枯草芽胞桿菌PnbA酯酶選擇性拆分制備l-薄荷醇

陶惟一,徐嫻,李霜

(南京工業(yè)大學 生物與制藥工程學院, 江蘇南京211800)

摘要：利用重組大腸桿菌表達來源于枯草芽胞桿菌CICC 20034中的PnbA酯酶，不對稱催化水解dl-薄荷醇丙酸酯制備l-薄荷醇?？疾熘軇┓N類、助溶劑添加濃度、溫度、催化劑用量、底物濃度以及pH等對反應(yīng)的影響。結(jié)果表明：添加25%(體積分數(shù))助溶劑乙醇可顯著提升該酯酶對l-薄荷醇的立體選擇性，對映選擇率(E)由2.4提高到99.43，為不加乙醇條件下的40倍。酶催化最佳條件：25%乙醇作為助溶劑，反應(yīng)溫度37 ℃，緩沖液為0.1 mol/L Tris-HCl(pH 8.0)并保持pH 8.0反應(yīng)條件，底物量50 mmol/L，反應(yīng)體系中酶的添加量750 U/mL，在此條件下，酶促反應(yīng)30 min后，l-薄荷醇轉(zhuǎn)化率可達34%，產(chǎn)物光學純度對映體過量值(e.e.p)達95%。

關(guān)鍵詞：PnbA酯酶；對映選擇率；l-薄荷醇；助溶劑；選擇性拆分

doi:10.3969/j.issn.1672-3678.2015.06.008

收稿日期：2015-03-11

基金項目：國家重點基礎(chǔ)研究發(fā)展計劃(973計劃)(2011CB710800)；國家自然科學基金青年基金(21406111)

作者簡介：陶惟一(1990—)，女，江蘇南京人，碩士研究生，研究方向：生物化工；李霜(聯(lián)系人)，教授，lishuang@njtech.edu.cn

中圖分類號：TQ033

文獻標志碼：A

文章編號：1672-3678(2015)06-0043-06

Abstract：The PnbA esterase from Bacillus subtilis CICC 20034 was expressed in recombinant Escherichia coli and used to produce l-menthol through enantioselective hydrolysis of dl-menthyl propionate. The effects of co-solvents,temperature,pH,substrate titers and enzyme dosage on the enantioselective hydrolysis reaction were studied. Results showed that ethanol was the most suitable co-solvent; adding 25%(V/V) ethanol could significantly improve the optical purity of l-menthol,enantiomeric selectivity(E) enhanced from 2.4 to 99.43,about 40 times higher than that of the control.The optimized conditions for hydrolysis of dl-menthyl propionate to prepare l-menthol by PnbA were 25%(V/V) ethanol,0.1 mol/L Tris-HCl buffer (pH8.0), 50 mmol/L dl-menthyl piopionate,750 U/mL crude enzyme solution,37 ℃ and pH 8.0. Under these conditions,l-menthol could be obtained with the conversion rate obove 34% and the optical purity above 95% in 30 min reaction.

Keywords：PnbA esterase; enantiomeric selectivity; l-menthol; co-solvent; enantioselective hydrolysis

Enantioselective hydrolysis of dl-menthyl propionate in enzymatic preparation of l-menthol by PnbA esterase from Bacillus subtilis

TAO Weiyi,XU Xian,LI Shuang

(College of Biotechnology and Pharmaceutical Engineering,Nanjing Tech University,Nanjing 211800,China)

l-薄荷醇是天然薄荷醇的立體構(gòu)象，具有特有的薄荷香氣和清涼效果，已經(jīng)廣泛應(yīng)用于食品、醫(yī)藥和日用品等行業(yè)。目前，薄荷醇的生產(chǎn)主要是天然提取，但受環(huán)境、天氣等因素影響，天然薄荷醇質(zhì)量和產(chǎn)量都難以滿足日益增長的消費需求。因此，近年來采用脂肪酶或酯酶不對稱拆分制備l-薄荷醇成為研究熱點。用于拆分制備l-薄荷醇的酯酶或脂肪酶的微生物主要有枯草芽胞桿菌(Bacillussubtilis)、產(chǎn)堿假單胞菌(P￣s￣e￣u￣d￣o￣m￣o￣n￣a￣salcaligenes)、洋蔥布克氏菌(Burkholderiac￣e￣p￣a￣c￣i￣a)等。

在拆分反應(yīng)中，影響酶立體選擇性的因素有溫度、pH、助溶劑種類以及添加量等。其中，助溶劑對酶立體選擇性的影響較大。Watanabe等發(fā)現(xiàn)在酶促水解反應(yīng)中，可以通過添加二甲基亞砜(DMSO)改變2種構(gòu)型底物的反應(yīng)初速度來提高對映選擇率。Wu等利用來源Candidarugosa的脂肪酶催化酯化反應(yīng)時發(fā)現(xiàn)，添加的乙醇含量可以顯著影響對映選擇率以及反應(yīng)初速度。

但是，目前針對有機溶劑是如何影響酶立體選擇性的機制探究還沒有定論。本文中，筆者重點考察PnbA酯酶不對稱水解生產(chǎn)l-薄荷醇反應(yīng)中各因素的影響，期望能為進一步探究有機溶劑含量對酶立體選擇性的研究機制打下基礎(chǔ)。

1材料與方法

1.1　菌體培養(yǎng)

利用載體為pET22b重組表達枯草芽胞桿菌PnbA酯酶(帶His Tag標簽)，宿主為E.coliBL21(DE3)。重組菌以2%(體積分數(shù))接種量接入裝有50 mL 無菌LB培養(yǎng)基的250 mL 搖瓶中，加入終質(zhì)量濃度100 mg/L的氨芐青霉素，在37 ℃和200 r/min條件下培養(yǎng)2 h后，加入終濃度1 mmol/L的誘導劑IPTG，繼續(xù)培養(yǎng)4 h。

1.2　PnbA酯酶的制備

培養(yǎng)結(jié)束后于8 000 r/min下離心10 min，收集菌體，用0.1 mol/L Tris-HCl 緩沖液(pH 7.0)洗滌2次后重懸菌體，超聲波破碎菌體，離心(8 000 r/min、4 ℃、15 min) 除去細胞碎片，收集上清液(即粗酶液)。粗酶液使用鎳柱親和純化，得到PnbA酯酶純酶，用于電泳驗證。

1.3　蛋白質(zhì)含量及酶活力測定

采用考馬斯亮藍法測定蛋白質(zhì)含量。

以對硝基苯酚丁酸酯(p-nitrophenol butyrate，pNPB)為底物的分光光度法測定反應(yīng)過程中生成對硝基苯酚的微摩爾數(shù)來確定酯酶活力。酶活單位的定義：在40 ℃、pH 7.0條件下，每分鐘催化pNPB水解生成1 μmolpNP所需的酶量，U。

1.4　PnbA酯酶不對稱水解 dl-薄荷醇丙酸酯

反應(yīng)體系(2 mL)包括：底物dl-薄荷醇丙酸酯(浙江大學楊立榮教授實驗室成員合成)，0.1 mol/L Tris-HCl緩沖液(pH 7.0)，PnbA粗酶液，有機溶劑；于37 ℃下振蕩反應(yīng)一定時間，加入2 mL正己烷終止反應(yīng)，并旋渦振蕩5 min萃取產(chǎn)物以及殘留底物，再將獲得的有機相用無水MgSO4干燥后進行氣相色譜分析。文中所有試驗均重復3次取其平均值。

氣相分析在FULIGC979O型氣相色譜儀上進行分析，F(xiàn)ID檢測器,CP- cyclodextrin-β-2,3,6-M-19手性柱(0.25 mm×0.25 mm×50 mm,β-環(huán)糊精,安捷倫公司)。柱溫130 ℃，總壓0.14 MPa，空氣0.03 MPa，H20.1 MPa，N20.01 MPa，進樣溫度260 ℃，檢測溫度250 ℃，進樣量5 μL。

底物轉(zhuǎn)化率和產(chǎn)物的對映體過量值的計算見式(1)～(3)。

轉(zhuǎn)化率(C)= e.e.s/(e.e.s+e.e.p) ×100%

(1)

產(chǎn)物光學純度(e.e.p)=

[(Cl-Cd)/(Cl+Cd)×100%]

(2)

對映選擇率(E)=ln[1-C(1+e.e.p)]/

ln[1-C(1-e.e.p)]

(3)

式中：e.e.s為底物對映體過量值；e.e.p為產(chǎn)物對映體過量值；Cl為l-構(gòu)型對映體的峰面積；Cd為d-構(gòu)型對映體的峰面積。

1.5　助溶劑乙醇對pnbA酯酶的影響

考察助溶劑種類、助溶劑濃度對PnbA酯酶不對稱水解dl-薄荷醇丙酸酯的影響，并在反應(yīng)體系中加入不同濃度乙醇，考察PnbA酯酶對乙醇的耐受能力，測量加入乙醇后，在不同時間內(nèi)PnbA酯酶的活性。

1.6　熒光光譜分析

使用純化后的PnbA酯酶，用Perkin-Elmer LS55型熒光光譜儀測定不同乙醇濃度下酶的熒光光譜(λex=280)，測量時掃描范圍為260～400 nm。

1.7　反應(yīng)條件優(yōu)化

考察助溶劑種類、反應(yīng)溫度、助溶劑濃度、底物濃度、催化劑用量以及反應(yīng)體系 pH對 PnbA酯酶不對稱水解dl-薄荷醇丙酸酯的影響。

2結(jié)果與討論

2.1　枯草芽胞桿菌PnbA酯酶的制備

重組菌PnbA粗酶水解pNPB體積活力達110 000 U/L，比酶活為430 U/mg，經(jīng)鎳柱親和純化后，比酶活達1 668 U/mg，純化3.9倍，回收率32%。重組菌表達的PnbA酯酶及其純化品進行電泳鑒定的結(jié)果如圖1所示，其理論相對分子質(zhì)量約為5.6×104。由圖1可知，泳道1的PnbA的相對分子質(zhì)量與理論值相符,鎳柱親和純化PnbA酯酶達到電泳純。

M—標準蛋白；1—重組大腸桿菌誘導后的 全蛋白；2—純化后的PnbA酯酶 圖1　 重組PnbA酯酶的表達與純化 Fig.1　 Expression and purification of recombinant esterase PnbA

2.2　枯草芽胞桿菌PnbA酯酶的同源性分析

來自枯草芽胞桿菌CICC20034的PnbA酯酶(GenBank:KJ939251.1)與解淀粉芽胞桿菌Bacillusamyloliquifacienspara-nitrobenzyl中未表征的酯酶(GenBank:WP_021495235)一級結(jié)構(gòu)同源性為99%，與已表征的BacillussubtilisChain A, PnbA酯

酶(PDB:1QE3_A)的一級結(jié)構(gòu)同源性為63%。

已報道用于薄荷酯不對稱拆分的酯酶/脂肪酶如表1所示。與表1中的數(shù)據(jù)對比可以發(fā)現(xiàn)，筆者所用的PnbA酯酶與BacillussubtilisECU0554脂肪酶(GenBank:BSU_34390)同源性最高為64%，與PseudomonasalcaligenesX1脂肪酶同源性為35%，表明該PnbA酯酶具備用于薄荷拆分反應(yīng)的潛力。

2.3　助溶劑對PnbA酯酶水解 dl-薄荷醇丙酸酯選擇性的影響

水溶性有機溶劑往往會顯著影響酶的立體選擇性和催化活性。一方面，由于促進了水不溶底物在反應(yīng)體系中的分散，從而提高對映選擇性和產(chǎn)物的光學純度[11]；另一方面，有機溶劑直接影響酶的構(gòu)象，改變酶反應(yīng)活性通道，從而影響酶的催化性質(zhì)。此外，有機溶劑往往會奪去酶分子表面的水化層，引起酶分子構(gòu)象改變，進而影響酶的催化活性。添加10%(體積分數(shù))的DMSO、丙酮、乙醇和二甲基甲酰胺(DMF)等親水溶劑作為反應(yīng)體系的助溶劑，2 mL 反應(yīng)體系中含有2 mL助溶劑、25 mmol/Ldl-薄荷醇丙酸酯和500 U/mL PnbA粗酶液，37 ℃、pH 7.0條件下反應(yīng)2 h，結(jié)果如圖2所示。由圖2可知：乙醇和DMF可以顯著提升PnbA酯酶水解反應(yīng)的選擇性，產(chǎn)物e.e.p值由35.1增加至47，反應(yīng)的E值也相應(yīng)增加，且與e.e.p值的變化呈正相關(guān)。這可能是由于底物在不同的有機溶劑中分散系數(shù)不同，因此e.e.p值較高[12]。后續(xù)反應(yīng)選擇乙醇作為助溶劑。

表1　已表征的不對稱水解 l-薄荷酯的酯酶/脂肪酶

圖2　 有機溶劑對PnbA酯酶不對稱水解 dl-薄荷醇丙酸酯的影響 Fig.2　 Effects of organic solvents on the asymmetric hydrolysis of dl-menthyl propionate catalyzed by PnbA crude enzyme

2.4　助溶劑乙醇濃度對PnbA酯酶不對稱水解 dl-薄荷醇丙酸酯的影響

通常低濃度的助溶劑有助于提高酶活力，但當溶劑濃度增加時往往會對酶有毒害作用?？疾熘軇┮掖紳舛葘nbA酯酶不對稱水解dl-薄荷醇丙酸酯的影響，2 mL反應(yīng)體系中含有不同濃度乙醇、25 mmol/Ldl-薄荷醇丙酸酯和500 U/mL PnbA粗酶液，37 ℃、pH 7.0條件下反應(yīng)2 h，結(jié)果見圖3。

圖3　 助溶劑乙醇濃度對PnbA酯酶不對稱水解 dl-薄荷醇丙酸酯的影響 Fig.3　 Effects of concentration of alcohol on the asymmetric hydrolysis of dl-menthyl propionate catalyzed by PnbA crude enzyme

由圖3可以看出：隨助溶劑乙醇濃度的增加，水解反應(yīng)E值呈現(xiàn)先增高后降低的趨勢，在乙醇添加量為25%時達到最大值99.43，比不加助溶劑條件下高了近40倍；同樣的，反應(yīng)轉(zhuǎn)化率(C)也呈現(xiàn)出先增高再降低的趨勢，從32.9%到47.95%，但是當乙醇體積分數(shù)大于25%后，轉(zhuǎn)化率出現(xiàn)快速下降。值得注意的是，產(chǎn)物的光學純度隨著乙醇濃度的增加而增加，乙醇添加量為25%時，產(chǎn)物的光學純度大于95.4%，即使乙醇體積分數(shù)超過25%，產(chǎn)物的光學純度仍未降低。這表明助溶劑乙醇的最適添加量為25%(體積分數(shù))，該酯酶對l-薄荷醇酯的選擇性提高了近40倍，實現(xiàn)了從幾乎無對映選擇性到對映選擇性大于99.43，這一顯著的變化引起了筆者的注意。

Wehbi等[13]證明助溶劑可以通過改變酶活性部位的極性以及部分構(gòu)象從而激活磷脂酶。Watanabe等研究了DMSO可以引起脂肪酶構(gòu)象變化或提高其疏水性。對此，為了進一步探究乙醇是如何影響PnbA酯酶不對稱水解dl-薄荷醇酯的機制，就有必要探究乙醇添加量對PnbA酯酶耐受性的影響以及不同添加量條件下該酯酶的熒光光譜的變化。

2.5　乙醇添加量對PnbA酯酶耐受性的影響

考察添加不同乙醇濃度對PnbA酯酶活性的影響，結(jié)果如圖4所示。由圖4可以看出：將初始酶活力設(shè)定為100%， 隨著添加乙醇含量的增加，高于25%時，該酯酶活力迅速喪失，在添加量為15%～25%時，10 min內(nèi)酶活力下降至初始酶活的1/10，說明該酯酶對乙醇的耐受性很差，也可以進一步說明當添加乙醇體積分數(shù)高于25%時，不對稱水解反應(yīng)轉(zhuǎn)化率劇烈下降，與酶的失活密切相關(guān)。

圖4　乙醇添加量對PnbA酯酶耐受性的影響 Fig.4　 Effects of concentration of alcohol on the activity of PnbA crude enzyme

2.6　利用熒光光譜法探究乙醇對PnbA酯酶二級結(jié)構(gòu)的影響

熒光光譜法是研究蛋白質(zhì)分子構(gòu)象的方法之一，在蛋白質(zhì)分子中，能發(fā)射熒光的氨基酸有色氨酸(Trp)、酪氨酸(Tyr)以及苯丙氨酸(Phe)。蛋白質(zhì)的熒光通常在280 nm 或更長的波長被激發(fā)，其內(nèi)源熒光主要由Trp和Tyr產(chǎn)生。Tyr熒光光譜最大發(fā)射波長一般位于303 nm 處，而Trp的熒光光譜對微環(huán)境的變化很敏感，其峰位一般在325～352 nm 波長之間變動，當?shù)鞍踪|(zhì)逐步解折疊，內(nèi)源色氨酸相應(yīng)的逐步暴露于溶劑中，熒光譜不斷紅移，直至達到352 nm(自由色氨酸在水溶液中的最大發(fā)射波長)。Trp與Tyr殘基作為高度疏水的基團,常常位于蛋白質(zhì)分子內(nèi)部。而酶分子構(gòu)象改變時往往會引起某些疏水集團的暴露，因此,可以通過Trp殘基和Tyr殘基熒光光譜的動態(tài)變化分析蛋白質(zhì)分子所處的構(gòu)象狀態(tài)。

在PnbA酯酶氨基酸序列中，有9個色氨酸殘基(24、48、103、169、360、377、383、432、448)，12個酪氨酸殘基(29、85、110、119、137、154、308、326、329、343、379、451)。因此，可以用色氨酸與酪氨酸殘基發(fā)射光譜來檢測其二級結(jié)構(gòu)的變化。圖5為在280 nm激發(fā)光條件下，PnbA酯酶的熒光光譜圖。

圖5　PnbA酯酶的熒光光譜 Fig.5　Fluoresence spectra of PnbA

由圖5可知：在此條件下，PnbA酯酶的最大發(fā)射光強在335 nm左右處，表明此時主要為色氨酸殘基發(fā)出的熒光。在乙醇體積分數(shù)為0%～25%時，隨乙醇濃度的增加，PnbA酯酶熒光光強逐漸增大，在25%乙醇條件下，其最高熒光強度，且最大發(fā)射光波長出現(xiàn)紅移現(xiàn)象。這說明此時酶構(gòu)象發(fā)生了改變，其色氨酸殘基微環(huán)境發(fā)生改變，使其所屬的微環(huán)境親水性增加，極性增加，蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)趨于舒展[14]，這可能是蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的舒展，使其活性中心暴露，從而更加契合l-構(gòu)型的薄荷丙酸酯底物，因此，在增加乙醇體積分數(shù)到25%時，催化生產(chǎn)l-薄荷醇的手性選擇性以及轉(zhuǎn)化率都增加。然后隨著乙醇體積分數(shù)大于25%，熒光光強逐漸降低。從PnbA酯酶耐受乙醇情況來看，當乙醇體積分數(shù)大于25%時，酶迅速失活，因此可以推斷此時熒光強度的降低是由于酯酶已失活聚集成團。

2.7　PnbA酯酶不對稱水解 dl-薄荷醇丙酸酯

通過考察溫度、pH、酶的用量以及底物濃度等因素對PnbA酯酶不對稱水解dl-薄荷醇丙酸酯的影響，具體反應(yīng)條件分別為(a)0.2 mL乙醇、25 mmol/Ldl-薄荷醇丙酸酯、500 U/mL PnbA粗酶、2 mL反應(yīng)體積、pH 7.0；(b)25 mmol/Ldl-薄荷醇丙酸酯、2 mL反應(yīng)體積、37 ℃、pH 7.0，添加25%乙醇；(c)750 U/mL PnbA粗酶、2 mL反應(yīng)體積、37 ℃、pH 7.0，添加25%乙醇；(d)50 mmol/Ldl-薄荷醇酸酯、750 U/mL PnbA粗酶、2 mL反應(yīng)體積、37 ℃，添加25%乙醇。結(jié)果如圖6所示。由圖6可知：PnbA酯酶的最適反應(yīng)溫度為37 ℃，最適pH 8.0，酶用量750 U/mL，dl-薄荷醇丙酸酯濃度50 mmol/L，反應(yīng)進行30 min后，產(chǎn)物l-薄荷醇達到23.1 mmol/L，轉(zhuǎn)化率達34%，產(chǎn)物光學純度e.e.p>95%。

圖6　溫度、酶用量、底物濃度和pH對PnbA酯酶不對稱水解dl-薄荷醇丙酸酯的影響 Fig.6　 Effects of temperature,pH,substrate concentration and enzyme amount on the enantioselective hydrolysis of dl-menthyl propionate catalyzed by PnbA crude enzyme

3結(jié)論

利用枯草芽胞桿菌CICC 20034中的PnbA酯酶不對稱水解dl-薄荷醇丙酸酯。研究發(fā)現(xiàn)當不添加助溶劑乙醇時，該酯酶對dl-薄荷醇酯幾乎沒有立體選擇性；添加25%(體積分數(shù))的助溶劑乙醇，PnbA酯酶能高效、高立體選擇性地催化dl-薄荷醇丙酸酯為l-薄荷醇，不對稱水解反應(yīng)E值增加近40倍(E>99.43)，產(chǎn)物光學純度e.e.p>95%。

本研究為酶法高效拆分有應(yīng)用價值的手性醇以及有機溶劑乙醇影響酶立體選擇性提供了一定的實驗依據(jù)，初步探究了其二級構(gòu)象變化。今后還需進一步研究乙醇對該酯酶構(gòu)象的變化，結(jié)合分子模擬手段，更為深入研究其構(gòu)象變化的機制。

致謝

感謝浙江大學化學工程與生物工程系吳堅平副教授和陳輝博士對本研究的幫助。

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(責任編輯荀志金)