BARF1表達下調(diào)通過活化caspase依賴的線粒體通路誘導EBV陽性胃癌細胞凋亡

劉俊1，張雪林2，任永生3，鄭新1△

(1湖北醫(yī)藥學院附屬東風醫(yī)院胃腸外科，湖北 十堰 442008； 湖北醫(yī)藥學院2護理學院，3基礎醫(yī)學院，湖北 十堰 442000)

[摘要]目的： 研究BARF1表達下調(diào)對EBV陽性胃癌細胞凋亡的影響，以及BARF1基因沉默介導細胞凋亡的分子機制。方法: siRNA和NCsiRNA分別轉染NUGC3和SNU719細胞，運用Western blot測定細胞中BARF1、Bcl-2、Bax、細胞色素C、caspase 3和caspase 9的蛋白表達；RT-PCR測定BARF1、Bcl-2和Bax mRNA的表達；臺盼藍染色法測定細胞存活率；Annexin V-FITC/PI染色法和流式細胞儀測定細胞凋亡；細胞凋亡因子抗體芯片分析細胞中凋亡相關蛋白的表達；線粒體膜電位檢測試劑盒測定線粒體膜電位；免疫共沉淀檢測細胞中Apaf-1和caspase 9的相互作用。結果: 與空白對照組和陰性對照組相比， BARF1基因沉默顯著誘導NUGC3和SNU719細胞凋亡，而線粒體膜電位顯著降低。BARF1沉默基因能促進促凋亡蛋白的表達并抑制抗凋亡蛋白的表達，Bcl-2/Bax比例顯著降低；而caspase抑制劑能抑制由BARF1基因沉默介導的細胞凋亡。在siRNA轉染的細胞中，caspase 3和caspase 9蛋白發(fā)生裂解，細胞色素C的濃度顯著高于陰性對照組，Apaf-1蛋白與caspase 9蛋白在細胞質(zhì)中能夠發(fā)生相互作用。結論: BARF1基因沉默通過線粒體途徑調(diào)節(jié)Bcl-2和Bax蛋白的表達進而誘導NUGC3和SNU719細胞凋亡，并呈caspase通路依賴關系。

[關鍵詞]BARF1； EB病毒； 胃癌； 細胞凋亡； 線粒體通路

[中圖分類號]R730.23[文獻標志碼]A

doi:10.3969/j.issn.1000-4718.2015.11.008

[文章編號]1000-4718(2015)11-1979-07

[收稿日期]2015-04-28[修回日期] 2015-07-14

通訊作者△Tel: 0472-2178435; E-mail: xbkld@163.com

Down-regulated BARF1 expression induces EBV-positive gastric carcinoma cell apoptosis via activating caspase-dependent mitochondrial pathwayLIU Jun1, ZHANG Xue-lin2, REN Yong-sheng3, ZHENG Xin1

(1DepartmentofGastrointestinalSurgery,TheAffiliatedDongfengHospital,HubeiUniversityofMedicine,Shiyan442008,China;2CollegeofNursing，3CollegeofBasicMedicine,HubeiUniversityofMedicine,Shiyan442000,China.E-mail:Zhengxin19740912@163.com)

ABSTRACT[]AIM: To investigate the effects of BARF1 down-regulation on EBV-positive gastric carcinoma cell apoptosis, and the molecular mechanisms by BARF1 silencing-mediated apoptosis. METHODS: After NUGC3 and SNU719 cells were transfected with NCsiRNA and siRNA, respectively, the protein levels of BARF1, Bcl-2, Bax, cytochrome C, caspase 3 and capase 9 were detected by Western blot, and the mRNA expression of BARF1, Bcl-2 and Bax was determined by RT-PCR. The cell viability was measured by the method of Trypan blue exclusion and the cell apoptosis was analyzed by flow cytometry analysis with Annexin V-FITC/PI staining. The expression of the apoptosis-related proteins in the cells transfected with siRNA and NCsiRNA was examined by human apoptosis antibody arrays. Mitochondrial membrane potential was determined by flow cytometry. The interaction between Apaf-1 and caspase 9 was confirmed by immunoprecipitation. RESULTS: Compared with untreated and NCsiRNA groups, BARF1 gene silencing significantly inhibited the cell viability， induced apoptosis, and reduced the mitochondrial membrane potential in the NUGC3 and SNU719 cells transfected with siRNA. BARF1 gene silencing up-regulated the expression of pro-apoptotic proteins and down-regulated the expression of anti-apoptotic proteins, and the Bcl-2/Bax ratio was significantly decreased. In BARF1 gene silencing cells, the caspase inhibitor z-VAD-fmk inhibited BARF1 silencing-mediated apoptosis, and significantly increased the levels of cleaved caspase 3 and caspase 9. The concentration of cytochrome C significantly increased as compared with NCsiRNA group, and Apaf-1 interacted with caspase 9 in the cytoplasm. CONCLUSION: BARF1 silencing induces apoptosis via the mitochondrial pathway through regulating the expression of Bcl-2 and Bax proteins in a caspase-dependent manner in the NUGC3 and SNU719 cells.

[KEY WORDS]BARF1; Epstein-Barr virus; Gastric carcinoma; Apoptosis; Mitochondrial pathway

EB病毒(Epstein-Barr virus，EBV)屬于癌癥病毒家族，由于EBV與多種惡性腫瘤的發(fā)生密切相關而備受關注[1]。EBV編碼的LMP1癌基因和BARF1癌基因在調(diào)控關鍵基因表達以及參與EBV介導的腫瘤發(fā)生中具有重要作用[2]。研究發(fā)現(xiàn)，在B細胞淋巴瘤和鼻NK/T細胞淋巴瘤中能檢測到BARF1的表達[3-4]。此外，BARF1在鼻咽癌細胞、EBV相關胃癌細胞以及EBV陽性永生化表皮細胞中高表達[5-6]。

大量研究表明，BARF1基因高表達能夠誘導鼠成纖維細胞和人EBV陰性B細胞的惡性轉化[7]。攜帶BARF1基因的EBV重組體感染的EBV陰性細胞對裸鼠的致瘤能力顯著增強，但細胞中Bcl-2的表達無變化[8]。有研究發(fā)現(xiàn)純化的BARF1蛋白具有很高的促有絲分裂原活性，BARF1能促進鼠成纖維細胞和EBV陰性人B細胞中抗凋亡蛋白Bcl-2的表達，提示BARF1具有抗凋亡作用[9-10]。另有研究發(fā)現(xiàn)，BARF1通過增加Bcl-2和Bax的比例抑制胃癌細胞凋亡[11]。BARF1能促進多種癌細胞增殖，其可能作為一種促癌因子并能夠抑制細胞凋亡通路進而抑制細胞凋亡[12]。但是，BARF1抑制胃癌細胞凋亡的分子機制仍不完全清楚。因此，本文以EBV陽性胃癌細胞系NUGC3和SNU719細胞為研究對象，體外研究BARF1抗細胞凋亡的分子機制。

材料和方法

1細胞株和材料

EBV陽性胃癌細胞系NUGC3和SNU719細胞購自ATCC；胎牛血清、胰蛋白酶和RPMI-1640培養(yǎng)基(Gibco)；雙抗購自北京鼎國昌盛生物技術有限責任公司；DMSO和MTT購自Sigma；脂質(zhì)體2000、RT-PCR試劑盒、TRIzol試劑和Annexin V-FITC/PI試劑盒購自Invitrogen；BCA蛋白濃度檢測試劑盒購自Thermo；抗體(BARF1、Bcl-2、Bax、PARP、caspase 9、caspase 3、細胞色素C和Apaf-1)購自CST；GAPDH抗體和Ⅱ抗IgG購自北京中杉金橋生物技術有限公司；APO LOGIX JC-1線粒體膜電位檢測試劑盒購自上海博升生物科技有限公司；RayBio?人細胞凋亡因子抗體芯片試劑盒購自廣州瑞博奧生物科技有限公司；其它試劑均為國產(chǎn)分析純。

2主要方法

2.1細胞培養(yǎng)NUGC3和SNU719細胞培養(yǎng)于含10%胎牛血清、1%青霉素和1%鏈霉素的RPMI-1640 培養(yǎng)基中，置于37 ℃、5% CO2及飽和濕度的培養(yǎng)箱內(nèi)。待細胞融合度達到80%～90%時進行細胞傳代，按細胞密度轉到相應細胞培養(yǎng)瓶中正常培養(yǎng)。

2.2siRNA合成從GenBank獲得BARF1基因序列(GenBank:V01555)，針對BARF1基因開放閱讀框序列的3個不同位置 (189-207、409-427和545-563 bp)，運用Ambion公司的網(wǎng)上在線軟件(http://www.ambion.com/techlib/misc/siRNA_finder.html)篩選獲得3條不同的siRNA序列，由上海生工合成。通過實驗篩選能顯著干擾BARF1 mRNA表達的siRNA序列，即針對BARF1基因序列409～427 bp區(qū)間的siRNA序列，見表1，同時設計陰性對照siRNA(negative control siRNA，NCsiRNA)序列。

表1　 BARF1基因的siRNA序列

2.3siRNA轉染通過siRNA干擾NUGC3和SNU719細胞中BARF1基因表達，觀察BARF1基因沉默對細胞活力和細胞凋亡的影響。將生長良好的NUGC3細胞和SNU719細胞消化計數(shù)后，以細胞密度為2.5×105cells/well接種到6孔板中，置于37 ℃、5% CO2及飽和濕度的培養(yǎng)箱中，待細胞融合度達到80%～90%時按照脂質(zhì)體2000說明書進行siRNA轉染。轉染的細胞培養(yǎng)4 h后換成完全培養(yǎng)基，以轉染NCsiRNA為陰性對照，未轉染(untreated)的細胞為空白對照，細胞置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)用于后續(xù)實驗。

2.4RT-PCR轉染的細胞經(jīng)消化，離心后收集細胞，按照TRIzol試劑說明書提取總RNA，分光光度計測定其吸光度(A)值，A260/A280的比值在1.8～2.0之間表示RNA純度滿足實驗需求，通過電泳驗證RNA的完整性，RNA保存于-80 ℃。按照RT-PCR試劑盒說明書合成cDNA，反應條件為42 ℃ 1 h；70 ℃ 5 min；4 ℃放置10 min，合成的cDNA置于-80 ℃保存。取1 μL cDNA進行PCR反應，Bcl-2、Bax和GAPDH引物見表2。PCR反應條件為94 °C 5 min； 94 ℃ 30 s，56 ℃ 40 s，72 ℃ 30 s，35個循環(huán)；72 ℃ 10 min。PCR產(chǎn)物進行凝膠電泳，拍照，運用Quantity-One軟件進行結果分析，Bcl-2和Bax的表達量經(jīng)GAPDH標準化表示。

表2Bcl-2、Bax和GAPDH的RT-PCR擴增引物

Table 2. The primers of Bcl-2, Bax and GAPDH for RT-PCR amplification

NameForwardprimer(5’-3’)Reverseprimer(5’-3’)Bcl-2CCTGTGGATGACT-GAGTACCGAGACAGCCAG-GAGAA-ATCABaxGTTTCATCCAG-GATCG-AGCAGCATCTTCTTCCA-GATGG-TGAGAPDHTGCCTCCTGCAC-CACC-AACTCGCCTGCTTCAC-CACCTTC

2.5臺盼藍染色計數(shù)法轉染的細胞分別在0 h、48 h和72 h進行臺盼藍染色后計數(shù)。細胞經(jīng)消化離心后加入PBS制成細胞懸液，取50 μL細胞懸液加入450 μL 0.4%臺盼藍輕輕混勻，室溫染色5 min。取10 μL染色后的細胞懸液加入到細胞計數(shù)板，選擇3個不同區(qū)域計數(shù)。按照下列公式計算細胞存活率：細胞存活率(%)=平均活細胞數(shù)/平均總細胞數(shù)×100%。

2.6流式細胞術檢測細胞凋亡為了研究BARF1表達下調(diào)是否通過激活caspase通路誘導細胞凋亡，選擇caspase抑制劑z-VAD-fmk處理經(jīng)siRNA轉染的胃癌細胞，觀察細胞凋亡情況。轉染的細胞培養(yǎng)72 h后棄掉培養(yǎng)基，PBS洗滌，細胞經(jīng)無EDTA的胰酶消化收集細胞，加入PBS制成細胞懸液。按照Annexin V試劑盒說明書操作，先加入500 μL的binding buffer重懸細胞，再加入5 μL FITC標記的Annexin V和5 μL PI混勻，室溫下避光孵育15 min，運用流式細胞術檢測細胞凋亡。

2.7Western blot檢測蛋白水平轉染的細胞培養(yǎng)72 h后經(jīng)胰酶消化，離心收集細胞，加入RIPA細胞裂解液重懸細胞，超聲破碎、12 000 r/min，4 ℃離心10 min，按照BCA試劑盒說明書測定總蛋白濃度。按照線粒體分離試劑盒說明書分離細胞中的線粒體，并提取線粒體中的總蛋白；收集細胞培養(yǎng)液，5 000 r/min，4 ℃離心10 min去除細胞碎片，PBS洗滌；加入10 mL無血清培養(yǎng)基輕輕吹打混勻，超濾濃縮至10 μL，測定總蛋白濃度。每個樣本取50 μg進行10% SDS-PAGE，轉移到硝酸纖維素膜上，5%脫脂奶粉室溫封閉1 h，分別孵育Ⅰ抗(BARF1、Bcl-2、Bax、PARP、caspase 9、caspase 3、細胞色素C和Apaf-1)，以GAPDH為內(nèi)參照，4 ℃過夜。洗膜，分別孵育AP偶聯(lián)或HRP偶聯(lián)的Ⅱ抗，室溫孵育1 h。AP偶聯(lián)的膜經(jīng)KPL顯影后掃描，HRP偶聯(lián)的膜經(jīng)ECL顯影后掃描，蛋白相對表達量經(jīng)內(nèi)參照歸一化后經(jīng)Quantity One軟件分析。

2.8線粒體膜電位變化的測定線粒體膜電位變化能激活細胞凋亡通路使細胞發(fā)生凋亡，因此運用線粒體膜電位測定試劑盒和流式細胞儀測定NUGC3和SNU719細胞中BARF1表達下調(diào)對線粒體膜電位的影響。JC-1陽離子熒光染料與線粒體結合呈紅色(線粒體膜電位減小)，與凋亡細胞的細胞質(zhì)結合呈綠色(線粒體膜電位升高)。按照APO LOGIX JC-1線粒體膜電位檢測試劑盒說明書測定細胞中線粒體膜電位。細胞經(jīng)胰酶消化，離心收集細胞，加入1× JC-1溶液重懸細胞，輕輕混勻；細胞懸液置于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中孵育15 min，5 000 r/min，離心5 min收集細胞；加入2 mL 1×buffer溶液，輕輕混勻，離心后棄上清；加入1 mL 1×buffer溶液，輕輕混勻后立即用流式細胞儀進行測定分析。FL2通道檢測正常細胞中紅色JC-1標記的線粒體，F(xiàn)L1通道檢測凋亡細胞中綠色JC-1標記的線粒體。

2.9細胞凋亡因子抗體芯片實驗為了研究胃癌細胞中BARF1表達下調(diào)對細胞凋亡相關蛋白表達的影響，將NCsiRNA和siRNA分別轉染NUGC3和SNU719細胞后運用RayBio?人細胞凋亡因子抗體芯片試劑盒測定細胞中與細胞凋亡相關蛋白的表達。按照RayBio?人細胞凋亡因子抗體芯片試劑盒說明書測定胃癌細胞中細胞凋亡相關因子的表達變化，該試劑盒能檢測細胞中至少43種不同的細胞凋亡相關蛋白和GAPDH蛋白，靈敏度達到ng/L。采用G2505C微列陣掃描儀(安捷倫科技公司)對激發(fā)Cy3綠色熒光信號的玻片載體進行掃描，運用6.1.0.4 版本GenePix?微陣列采集分析軟件(安捷倫科技公司)對圖片和數(shù)據(jù)進行分析，使用背景校正法對原始強度值進行分析。生物素標記的蛋白能發(fā)出熒光作為檢測信號，通過熒光信號強弱比較不同孔板之間細胞凋亡蛋白的相對表達量，陽性對照為生物素標記的抗體。生物素標記的IgG直接結合在玻片芯片載體上，如果芯片上的變量相同，則陽性對照的熒光強度相等。運用RayBio抗體列陣分析工具對圖片和數(shù)據(jù)進行背景校正和標準化。

2.10免疫共沉淀實驗將siRNA轉染NUGC3和SNU719細胞后，運用caspase 9 抗體免疫共沉淀caspase 9蛋白，隨后用Apaf-1抗體檢測細胞凋亡蛋白復合體。收集細胞，并提取細胞總蛋白，向蛋白濃度為400 μg的溶液中加入caspase 9抗體和20 μL的Protein A凝膠將caspase 9蛋白免疫共沉淀出來。沉淀物經(jīng)蛋白提取試劑洗滌5次，PBS洗滌1次；加入1×樣品緩沖液(50 mmol/L Tris，pH 6.8, 100 mmol/L溴酚藍,10%甘油)重懸，混勻后90 °C水浴5 min，之后進行SDS-PAGE，除 I 抗是Apaf-1抗體外，后續(xù)步驟同2.8。

3統(tǒng)計學處理

應用SPSS 17.0統(tǒng)計軟件進行相關數(shù)據(jù)分析，結果用均數(shù)±標準差(mean±SD)表示，2組之間的比較采用t檢驗，多組間的比較采用單因素方差分析(one-way ANOVA)。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

結果

1siRNA沉默NUGC3和SNU719細胞中BARF1的表達

RT-PCR結果顯示，NCsiRNA和siRNA轉染細胞72 h后，與NCsiRNA和untreated組比較，siRNA轉染細胞中BARF1 mRNA的表達量顯著降低(P<0.01)；而NCsiRNA轉染細胞和空白細胞中BARF1的mRNA表達量無統(tǒng)計學差異。Western blot結果顯示，NUGC3和SNU719細胞中內(nèi)源性表達BARF1蛋白，而siRNA下調(diào)BARF1蛋白表達，NCsiRNA轉染細胞中BARF1蛋白表達無明顯變化。在細胞培養(yǎng)上清中沒有檢測到BARF1蛋白的表達。研究結果表明，siRNA顯著降低NUGC3和SNU719細胞中BARF1的mRNA和蛋白表達，見圖1。

Figure 1.siRNA-mediated BARF1 down-regulation in the NUGC3 cells and SNU719 cells transfected with NCsiRNA and siRNA. Mean±SD.n=6.**P<0.01vsuntreated and NCsiRNA groups.

圖1siRNA介導NUGC3 和SNU719細胞中BARF1 mRNA和蛋白表達下調(diào)

2BARF1表達下調(diào)抑制胃癌細胞存活

運用臺盼藍染色法測定siRNA轉染NUGC3和SNU719細胞后的細胞存活率。結果顯示，與空白對照和陰性對照組比較，細胞存活率顯著降低(P<0.05)，并呈時間依賴關系，見圖2。

Figure 2.Down-regulation of BARF1 inhibited the viability of NUGC3 and SNU719 cells. Mean±SD.n=3.*P<0.05,**P<0.01vsuntreated and NCsiRNA groups.

圖2BARF1表達下調(diào)抑制NUGC3和SNU719細胞活力

3BARF1表達下調(diào)誘導胃癌細胞凋亡

利用流式細胞術檢測發(fā)現(xiàn)，siRNA轉染的NUGC3和SNU719細胞凋亡率顯著高于陰性對照組和空白對照組細胞(P<0.01)，轉染72 h的細胞凋亡率NUGC3細胞為43.62%，SNU719細胞為40.96%，空白對照組和陰性對照組之間的細胞凋亡率無顯著差異。進一步觀察NUGC3和SNU719細胞中BARF1表達下調(diào)后對典型的細胞凋亡生物標志物PARP蛋白表達的影響，結果顯示，siRNA轉染的細胞中PARP蛋白發(fā)生裂解，明顯觀察到116 kD和89 kD兩條帶，而空白對照組和陰性對照組細胞中PARP蛋白未發(fā)生裂解。研究結果表明，NUGC3和SNU719細胞中BARF1的低表達誘導細胞凋亡，見圖3。

Figure 3.Silencing ofBARF1 expression induced apoptosis in the NUGC3 cells and SNU719 cells. Mean±SD.n=3.**P<0.01vsuntreated group and NCsiRNA group.

圖3沉默BARF1表達誘導NUGC3細胞和 SNU719 細胞凋亡

4BARF1表達下調(diào)改變線粒體膜電位誘導胃癌細胞凋亡

線粒體膜電位檢測結果如圖4所示。siRNA轉染的NUGC3和SNU719細胞中紅色JC-1化合物濃度顯著低于空白對照和陰性對照組細胞(P<0.01)，提示細胞中線粒體膜電位降低。siRNA轉染的細胞凋亡率(JC-1熒光強度)分別為81.8%(NUGC3細胞)和79.6%(SNU719細胞)，顯著高于空白對照組和陰性對照組(P<0.01)。研究結果表明， BARF1表達下調(diào)導致NUGC3和SNU719細胞線粒體膜電位減小，進而誘導細胞凋亡。

5BARF1表達下調(diào)能促進促凋亡蛋白和抑制抗凋亡蛋白的表達

與NCsiRNA轉染組細胞比較，siRNA轉染的細胞中Bax、caspase 3、p21和p27的表達增高，而Bcl-2、cIAP-2和survivin的表達降低。蛋白定量分析發(fā)現(xiàn)，NUGC3和SNU719細胞中Bax的表達量分別增加2.24倍和2.11倍，而Bcl-2的表達量分別增加2.25倍和2.56倍。RT-PCR結果顯示，siRNA轉染的細胞中Bax的mRNA表達量增加，而Bcl-2的mRNA表達量降低，空白對照組和陰性對照組細胞中Bax 和Bcl-2 mRNA的表達量無明顯變化；Bcl-2/Bax mRNA比分別為41.4%(NUGC3細胞)和32.8%(SNU719細胞)，顯著低于陰性對照組(P<0.01)。Western blot結果進一步表明，siRNA轉染細胞中Bax蛋白表達增加，而Bcl-2蛋白表達降低，空白對照組和陰性對照組細胞中Bax 和Bcl-2 蛋白表達量無明顯變化；Bcl-2/Bax 蛋白比分別為21.4%(NUGC3細胞)和34.3%(SNU719細胞)，顯著低于陰性對照組(P<0.01)，見圖5。

Figure 4.The effects of down-regulated BARF1 expression on mitochondrial membrane potential in the NUGC3 cells and SNU719 cells. Mean±SD.n=3.**P<0.01vsuntreated group and NCsiRNA group.

圖4BARF1表達下調(diào)對NUGC3和SNU719細胞線粒體膜電位的影響

6BARF1表達下調(diào)激活caspase通路誘導胃癌細胞凋亡

siRNA轉染的細胞線粒體膜電位降低，細胞凋亡率顯著高于陰性對照組；當加入z-VAD-fmk后，siRNA+z-VAD-fmk組的細胞凋亡率顯著低于siRNA轉染細胞(P<0.01)，提示z-VAD-fmk能抑制由BARF1表達下調(diào)誘導的細胞凋亡。以上結果表明， BARF1表達下調(diào)誘導的胃癌細胞凋亡具有caspase通路依賴性，見圖6。

7BARF1表達下調(diào)促進細胞色素C從線粒體釋放到細胞質(zhì)中形成細胞凋亡復合體

運用Western blot測定BARF1表達下調(diào)誘導胃癌細胞凋亡過程中caspase 3和caspase 9的表達模式。結果如圖7所示，BARF1表達下調(diào)的NUGC3和SNU719細胞中caspase 3和caspase 9蛋白發(fā)生裂解，其裂解程度顯著高于陰性對照組。Western blot測定線粒體和細胞質(zhì)中細胞色素C的表達量，結果顯示siRNA轉染組細胞質(zhì)中的細胞色素C濃度顯著高于陰性對照組，而線粒體中的細胞色素C濃度顯著低于陰性對照組。將siRNA轉染NUGC3和SNU719細胞后，運用caspase 9抗體免疫共沉淀caspase 9蛋白，隨后用Apaf-1抗體檢測細胞凋亡蛋白復合體，結果發(fā)現(xiàn)，Apaf-1抗體能與caspase 9蛋白共沉淀，且siRNA轉染細胞中Apaf-1 蛋白的表達量顯著高于陰性對照，提示有細胞凋亡蛋白復合體形成。

討論

研究表明EBV編碼的BARF1基因在NPC、EBV相關胃癌細胞、B細胞淋巴瘤和鼻NK/T細胞淋巴瘤中表達，因此被視為一種癌基因[13]。BARFl能夠誘導原代猴腎上皮細胞的惡性轉化和人B細胞的永生化[14]。已有研究表明分泌型BARF1蛋白能夠促進細胞增殖，通過促進抗凋亡蛋白Bcl-2和抑制促凋亡蛋白Bax的表達從而抑制細胞凋亡[15]。然而，BARF1蛋白抑制細胞凋亡的分子機制仍不完全清楚。因此，本研究運用siRNA沉默BARF1基因表達對EBV陽性胃癌細胞系NUGC3和SNU719細胞凋亡的影響，探討B(tài)ARF1基因沉默誘導胃癌細胞凋亡的分子機制。

本研究結果顯示，NUGC3和SNU719細胞內(nèi)源性表達BARF1蛋白，而siRNA轉染能夠有效沉默BARF1 mRNA和蛋白的表達。但是，在細胞培養(yǎng)液中沒有檢測到分泌型BARF1的表達，其可能的原因在于用于實驗的細胞培養(yǎng)液較少、濃縮倍數(shù)小(1 000倍)，遠遠低于文獻報道[16]的濃縮倍數(shù)(6 000倍)。本研究利用臺盼藍染色發(fā)現(xiàn)，NUGC3和SNU719細胞中BARF1表達下調(diào)顯著抑制細胞存活率，與文獻[16]報道一致。磷脂酰絲氨酸外翻是細胞凋亡的早期事件，而caspase介導的PARP蛋白裂解是細胞凋亡的主要特征[17]。本研究同時利用流式細胞術和PARP蛋白裂解結果也證實，BARF1基因沉默使BARF1表達下調(diào)能夠誘導NUGC3和SNU719細胞凋亡。

Figure 5.The effect of BARF1 down-regulation on the expression of apoptosis-related proteins in the NUGC3 cells and SNU719 cells transfected with NCsiRNA and siRNA. A: the expression of pro-apoptotic and anti-apoptotic proteins was analyzed using human apoptosis antibody arrays; B: the mRNA expression of Bcl-2 and Bax was determined by RT-PCR; C: Western blot analysis of Bcl-2 and Bax protein expression. Mean±SD.n=3.**P<0.01vsuntreated group and NCsiRNA group.

圖5BARF1表達下調(diào)對NUGC3和SNU719細胞中細胞凋亡相關蛋白表達的影響

經(jīng)典的細胞凋亡途徑包括死亡受體通路和線粒體通路，研究證實線粒體在細胞凋亡過程中發(fā)揮著重要作用，線粒體膜電位降低是線粒體介導細胞凋亡的主要原因[18]。而本研究中發(fā)現(xiàn)BARF1表達下調(diào)能夠導致NUGC3和SNU719細胞線粒體膜電位顯著降低，說明BARF1表達下調(diào)誘導NUGC3和SNU719細胞凋亡可能通過線粒體途徑發(fā)揮作用。bcl-2基因家族是細胞凋亡通路重要的調(diào)節(jié)子，在線粒體介導的細胞凋亡事件中，bcl-2基因家族與線粒體協(xié)同作用促進細胞色素C從線粒體向細胞質(zhì)釋放[19]。以往的研究表明，bcl-2基因家族中的促凋亡蛋白(Bax、Bak和Bim)和抗凋亡蛋白(Bcl-2和Bcl-xL)參與了線粒體介導的細胞凋亡過程，而Bcl-2/Bax比值是判斷細胞凋亡的重要依據(jù)[20]。本研究中發(fā)現(xiàn)在NUGC3和SNU719細胞中BARF1表達下調(diào)后， Bcl-2/Bax比值顯著降低，說明BARF1表達下調(diào)能促細胞凋亡是通過抑制線粒體途徑bcl-2基因家族中抗凋亡蛋白表達、促進促凋亡蛋白表達而發(fā)揮作用的。

Figure 6.Caspase pathway activated byBARF1 gene silencing induced apoptosis of the NUGC3 cells and SNU719 cells. Mean±SD.n=3.*P<0.05vssiRNA group.

圖6BARF1基因沉默激活caspase通路誘導NUGC3和SNU719細胞凋亡

Figure 7.Silencing ofBARF1 expression induced the formation of apoptotic complex. IgG was added to the cell lysates as a negative control.

圖7沉默BARF1表達誘導細胞凋亡復合體的形成

本研究發(fā)現(xiàn)，caspase抑制劑z-VAD-fmk處理siRNA轉染的NUGC3和SNU719細胞，其細胞凋亡率顯著低于陰性對照組，說明BARF1表達下調(diào)誘導的細胞凋亡具有caspase依賴關系。線粒體膜電位降低說明線粒體膜受到損傷，線粒體中細胞色素C釋放到細胞質(zhì)中，進而與Apaf-1和 caspase 9結合形成細胞凋亡蛋白復合體[21]。Western blot結果顯示，BARF1表達下調(diào)能夠促進caspase 3 和caspase 9 的表達，Apaf-1抗體能夠將caspase 9 共沉淀出來，說明BARF1表達下調(diào)促進細胞凋亡復合體的形成。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)siRNA能夠有效抑制EBV陽性胃癌細胞系NUGC3和SNU719細胞中BARF1的表達；并首次證實BARF1表達下調(diào)通過線粒體途徑調(diào)節(jié)促凋亡蛋白Bcl-2和抗凋亡蛋白Bax的表達進而誘導胃癌細胞凋亡，且具有caspase通路依賴關系。但是，本研究目前僅限于體外研究，BARF1表達下調(diào)介導的細胞凋亡和涉及相關的信號通路是否存在于機體內(nèi)有必要進一步研究。

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(責任編輯： 陳妙玲， 羅森)