甘氨酸受體α1亞基在乳鼠心肌細(xì)胞的表達(dá)及損害性因素對(duì)其表達(dá)的影響*

陳楚天1△，陸大祥2，戚仁斌2，王華東2

(1廣東省公共衛(wèi)生研究院,廣東 廣州511430；2暨南大學(xué)醫(yī)學(xué)院病理生理教研室，廣東 廣州 510632)

[摘要]目的： 研究甘氨酸受體α1亞基(GlyRα1)在乳鼠心肌細(xì)胞中的表達(dá)以及脂多糖(LPS)、缺氧/復(fù)氧(H/R)、異丙腎上腺素(ISO)和高糖(HG)對(duì)其表達(dá)的影響。方法: 體外培養(yǎng)乳鼠心肌細(xì)胞，Western blotting方法檢測(cè)心肌細(xì)胞上GlyRα1的表達(dá)；心肌細(xì)胞分別用LPS、H/R、ISO以及HG處理24 h，采用CCK-8試劑檢測(cè)細(xì)胞活力，Western blotting方法檢測(cè)心肌細(xì)胞上GlyRα1的表達(dá)。結(jié)果: Western blotting 方法檢測(cè)到乳鼠心肌細(xì)胞上GlyRα1的表達(dá)；LPS(20 mg/L)、ISO(100 μmol/L)以及HG(25mmol/L)處理心肌細(xì)胞24 h與心肌細(xì)胞H/R 3 h對(duì)心肌細(xì)胞存活率無明顯影響；LPS組、H/R 3 h組以及ISO組心肌細(xì)胞上GlyRα1表達(dá)均高于對(duì)照組(P<0.01)，而HG組心肌細(xì)胞上GlyRα1表達(dá)低于對(duì)照組(P<0.01)。結(jié)論: 乳鼠心肌細(xì)胞上存在GlyRα1，并且一定濃度的LPS、ISO與一定時(shí)間的H/R均可上調(diào)乳鼠心肌細(xì)胞GlyRα1的表達(dá)，而HG可下調(diào)乳鼠心肌細(xì)胞GlyRα1的表達(dá)。

[關(guān)鍵詞]甘氨酸受體α1； 脂多糖； 缺氧/復(fù)氧； 異丙腎上腺素； 高糖

[中圖分類號(hào)]R363[文獻(xiàn)標(biāo)志碼]A

doi:10.3969/j.issn.1000-4718.2015.11.013

[文章編號(hào)]1000-4718(2015)11-2009-07

[收稿日期]2015-04-22[修回日期] 2015-09-21

[基金項(xiàng)目]*遼寧省教育廳科學(xué)研究一般項(xiàng)目(No. L2013399)；沈陽醫(yī)學(xué)院博士科研啟動(dòng)基金資助項(xiàng)目(No. 20133050)

通訊作者△Tel: 024-62217129; E-mail: sunflowerzlq@163.com

Effects of several harmful factors on expression of glycine receptor α1subunit in neonatal rat myocardial cellsCHEN Chu-tian1, LU Da-xiang2, QI Ren-bin2, WANG Hua-dong2

(1GuangdongProvincialInstituteofPublicHealth,Guangzhou511430,China;2DepartmentofPathophysiology,SchoolofMedicine,JinanUniversity,Guangzhou510632,China.E-mail:cct104@163.com)

ABSTRACT[]AIM: To study the expression of glycine receptor α1 subunit in neonatal rat myocardial cells and to investigate the effect of lipopolysaccharide (LPS), hypoxia/reoxygenation, isoproterenol (ISO) and high concentration of glucose (HG) on the expression of glycine receptor α1 subunit in the neonatal rat myocardial cells. METHODS: Neonatal rat myocardial cells were cultured in vitro. The expression of glycine receptor α1 subunit was detected by Western blotting. The neonatal rat myocardial cells were treated with LPS (20 mg/L), ISO (100 μmol/L) or high concentration of glucose (25 mmol/L) for 24 h, or were exposed to hypoxia for 3 h followed by reoxygenation for 3 h. Subsequently, the cell viability was measured by CCK-8 assay， and the expression of glycine receptor α1 subunit was determined by Western blotting. RESULTS: The expression of glycine receptor α1 subunit in the neonatal rat myocardial cells was positively detectable by Western blotting. Compared with control group, no significant difference of the cell viability (P>0.05) in LPS group, ISO group, hypoxia/reoxygenation group and HG group was observed. The expression of glycine receptor α1 subunit was increased (P<0.01) in LPS group, ISO group and hypoxia/reoxygenatio group, but decreased (P<0.01) in HG group. CONCLUSION: Glycine receptor α1 subunit exists in the neonatal rat myocardial cells. A certain concentration of LPS or ISO, or hypoxia/reoxygenation for a certain period upregulate the expression of glycine receptor α1 subunit, but HG downregulates the expression of glycine receptor α1 subunit in cultured neonatal rat myocardial cells.

[KEY WORDS]Glycine receptor α1subunit; Lipopolysaccharides; Hypoxia/reoxygenation; Isoproterenol; High concentration of glucose

我們先前的研究發(fā)現(xiàn)，甘氨酸(glycine，Gly)對(duì)缺血/再灌注損傷的心臟[1]、缺氧/復(fù)氧(hypoxia/reoxygenation，H/R)損傷的心肌細(xì)胞以及脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)損傷的心臟和心肌細(xì)胞都有保護(hù)作用[2]，通過大量研究，我們認(rèn)為Gly對(duì)心臟的保護(hù)作用是由心肌細(xì)胞上的甘氨酸受體(glycine receptor, GlyR)介導(dǎo)的。內(nèi)毒素血癥、缺血/再灌注、交感神經(jīng)系統(tǒng)的過度激活與高血糖是臨床上常見的心肌損傷因素。我們先前的研究表明，乳鼠心肌細(xì)胞甘氨酸受體α1亞基(GlyRα1)mRNA的表達(dá)水平受這些損傷因素的調(diào)節(jié)[3]，然而，與之相應(yīng)的，這些損傷因素可否影響心肌GlyRα1蛋白的表達(dá)水平尚缺乏研究。因此，本研究旨在觀察LPS、H/R、異丙腎上腺素(isoproterenol, ISO)以及高糖(high concentration of glucose，HG)對(duì)乳鼠心肌細(xì)胞GlyRα1蛋白表達(dá)的影響。

材料和方法

1主要儀器

CO2培養(yǎng)箱(Thermo)、酶標(biāo)儀(Tecan)、Western blotting蛋白印跡電泳儀和蛋白印跡電轉(zhuǎn)儀(Bio-Rad)

2藥品和試劑

DMEM培養(yǎng)基(Gibco);胎牛血清(中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院血液學(xué)研究所產(chǎn)品);胰蛋白酶(Hyclone)；CCK-8試劑(日本同仁化學(xué)研究所)；GlyRα1多克隆抗體(Abcam)；天然膜蛋白抽提試劑盒(BioVision)；ECL發(fā)光液(Pierce)；LPS(Sigma)；ISO(上海禾豐制藥有限公司)；葡萄糖(天津化學(xué)試劑一廠)。

3方法

3.1心肌細(xì)胞培養(yǎng)無菌條件下取出出生1～3 d SD大鼠乳鼠(中山大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心)心臟，取心室肌剪碎,0.125%胰蛋白酶消化成單細(xì)胞懸液,離心棄上清,用含15%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基懸浮分散細(xì)胞,100目篩網(wǎng)過濾,將細(xì)胞懸液接種于25 mL培養(yǎng)瓶中,在CO2孵箱中(95% O2,5% CO2,37℃)培養(yǎng)90 min后,棄去貼壁的成纖維細(xì)胞，加入含15%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基, 制成(1～5)×105cells/L細(xì)胞懸液接種于另一培養(yǎng)瓶或培養(yǎng)板中,每24 h換液1次,72 h后,選取搏動(dòng)良好的心肌細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

3.2乳鼠心肌與脊髓組織的提取乳鼠脫頸致死后, 快速取出心臟與腰骶段脊髓(L5～S1)于液氮中保存，用勻漿器將組織勻漿，抽提總蛋白。

3.3心肌細(xì)胞缺氧/復(fù)氧(H/R)模型的建立[4]參照文獻(xiàn)的方法。實(shí)驗(yàn)組心肌細(xì)胞用混合氣體(95%N2,5%CO2)預(yù)先飽和1 h的模擬缺血溶液(137 mmol/L NaCl，12 mmol/L KCl，0.9 mmol/L CaCl2·2H2O，0.49 mmol/L MgCl2，20 mmol/L乳酸鈉，0.4 mmol/L HEPES，pH 6.2)置換正常培養(yǎng)液，放入缺氧裝置中，充入混合氣體(95% N2,5% CO2)后密封，放入培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)3 h，即為缺氧模型。3 h后用正常培養(yǎng)液置換缺氧液，開放瓶口，放入常氧環(huán)境中培養(yǎng)3 h，即為復(fù)氧模型。

3.4實(shí)驗(yàn)分組心肌細(xì)胞培養(yǎng)72 h后隨機(jī)分為5組。對(duì)照組、LPS(20 mg/L)組、ISO(100 μmol/L)組和HG(25 mmol/L葡萄糖)組分別培養(yǎng)心肌細(xì)胞24 h，H/R組的心肌細(xì)胞進(jìn)行缺氧3 h后復(fù)氧3 h處理。

3.5細(xì)胞活性的測(cè)定以1×105cells/L細(xì)胞懸液接種至96孔培養(yǎng)板中,每組設(shè)6復(fù)孔，72 h后按上述分組進(jìn)行培養(yǎng)。H/R組按上述H/R模型的方法缺氧3 h后復(fù)氧3 h；LPS、ISO和HG組加入相應(yīng)濃度的LPS、ISO和葡萄糖培養(yǎng)24 h;每孔加入10 μL CCK-8試劑，微量振蕩器振蕩5 min, 置于CO2培養(yǎng)箱中(95% O2，5% CO2,37 ℃)培養(yǎng)30 min，用酶標(biāo)儀檢測(cè)每孔液體的吸光度(A)值。細(xì)胞存活率(%)=(A實(shí)驗(yàn)-A空白)/(A對(duì)照-A空白)×100%。

3.6Western blotting 檢測(cè)心肌細(xì)胞GlyRα1蛋白的表達(dá)分別抽提乳鼠心肌細(xì)胞、心肌組織與脊髓組織總蛋白，BCA法測(cè)量蛋白濃度，上樣，SDS-PAGE分離蛋白，轉(zhuǎn)膜，封閉，抗體孵育(GlyRα1和GAPDH抗體稀釋比例分別是1∶250 和1∶1 000)，采用化學(xué)發(fā)光法顯色，用專用軟件對(duì)蛋白條帶灰度值進(jìn)行分析。

4統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS 20.0軟件分析,所有數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示,組間均數(shù)比較采用單因素方差分析。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié)果

1LPS、H/R、ISO以及HG對(duì)心肌細(xì)胞活性的影響

如表1所示，LPS組、ISO組、HG組和H/R組心肌細(xì)胞存活率與對(duì)照組比較無顯著差別。

2乳鼠心肌細(xì)胞GlyRα1蛋白的表達(dá)

乳鼠心肌細(xì)胞、心肌組織和脊髓組織(陽性對(duì)照)均有GlyRα1蛋白表達(dá)，見圖1。

表1四種損害性因素對(duì)乳鼠心肌細(xì)胞毒性的測(cè)定

Table 1.Effects of four harmful factors on survival rate of neonatal rat myocardial cells (%. Mean±SD.n=6)

GroupCellsurvivalrateControl90.80±2.63LPS90.55±1.92H/R91.27±2.54ISO90.86±2.81HG90.46±2.80

Figure 1.Western blotting for GlyRα1protein expression.

圖1乳鼠心肌細(xì)胞、心肌組織與脊髓組織GlyRα1蛋白的表達(dá)

3LPS、H/R、ISO以及HG對(duì)乳鼠心肌細(xì)胞GlyRα1蛋白表達(dá)的影響

Western blotting結(jié)果分析顯示，與對(duì)照組相比，LPS、ISO和H/R均可增加GlyRα1蛋白的表達(dá)，而HG可降低GlyRα1蛋白的表達(dá)(P<0.01),見圖2。

Figure 2.Effects of LPS, H/R, ISO and HG on GlyRα1protein expression in cultured neonatal rat myocardial cells. Mean±SD.n=6.**P<0.01vscontrol.

圖2LPS、H/R、ISO和HG作用下乳鼠心肌細(xì)胞GlyRα1蛋白表達(dá)的變化

討論

本室先前的研究表明Gly對(duì)缺血/再灌注損傷的心臟、缺氧/復(fù)氧損傷的心肌細(xì)胞的保護(hù)作用通過心肌細(xì)胞上GlyR介導(dǎo)實(shí)現(xiàn)的，而對(duì)GlyR各亞基功能的研究表明，α亞基因其含有與激動(dòng)劑、拮抗劑結(jié)合的位點(diǎn)而成為GlyR功能的決定因子[5-7]，本人先前的研究表明，乳鼠心肌細(xì)胞GlyRα1mRNA的表達(dá)水平受LPS、H/R、ISO以及HG這些損傷因素的調(diào)節(jié)，本次實(shí)驗(yàn)是在先前的實(shí)驗(yàn)結(jié)論的基礎(chǔ)上進(jìn)一步探討GlyRα1蛋白在乳鼠心肌細(xì)胞的表達(dá)，以及以上損害因素對(duì)其蛋白水平表達(dá)的影響。

1乳鼠心肌細(xì)胞GlyRα1蛋白的表達(dá)

在生物體CNS上GlyRα1蛋白的表達(dá)早已得到多數(shù)學(xué)者的證實(shí)，而對(duì)于心肌細(xì)胞上是否有GlyRα1蛋白的表達(dá)尚未得到證實(shí)。本室先前對(duì)GlyR的研究發(fā)現(xiàn)，采用靈敏度較高的逆轉(zhuǎn)錄-巢式聚合酶鏈反應(yīng)技術(shù)在乳鼠心肌細(xì)胞上能夠檢測(cè)到GlyRα1mRNA的表達(dá)，但在應(yīng)用Western blotting方法進(jìn)一步驗(yàn)證此研究結(jié)果時(shí)卻未能發(fā)現(xiàn)有相同的免疫活性和分子量大小的蛋白存在，這使得本研究在實(shí)驗(yàn)方案和實(shí)驗(yàn)技術(shù)方面具有相當(dāng)大的挑戰(zhàn)性。本研究在檢測(cè)GlyRα1蛋白的表達(dá)時(shí)，采用提高心肌細(xì)胞膜蛋白的濃度、調(diào)整Ⅰ抗和Ⅱ抗的最佳反應(yīng)濃度等方法最終成功地首次檢測(cè)到心肌細(xì)胞GlyRα1蛋白的表達(dá)，不僅完善了本室前期的工作，而且也是本研究的重要部分是否能夠順利開展的關(guān)鍵之處。本研究表明乳鼠心肌細(xì)胞上不但有GlyRα1蛋白的表達(dá)，并且受損害性因素的調(diào)節(jié)。

2損害性因素對(duì)乳鼠心肌細(xì)胞GlyRα1蛋白表達(dá)的影響

本研究發(fā)現(xiàn)，乳鼠心肌細(xì)胞在20 mg/L LPS處理24 h后、100 μmol/L ISO處理24 h后與H/R(各3 h)處理下(細(xì)胞存活率不受影響)均可增加GlyRα1蛋白水平的表達(dá)，提示一定濃度的LPS、ISO以及一定時(shí)間的H/R可通過上調(diào)GlyRα1的表達(dá)來正性調(diào)節(jié)GlyR的功能；25 mmol/L葡萄糖處理乳鼠心肌細(xì)胞24 h后，細(xì)胞存活率不受影響，GlyRα1蛋白水平的表達(dá)低于對(duì)照組，該結(jié)果提示HG可下調(diào)GlyRα1的表達(dá)，從而負(fù)性調(diào)節(jié)GlyR的功能。以上研究結(jié)果與我們之前的研究結(jié)果一致，即一定濃度的LPS、ISO以及一定時(shí)間的H/R可通過上調(diào)GlyRα1mRNA的表達(dá)水平來正性調(diào)節(jié)GlyR的功能，而HG可下調(diào)GlyRα1mRNA的表達(dá)水平，從而負(fù)性調(diào)節(jié)GlyR的功能。

近年來對(duì)GlyR的深入研究發(fā)現(xiàn)，GlyR的功能隨著機(jī)體發(fā)育階段的變化而變化。在機(jī)體神經(jīng)系統(tǒng)的發(fā)育早期與成熟期，GlyR的激活對(duì)神經(jīng)元興奮性的調(diào)節(jié)有著截然不同的作用，并且與細(xì)胞內(nèi)Ca2+的濃度密切相關(guān)[8-9]。在機(jī)體的神經(jīng)元成熟期，細(xì)胞內(nèi)Cl-濃度低于平衡濃度，此時(shí)激活GlyR的Cl-通道引發(fā)Cl-內(nèi)流，表現(xiàn)為抑制效應(yīng)；而對(duì)于發(fā)育早期而言，細(xì)胞內(nèi)Cl-濃度高于平衡濃度，此時(shí)激活GlyR的Cl-通道引發(fā)Cl-外流，膜去極化，興奮神經(jīng)元，繼而興奮電壓依從性Ca2+通道，Ca2+內(nèi)流，細(xì)胞內(nèi)Ca2+的濃度增加可使細(xì)胞產(chǎn)生特異的功能[10-11]。Fucile等[12]在大鼠脊髓神經(jīng)元和轉(zhuǎn)染人細(xì)胞系發(fā)現(xiàn)了一個(gè)能夠快速增效GlyR功能的因素——細(xì)胞內(nèi)Ca2+，此快速增強(qiáng)作用的發(fā)展時(shí)程小于100 ms并與Ca2+內(nèi)流相一致，該研究提示細(xì)胞內(nèi)Ca2+能夠明顯增加GlyR與Gly的親和力來上調(diào)GlyR的功能。這些研究結(jié)論與本實(shí)驗(yàn)的LPS、H/R、ISO這3種因素對(duì)GlyRα1mRNA表達(dá)影響的結(jié)果相一致。本實(shí)驗(yàn)中的4種因素造成心肌細(xì)胞損傷的共同機(jī)制之一是引發(fā)細(xì)胞內(nèi)鈣超載，隨著損傷因素濃度的增高心肌細(xì)胞內(nèi)Ca2+的濃度也逐漸增加，心肌細(xì)胞內(nèi)Ca2+的濃度逐漸增加進(jìn)而激活GlyR表達(dá)的逐漸增多，從而上調(diào)GlyR的功能。但是HG對(duì)GlyRα1mRNA表達(dá)的影響卻與此相反，這可能與HG所致心肌損傷的諸多中間機(jī)制有關(guān)。研究證實(shí)，HG(20 mmol/L、30 mmol/L)明顯抑制乳鼠心肌細(xì)胞牛磺酸轉(zhuǎn)運(yùn)[13]，而牛磺酸與Gly結(jié)構(gòu)相似，同是GlyR的激動(dòng)劑，HG可能通過抑制了與?；撬峤Y(jié)構(gòu)相似的GLy轉(zhuǎn)運(yùn)來抑制GlyR的表達(dá)，下調(diào)了GlyR的功能。

本實(shí)驗(yàn)研究表明，一定濃度的LPS與ISO以及一定時(shí)間的H/R均能增加乳鼠心肌細(xì)胞GlyRα1蛋白水平的表達(dá)；而HG能夠使乳鼠心肌細(xì)胞GlyRα1蛋白水平的表達(dá)減少。提示這些損傷心肌的因素能夠調(diào)節(jié)GlyR的功能，其確切機(jī)制還需深入研究。

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(責(zé)任編輯： 林白霜， 羅森)