喉鱗狀細(xì)胞癌中TIMP3基因啟動(dòng)子區(qū)甲基化狀態(tài)的研究

張笑盈王新峰史維晨胡建功

(天津中醫(yī)藥大學(xué)第二附屬醫(yī)院病理科天津300150)

[摘要]①目的研究喉鱗狀細(xì)胞癌(LSCC)中基質(zhì)金屬蛋白酶抑制因子3(TIMP3)基因啟動(dòng)子CpG島甲基化及其蛋白表達(dá)情況。②方法采用改進(jìn)的甲基化特異性PCR(MSP)和免疫組化SP法檢測(cè)LSCC組織及相應(yīng)癌旁正常組織中TIMP3基因的DNA甲基化和蛋白表達(dá)情況。③結(jié)果LSCC組織中TIMP3基因啟動(dòng)子區(qū)CpG島甲基化發(fā)生率顯著高于癌旁正常組織(P<0.01)；有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的LSCC組織中甲基化率高于無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的LSCC組織(P<0.05)；低分化LSCC組織中甲基化發(fā)生率高于高、中分化LSCC組織(P均<0.05)；52例LSCC組織中TIMP3蛋白的表達(dá)率與相應(yīng)癌旁正常組織的TIMP3蛋白表達(dá)率比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)；有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的LSCC組織中蛋白表達(dá)率低于無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的LSCC組織(P<0.05)。④結(jié)論TIMP3基因啟動(dòng)子區(qū)CpG島的異常甲基化導(dǎo)致基因沉默可能是LSCC的發(fā)生機(jī)制之一，可作為反映LSCC生物學(xué)行為的檢測(cè)指標(biāo)。

[關(guān)鍵詞]喉鱗狀細(xì)胞癌基質(zhì)金屬蛋白酶抑制因子3DNA甲基化基因表達(dá)

[中圖分類號(hào)]R 76[文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼]A

【作者簡(jiǎn)介】張笑盈(1982-)，女，碩士，研究方向：腫瘤病理分子研究。

【通訊作者】胡建功。

Aberrant promoter methylation of TIMP3 gene in laryngeal squamous cell carcinomaZHANGXiaoying,WANGXinfeng,SHIWeichen,etal(PathologyDepartmentofTheSecondAffiliatedHospitalofTianjinUniversityofTraditionalChineseMedicine,Tianjin300150,China)

ABSTRACT[]ObjectiveIt is to observe the methylation status in promoter region of Tissue inhabitor of metalloproteinases 3(TIMP3) gene and the expression of TIMP3 protein in laryngeal squamous cell carcinoma (LSCC).Methods A modified methylation specific PCR (MSP) was used to examine the methylation status in the 5'CpG island of TIMP3 and immunohistochemical SP method was performed to detect TIMP3 protein expression in tumors and corresponding normal adjacent tissues．ResultsTIMP3 gene in tumor specimens,which was significantly higher than that in corresponding normal tissues (P<0.01);Methylation frequencies of LSCC in lymph node metastasis group were higher than that in no lymph node metastasis group (P<0.05);Methylation frequencies of poor differentiation group were higher than those in moderately and well differentiation groups(P<0.05);Positive immunostaining of TIMP3 in tumor tissues was significantly lower than that in matched normal tissues (P<0.01).TIMP3 protein expression of LSCC in lymph node metastasis group was remarkably lower than that in no lymph node metastasis group(P<0.05).ConclusionHypermethylation status in the 5'CpG island of TIMP3 gene-induced gene silencing may be one of the mechanisms underlying the development of LSCC.Hypermethylation of TIMP3 gene can be used as an index reflecting the biological behaviors of LSCC．

[KEYWORDS]Laryngeal squamous cell carcinoma.TIMP3.DNA methylation. Gene expression

惡性腫瘤的浸潤(rùn)和轉(zhuǎn)移是多步驟、多階段的復(fù)雜過程，涉及腫瘤細(xì)胞穿過細(xì)胞外基質(zhì)屏障、血管基底膜及穿出血管壁進(jìn)入宿主微環(huán)境的過程。其中基底膜和細(xì)胞外降解是其中的必要條件[1]。基質(zhì)金屬蛋白酶家族(MMPs)已被證明可降解基底膜和細(xì)胞外基質(zhì)，而且能夠促進(jìn)腫瘤新生血管的形成，與腫瘤的浸潤(rùn)和轉(zhuǎn)移密切相關(guān)[2]。TIMPs是一組能抑制MMPs活性的多功能因子家族。它通過對(duì)MMPs的抑制，在正常細(xì)胞外基質(zhì)改建和各種病理過程中發(fā)揮重要作用。TIMP3是全功能的MMP抑制劑，它只存在于ECM中，因此對(duì)MMP降解活性的抑制比其它TIMP更有針對(duì)性。目前,國(guó)內(nèi)外對(duì)喉鱗狀細(xì)胞癌組織中TIMP3基因啟動(dòng)子區(qū)CpG島甲基化狀態(tài)及蛋白表達(dá)的聯(lián)合研究較少，本研究檢測(cè)了喉鱗狀細(xì)胞癌中TIMP3基因啟動(dòng)子區(qū)的甲基化狀態(tài)及蛋白表達(dá)情況，探討其與喉鱗狀細(xì)胞癌發(fā)生發(fā)展的關(guān)系，以期為喉鱗狀細(xì)胞癌患者的早期篩查工作及惡性生物學(xué)行為的判斷提供新的理論參考依據(jù)。

1資料與方法

1.1一般資料收集52例喉鱗狀細(xì)胞癌手術(shù)切除的標(biāo)本。52例患者中男46例，女6例，年齡35~80歲，平均54.2歲。全部患者術(shù)前均未經(jīng)化療和放療。每例患者均取喉鱗狀細(xì)胞癌原發(fā)灶及相應(yīng)切緣黏膜組織，部分標(biāo)本于-80 ℃低溫冰箱保存以提取DNA，部分進(jìn)行石蠟包埋，常規(guī)HE染色(證實(shí)切緣黏膜均為正常黏膜組織，并確定標(biāo)本的組織學(xué)類型)。

1.2改進(jìn)甲基化特異性PCR(MSP)檢測(cè)采用常規(guī)蛋白酶K(Merck公司提供)消化，酚/氯仿抽提法提取癌組織和癌旁正常組織基因組DNA，紫外分光光度計(jì)測(cè)量DNA含量，所用標(biāo)本吸光度值均調(diào)整為1.8～2.0。每個(gè)樣本均取5μg DNA用2mol/L NaOH變性處理，于10mmol/L氫醌(Sigma公司提供)和3mol/L亞硫酸氫鈉中，在50℃條件下反應(yīng)16h，然后用Wizard DNA純化試劑盒(Promega 公司提供)純化，經(jīng)亞硫酸氫鈉處理的DNA。由于經(jīng)亞硫酸氫鹽處理后，DNA中的C轉(zhuǎn)變?yōu)閁，而DNA的CpG島部位發(fā)生甲基化后,則不能發(fā)生這種改變，據(jù)此原理設(shè)計(jì)相應(yīng)的甲基化引物檢測(cè)該基因是否發(fā)生甲基化。引物參照文獻(xiàn)并由海捷瑞公司合成(見表1)。同一樣品DNA 在亞硫酸氫鹽修飾前后分別用甲基化和非甲基化引物擴(kuò)增，如修飾前無任何目的條帶擴(kuò)增而修飾后有目的條帶擴(kuò)增，則亞硫酸氫鹽修飾完全。

PCR反應(yīng)條件為：95℃預(yù)變性10min，95℃ 45s，30s退火(各退火溫度見表1)，72℃ 1min，40個(gè)循環(huán)，最后72℃延伸10min。每個(gè)標(biāo)本均進(jìn)行甲基化和非甲基化兩種情況的檢測(cè)。52例標(biāo)本中隨機(jī)選取10%的標(biāo)本進(jìn)行重復(fù)試驗(yàn)。抽取無頭頸系統(tǒng)疾病及腫瘤的正常人外周血，EDTA抗凝，提取外周血中有核細(xì)胞的DNA經(jīng)(SssI)甲基化酶處理后作為甲基化分析的陽性對(duì)照，未經(jīng)處理的正常人外周血DNA作為非甲基化的陰性對(duì)照，去離子水替代DNA模板的反應(yīng)體系作為空白對(duì)照。

表1　喉鱗狀細(xì)胞癌中TIMP3基因甲基化引物

1.3免疫組織化學(xué)方法檢測(cè)TIMP3基因表達(dá)應(yīng)用免疫組織化學(xué)SP法試劑盒(北京中杉金橋公司產(chǎn)品)檢測(cè)TIMP3蛋白在LSCC和正常喉黏膜中的表達(dá)。石蠟標(biāo)本常規(guī)4μm連續(xù)切片，常規(guī)脫蠟，梯度乙醇溶液水化。含3%過氧化氫的甲醇溶液封閉內(nèi)源性過氧化物酶，雙蒸水沖洗后，用檸檬酸鹽緩沖工作液，高壓鍋噴氣2min進(jìn)行抗原修復(fù)。室溫冷卻，放以PBS緩沖液沖洗3次；加入10%羊血清后37℃反應(yīng)45min；封閉非特異性抗原后，傾去血清，不水洗。滴加一抗，濃度按1:100稀釋，4℃過夜。

PBS沖洗，5min×3次。滴加生物素標(biāo)記的二抗工作液，37℃溫箱內(nèi)孵育30min。PBS沖洗，5min×3次。滴加辣根酶標(biāo)記鏈酶卵白素工作液，37℃溫箱內(nèi)孵育30min。PBS沖洗，5min×3次。 DAB液顯色。蘇木素復(fù)染，常規(guī)梯度酒精脫水、二甲苯透明、中性樹膠封片，顯微鏡下觀察。實(shí)驗(yàn)設(shè)PBS代替一抗為空白對(duì)照，作為質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)。TIMP3的陽性染色定位于細(xì)胞漿，以胞漿內(nèi)出現(xiàn)均勻一致的棕黃色顆粒定義為陽性細(xì)胞。參照Fromowitz評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)，隨即選取5個(gè)高倍視野(×400)計(jì)數(shù)腫瘤細(xì)胞總數(shù)和陽性細(xì)胞數(shù)，得出陽性細(xì)胞百分率，當(dāng)LSCC組織中存在不同分化程度的區(qū)域時(shí)，選擇同一腫瘤組織切片中占優(yōu)勢(shì)分化程度的腫瘤區(qū)域進(jìn)行計(jì)數(shù)統(tǒng)計(jì)，陽性細(xì)胞率≤25%記為0分，26%～50%為1分，51%～75%為2分，>75%為3分；再按多數(shù)陽性細(xì)胞呈現(xiàn)的染色強(qiáng)度予以記分：無顯色為0分，淺棕黃色為1分，棕黃色為2分，棕褐色為3分。將上述兩項(xiàng)得分相加：0分判為“-”，1～2分判為“+”，3～4分判為“”，5～6分判為“”。

2結(jié)果

2.1LSCC組織中TIMP3基因甲基化狀態(tài)用甲基化特異性引物(M)擴(kuò)增，經(jīng)SssI處理后的外周血DNA，得到預(yù)期大小的甲基化擴(kuò)增片段，用非甲基化特異性引物(U)擴(kuò)增正常人外周血DNA，得到預(yù)期大小的非甲基化擴(kuò)增片段，而空白對(duì)照未得到反向產(chǎn)物，說明所用引物和試劑正確，實(shí)驗(yàn)結(jié)果可信。甲基化狀態(tài)有3種情況：①如只有甲基化特異性引物(M)擴(kuò)增出目的條帶而非甲基化特異性引物(U)未擴(kuò)增出目的條帶，此情況為完全甲基化；②如甲基化特異性引物(M)未擴(kuò)增出目的條帶而非甲基化特異性引物(U)擴(kuò)增出目的條帶，此情況為非甲基化；③如甲基化特異性引物而非甲基化特異性引物均擴(kuò)增出目的條帶，此情況為不完全甲基化，結(jié)果統(tǒng)計(jì)時(shí)為甲基化[3]。PCR(MSP)結(jié)果發(fā)現(xiàn)見圖1。52例LSCC組織中TIMP-3基因甲基化發(fā)生率為76.9%，而相應(yīng)正常黏膜僅12例發(fā)生甲基化，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=26.039，P=0.000)；在LSCC中，男性和女性患者甲基化率分別76.1%和66.7%，Ⅰ、Ⅱ期甲基化率為69.2%，III、IV期甲基化率76.9%；<60歲與≥60歲患者LSCC組織中TIMP3基因甲基化率分別為81.2%和75%，LSCC患者性別、TNM分期及年齡的甲基化率比較均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均>0.05)；LSCC患者高、中、低分化癌組織中TIMP3基因甲基化率分別為50%、70.6%和90.5%，有、無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移患者LSCC組織中甲基化率分別為59.1%和86.7%，不同分化程度及有無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的LSCC組織中甲基化率比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均<0.05)，見表2。

MA：100 bp Maker；CA：LSCC tissue；N：Normal tissue；C：Methylated and Unmethylated positive control

圖1LSCC及正常黏膜組織中TIMP3基因的甲基化狀態(tài)分析

2.2喉鱗狀細(xì)胞癌組織中TIMP3蛋白表達(dá)TIMP3蛋白免疫組織化學(xué)染色為細(xì)胞漿呈棕黃色顆粒狀，以出現(xiàn)均勻完整的胞漿著色定義為正常表達(dá)。胞漿表達(dá)減少或缺失定義為抑制表達(dá)見圖2、圖3。TIMP3在LSCC組織和癌旁非腫瘤組織中均有表達(dá)，TIMP3在LSCC組織中表達(dá)強(qiáng)度呈下降趨勢(shì)，LSCC組織中TIMP3基因的蛋白表達(dá)率為34.6%，癌旁非腫瘤組織中TIMP3基因的蛋白表達(dá)率為76.9%，二者比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)；<60歲與≥60歲患者LSCC組織中TIMP3基因的蛋白表達(dá)率分別為31.3%和40%；I、II期與III、IV期組織中TIMP3基因的蛋白表達(dá)率分別為48.7%和38.5%，高、中、低分化癌組織中TIMP3基因的蛋白表達(dá)率分別為42.9%，41.2%和23.8%，而患者不同年齡、性別、TNM分期、腫瘤分化程度的蛋白表達(dá)率比較均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；有無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移患者LSCC組織中蛋白表達(dá)率分別為23.3%和54.5%，二者比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

表2　喉鱗狀細(xì)胞癌患者 TIMP3基因啟動(dòng)子區(qū)甲基化情況

圖2　癌旁正常黏膜TIMP3蛋白呈陽性表達(dá)(×200)

圖3　癌組織TIMP3蛋白呈陰性表達(dá)(×200)

2.3TIMP3基因啟動(dòng)子甲基化與TIMP3蛋白表達(dá)缺失的關(guān)系LSCC組織中TIMP3基因甲基化陽性組中，蛋白表達(dá)陽性率為42.5%(17/40)，TIMP3基因甲基化陰性組蛋白表達(dá)陽性率為58.2%(7/12)，LSCC組織甲基化陽性與甲基化陰性者RKIP基因蛋白表達(dá)陽性率比較無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=0.510,P>0.05) 。

表3　喉鱗狀細(xì)胞癌患者TIMP3基因蛋白表達(dá)情況

3討論

TIMPs家族有4個(gè)成員，按照被發(fā)現(xiàn)的順序依次命名為TIMP-1、TIMP-2、TIMP-3和TIMP-4[4]。TIMP-3是家族中最特殊的一個(gè)成員,它主要定位結(jié)合于組織的細(xì)胞外基質(zhì)層中。TIMP-3是唯一的全功能MMPs抑制因子，能夠抑制膜結(jié)合的MMPs分子以及跨膜的MMPs分子，此外還抑制多種切割酶活性，例如抑制TNF-a轉(zhuǎn)換酶[TACE(tumor necrosis factor-a-converting enzyme)and ADAM-17(ADAM metallopeptidase domain 17)]參與調(diào)控TNF-a介導(dǎo)的炎癥[5,6]。TIMP-3還能夠抑制細(xì)胞表面多種分子及受體的脫落，如L-selectin、syndecansl4、IL-6受體，c-MET和胰島素樣生長(zhǎng)因子結(jié)合蛋白3、5等[5]。近年來,TIMP-3一直被認(rèn)為是一個(gè)腫瘤抑制因子，它在多種腫瘤組織中表達(dá)降低或缺失。

目前已確認(rèn)，啟動(dòng)子區(qū)CpG島高甲基化是造成與腫瘤發(fā)生相關(guān)的一些抑癌基因失活，使其轉(zhuǎn)錄沉默影響基因正常表達(dá)，從而導(dǎo)致腫瘤發(fā)生發(fā)展的重要分子生物學(xué)機(jī)制[7]；研宄發(fā)現(xiàn)，TIMP-3的啟動(dòng)子甲基化導(dǎo)致的表達(dá)缺失與多種腫瘤的不良預(yù)后相關(guān),例如腎癌、膠質(zhì)瘤、結(jié)腸癌、非小細(xì)胞肺癌及腦膜瘤等[8~10]。本研究發(fā)現(xiàn),TIMP3基因在LSCC組織中的甲基化率為76%，顯著高于癌旁腫瘤組織的甲基化率24%。因此認(rèn)為，TIMP3基因的甲基化參與了喉鱗狀細(xì)胞癌的發(fā)生，為了進(jìn)一步探討TIMP3基因啟動(dòng)子區(qū)甲基化在喉鱗狀細(xì)胞癌中的作用，筆者仍將TIMP3基因的甲基化率與LSCC患者各臨床資料如年齡、性別、有無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、TNM分期、病理學(xué)分級(jí)聯(lián)合分析，發(fā)現(xiàn)其甲基化率與患者的性別、年齡及TNM分期均無關(guān)系。分析原因可能是TIMP3基因甲基化或LSCC的早期發(fā)生事件，與LSCC的進(jìn)程無關(guān)。而同時(shí)研究發(fā)現(xiàn)，TIMP3基因的甲基化率與LSCC的病理分級(jí)和有無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)，說明TIMP3的高甲基化率增加了腫瘤的惡性程度，促進(jìn)了腫瘤的轉(zhuǎn)移，可能與LSCC的預(yù)后有關(guān)。因此，TIMP3基因甲基化可以作為L(zhǎng)SCC惡性程度評(píng)估和判斷預(yù)后的參考指標(biāo)。Sun W等人[11]在頭頸部腫瘤中的研究發(fā)現(xiàn)TIMP-3與頭頸部腫瘤的復(fù)發(fā)有很大關(guān)系，但他并沒有與患者的各臨床資料進(jìn)行聯(lián)合分析。

本實(shí)驗(yàn)運(yùn)用免疫組織化學(xué)染色法發(fā)現(xiàn)LSCC組織中TIMP3 蛋白表達(dá)率顯著低于癌旁非腫瘤組織，但在LSCC中甲基化與蛋白表達(dá)相關(guān)性研究發(fā)現(xiàn)，喉鱗狀細(xì)胞癌組織甲基化陽性TIMP-3基因蛋白表達(dá)與甲基化陰性TIMP3基因蛋白表達(dá)比較無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。Jiang-Liu Yu[12]等研究發(fā)TIMP-3基因在胃癌中的蛋白表達(dá)明顯下降，而在癌旁正常組織和對(duì)照組正常人中蛋白呈高表達(dá)，并且與胃癌的體積大小、組織學(xué)分型、淋巴結(jié)有無轉(zhuǎn)移、浸潤(rùn)深度、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移及臨床分期有關(guān)；本實(shí)驗(yàn)應(yīng)用免疫組織化學(xué)染色法發(fā)現(xiàn)，有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的癌組織TIMP3蛋白表達(dá)率顯著低于無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移(P<0.05) ，與文獻(xiàn)報(bào)道基本一致。

TIMP3從乳腺癌cDNA文庫中被克隆出來，主要表達(dá)于軟骨、胎盤滋養(yǎng)層、各種上皮及妊娠后期的肌肉中，能抑制MMP1、2、3和9的活性，是全功能的MMP抑制劑，對(duì)MMP2、MMP9、膠原酶1和基質(zhì)溶解素的抑制作用相似[13]。TIMP3在多種組織如心臟、腦、肺、腎臟、胎盤和子宮中都有表達(dá)[14]。并在許多腫瘤細(xì)胞中可見到TIMP3表達(dá)的下降和缺失[15~17]。牛桂蓮等[18]構(gòu)建了全長(zhǎng)TIMP3cDNA的真核表達(dá)載體, 用脂質(zhì)法轉(zhuǎn)入具有高轉(zhuǎn)移性的肺巨細(xì)胞系(BE1)中, 發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)染后的BE1細(xì)胞與母系細(xì)胞和空載體對(duì)照組細(xì)胞相比, 體外侵襲力降低, 在裸鼠體內(nèi)成瘤率降低, 而且轉(zhuǎn)移至肺和淋巴結(jié)的能力降低, 表明特異性上調(diào)TIMP3基因的表達(dá)可以在一定程度上逆轉(zhuǎn)細(xì)胞的惡性表型。筆者認(rèn)為，TIMP3抑制LSCC的侵襲和轉(zhuǎn)移, 除了抑制大多數(shù)MMP外, 還在于其參與ECM重塑的調(diào)節(jié), 維持ECM的完整性, 而且TIMP3有抗腫瘤血管生成的作用, 這些條件都阻礙了LSCC的侵襲和轉(zhuǎn)移。最近研究發(fā)現(xiàn)，TIMP3可以誘導(dǎo)許多細(xì)胞凋亡, 包括體外培養(yǎng)的腫瘤細(xì)胞, 而TIMP1、TIMP2及合成MMP抑制劑無此作用, 表明TIMP3既可通過抑制MMP的活性又可直接誘導(dǎo)LSCC細(xì)胞凋亡, 從而抑制其轉(zhuǎn)移。

但是，從TIMP3基因啟動(dòng)子甲基化與TIMP3蛋白表達(dá)缺失的關(guān)系研究來看，兩者并沒有相關(guān)性，分析可能與實(shí)驗(yàn)方法或樣本量有關(guān),有待于今后進(jìn)一步研究。

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(2015-07-25收稿)(岳靜玲編輯)