐漸增多，尤以BMP2、3、4、5、6、7最為常見[7]。BMP9是BMPs家族中發(fā)現(xiàn)較晚、研究較少的一員，在不同類型的腫瘤中發(fā)揮不同的效應[8-9]，而目前BMP9在肺癌中的作用及作用機制還鮮有報道。

本研究選擇重組腺病毒AdBMP9感染的方式過表達BMP9，檢測BMP9對肺鱗癌細胞NCI-H520遷移和侵襲的影響，并對其分子生物學機制進行探討，旨在為肺癌的治療提供新的實驗依據(jù)。

材料和方法

1細胞株及腺病毒

人肺鱗癌細胞株NCI-H520購自ATCC；人胚腎細胞株HEK293及重組腺病毒AdGFP、AdRFP、AdBMP9、AdNoggin均由本實驗室保存?zhèn)溆谩?/p>

2主要試劑

DMEM高糖培養(yǎng)基、RPMI-1640培養(yǎng)基和胎牛血清均購自Gibco；TRIzol購自Invitrogen；逆轉錄試劑盒購自TaKaRa；RT-PCR引物由上海百力格公司合成；Transwell小室購自Corning；結晶紫購自上海碧云天生物技術有限公司；凝聚胺(polybrene)、MTT和基質膠均購自Sigma；抗BMP9抗體購Abcam；抗MMP2抗體購自沈陽萬類生物；抗Smad1/5/8抗體購自Santa Cruz；抗p-Smad1/5抗體購自CST；抗β-actin抗體、羊抗兔IgG/辣根過氧化物酶標記的 II 抗和羊抗鼠IgG/辣根過氧化物酶標記的 II 抗均購自北京中杉金橋公司。

3實驗方法

3.1細胞培養(yǎng)和病毒感染將AdGFP、AdRFP、AdBMP9和AdNoggin分別接種于HEK293細胞，用含10% 胎牛血清的DMEM(含100 U/L青霉素和100 mg/L 鏈霉素)擴增培養(yǎng)。用含10% 胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基(含1×105U/L 青霉素和100 mg/L 鏈霉素)培養(yǎng)NCI-H520細胞，將擴增的腺病毒感染NCI-H520細胞，置37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，以不感染病毒的細胞作為空白對照。

3.2劃痕愈合實驗檢測細胞遷移能力NCI-H520細胞以5×105/well接種于6孔板中，待細胞愈合率達80%時，加入polybrene和重組腺病毒，6 h后用10 μL小槍頭行“一”字劃痕，PBS清洗3次，加入無血清的RPMI-1640培養(yǎng)基，倒置顯微鏡下觀察并照相，此時記為0 h，37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)48 h后在同一觀察點觀察劃痕愈合情況并照相，通過測量多個區(qū)域的劃痕寬度取平均值，計算各組細胞的劃痕愈合率。劃痕愈合率(%)=(0 h劃痕寬度-48 h劃痕寬度)/0 h劃痕寬度×100%。實驗重復3次。

3.3Tanswell小室檢測細胞遷移和侵襲能力將腺病毒感染48 h的各組NCI-H520細胞制成無血清的單細胞懸液，將含有8×104細胞的400 μL懸液加入上室(侵襲實驗需鋪基質膠，基質膠與RPMI-1640培養(yǎng)基按1∶7比例，鋪50 μL)，下室中加入700 μL含20%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基，每組設3個復孔。37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后，取出小室，用棉簽拭去小室孔膜上層細胞，4%多聚甲醛固定小室20 min，結晶紫染色30 min，干燥后于顯微鏡下計數(shù)，每個小室至少計數(shù)10個視野，計算平均值，實驗重復3次。

3.4RT-PCR法檢測細胞中相關因子的mRNA表達取重組腺病毒感染48 h及未感染病毒的細胞，TRIzol法提取各組細胞總RNA，兩步法逆轉錄，以逆轉后的cDNA進行PCR擴增，PCR反應體系為20 μL，引物序列及產物長度見表1。反應條件為：94 ℃ 30 s；94 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，34個循環(huán)；72 ℃ 30 s。采用Quantity One軟件對結果進行灰度值分析，并以目的條帶與內參照條帶的灰度值之比，計算BMP9、MMP2和Noggin的相對表達水平，實驗重復3次。

表1　RT-PCR引物序列

3.5Western blot檢測BMP9、MMP2及BMP-Smad信號通路關鍵分子的蛋白水平收集病毒感染48 h的NCI-H520細胞，提取總蛋白，與5×蛋白上樣緩沖液混合，沸水煮10 min，BCA法檢測蛋白濃度，取50 μg蛋白樣品，經SDS-PAGE分離蛋白、轉膜、BSA封閉、4 ℃孵育 I 抗(稀釋比例為：BMP9 1∶500，Smad1/5/8 1∶1 000，p-Smad1/5 1∶1 000，β-actin 1∶1 000)過夜，洗膜，37 ℃孵育 II 抗(稀釋比例為1∶5 000)1 h，洗膜，化學發(fā)光顯影，采用Quantity One軟件對各組電泳條帶進行灰度值分析，并與內參照β-actin相比，計算各蛋白相對表達水平，實驗重復3次。

4統(tǒng)計學處理

采用SPSS 17.0軟件對各實驗結果進行統(tǒng)計學分析，各實驗均重復3次；數(shù)據(jù)以均數(shù)±標準差(mean±SD)表示，采用t檢驗比較兩組間差異，兩組以上比較采用單因素方差分析，并用Bonferroni校正的t檢驗進行組間兩兩比較。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

結果

1BMP9在肺鱗癌細胞NCI-H520中的表達低于正常支氣管上皮細胞HBE

RT-PCR檢測結果顯示，肺鱗癌細胞NCI-H520中BMP9的mRNA表達水平較正常支氣管上皮細胞HBE低(P<0.05)，Western blot結果顯示，NCI-H520細胞中BMP9的蛋白表達水平較HBE明顯降低(P<0.05)，見圖1。

Figure 1.The expression of BMP9 at mRNA and protein levels in the HBE cells and NCI-H520 cells.Mean±SD.n=3.*P<0.05vsHBE group.

圖1HBE細胞和NCI-H520細胞中BMP9的mRNA和蛋白表達水平

2重組腺病毒AdBMP9能有效上調NCI-H520細胞中BMP9的表達

分別將重組腺病毒AdGFP和AdBMP9感染NCI-H520細胞，48 h后感染效率達80%以上。RT-PCR和Western blot結果顯示，NCI-H520感染AdBMP9后，BMP9表達水平較陰性對照組明顯上調(P<0.01)，由此證實BMP9在NCI-H520中成功高表達，見圖2。

Figure 2.The infection efficiency of recombinant adenovirus AdBMP9 in the NCI-H520 cells, and the mRNA and protein levels of BMP9 in the NCI-H520 cells detected after over-expression of BMP9. Mean±SD.n=3.**P<0.01vsGFP group.

圖2AdBMP9感染NCI-H520細胞的感染效率及過表達BMP9后NCI-H520細胞中BMP9的mRNA和蛋白表達水平

3NCI-H520細胞中過表達BMP9可抑制細胞的遷移和侵襲，且MMP2的mRNA和蛋白水平均降低

劃痕愈合實驗顯示，空白組48 h的劃痕愈合率(64.08±4.45)%，與陰性對照組[(59.01±3.36)%]比較，差異無統(tǒng)計學意義，而感染AdBMP9組的劃痕愈合率[(25.43±2.30)%]與陰性對照組相比明顯降低(P<0.01)。Transwell遷移實驗顯示，感染AdBMP9組中NCI-H520細胞穿過小室膜的細胞數(shù)顯著少于空白組和陰性對照組(P<0.01)。Transwell侵襲實驗顯示，感染AdBMP9組中穿過基質膠的NCI-H520細胞數(shù)顯著少于空白組和陰性對照組(P<0.01)。RT-PCR和Western blot結果顯示，感染AdBMP9組中MMP2表達水平較陰性對照組明顯降低(P<0.05)，見圖3。

Figure 3.The effects of BMP9 on the migration and invasion abilities of the NCI-H520 cells. The mRNA and protein levels of MMP2 in the NCI-H520 cells were detected after over-expression of BMP9. Mean±SD.n=3.*P<0.05,**P<0.01vsGFP group.

圖3BMP9對NCI-H520細胞遷移侵襲的影響及MMP2 mRNA和蛋白水平的變化

4過表達BMP9后，NCI-H520細胞中BMP-Smad經典通路被激活，p-Smad1/5水平明顯升高

Western blot結果顯示，NCI-H520細胞過表達BMP9后，p-Smad1/5水平與空白組和陰性對照組相比明顯升高(P<0.01)，說明BMP9有效激活了NCI-H520中BMP-Smad經典通路，見圖4。

Figure 4.The level of p-Smad1/5 in the NCI-H520 cells after over-expression of BMP9. Mean±SD.n=3.**P<0.01vsGFP group.

圖4Western blot檢測過表達BMP9后，NCI-H520細胞中p-Smad1/5的表達水平

5BMP拮抗劑Noggin能有效逆轉BMP9導致的p-Smad1/5升高和細胞遷移抑制能力

用BMP特異性拮抗劑Noggin的腺病毒(AdNoggin)與AdBMP9共同感染NCI-H520細胞48 h后，AdNoggin感染細胞效率達80%以上；RT-PCR結果顯示，加AdNoggin組中Noggin的表達水平明顯升高，證實Noggin在細胞中成功高表達。Western blot結果顯示，AdNoggin與AdBMP9共感染組中p-Smad1/5表達水平比對照組明顯降低，說明AdNoggin對BMP-Smad通路的拮抗作用是有效的。同時，用AdNoggin處理NCI-H520細胞后檢測細胞的遷移能力，劃痕愈合實驗和Transwell遷移實驗結果顯示，Noggin能有效逆轉BMP9對NCI-H520細胞的遷移抑制能力(P<0.01)，見圖5。

討論

肺癌作為一種最常見的原發(fā)性惡性腫瘤，其發(fā)生是一個多基因參與、多步驟、 多階段的過程，目前對尋找治療肺癌的新靶點仍十分迫切。劉麗等[10]應用基因芯片篩出早期肺鱗癌的發(fā)生與多個基因的表達變化有關。隨著人們對腫瘤研究的深入，發(fā)現(xiàn)BMPs在很多類型腫瘤的發(fā)生發(fā)展中具有重要作用。Jiang等[11]和Fei等[12]在鼠肺癌模型中發(fā)現(xiàn)，BMP2合成增加會增加腫瘤發(fā)生率并影響預后。BMP2在人非小細胞肺癌組織中有高表達，并能刺激肺腺癌細胞A549的體外生長和侵襲[13]。此外，BMP3B在肺癌中的表達水平較正常肺細胞株明顯降低；BMP6的蛋白表達水平在非小細胞肺癌中較正常組織有輕微的增高[14]。BMP9作為BMPs一員，在不同腫瘤中的作用不盡相同，在肝癌、卵巢癌中BMP9可促進腫瘤細胞的增殖[8, 15]；在前列腺癌、乳腺癌、胃癌中卻有抑制腫瘤生長、轉移、侵襲的作用[9, 16-17]。Ye等[9]發(fā)現(xiàn)BMP9在前列腺癌組織及細胞中低表達，過表達BMP9可抑制前列腺癌 PC3 細胞的生長、侵襲、轉移。在乳腺癌中，BMP9可抑制乳腺癌細胞的增殖和遷移，其作用與ERK1/2和PI3K/AKT信號通路有關[15]。然而，BMP9在肺癌中的作用及作用機制尚缺乏研究，鮮有報道。

本研究發(fā)現(xiàn)，BMP9在肺鱗癌細胞NCI-H520中的表達明顯低于正常支氣管上皮細胞HBE。本研究采用重組腺病毒AdBMP9感染NCI-H520細胞，使其過表達BMP9后，檢測到過表達BMP9的肺鱗癌細胞NCI-H520的遷移和侵襲能力顯著降低。BMP-Smad信號通路作為BMPs發(fā)揮生物學作用的經典信號通路。在過表達BMP9的NCI-H520細胞中，我們發(fā)現(xiàn)BMP-Smad經典通路中Smad1/5的磷酸化水平明顯增高。另外，用BMP特異性拮抗劑Noggin的重組腺病毒AdNoggin聯(lián)合AdBMP9處理NCI-H520細胞后，p-Smad1/5表達水平有所下降，且細胞劃痕愈合率及Transwell小室遷移率也有顯著的降低。以上結

Figure 5.The infection efficiency of AdRFP and AdNoggin in the NCI-H520 cells, the expression of Noggin mRNA, BMP9 mRNA and p-Smad1/5 protein in the NCI-H520 cells， and the migration ability of NCI-H520 cells after treated with BMP specific antagonist AdNoggin and AdBMP9. Mean±SD.n=3.**P<0.01vsGFP group and RFP+BMP9 group.

圖5BMP特異性拮抗劑Noggin處理細胞后，Noggin、BMP9的mRNA表達水平和p-Smad1/5的變化，以及細胞遷移能力的變化。

果說明BMP9可能通過經典的BMP-Smad信號通路調節(jié)肺癌的生長與轉移等生物學活性。

綜上所述，過表達BMP9能夠顯著抑制肺鱗癌細胞NCI-H520的遷移和侵襲，其機制可能與激活BMP-Smad經典信號通路有關，由此BMP9可能成為肺癌治療的一個新靶點。由于BMP激活的通路還包括非經典通路如p38 MAPK、ERK、PI3K-AKT等信號通路，BMP9是否還可通過非經典通路，或還有BMP-Smad經典信號通路那些下游靶基因調控肺癌的生長、轉移和侵襲，還需進一步的研究。

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(責任編輯： 盧萍， 羅森)