纖維素酶法提取川牛膝多糖

谷旭晗1，劉傲霞1，成悅1，夏玉婷1，韓偉1,2

(1.華東理工大學(xué)藥學(xué)院中藥現(xiàn)代化工程中心，上海200237； 2.上海市新藥設(shè)計(jì)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，上海200237)

摘要：以得率為評(píng)價(jià)指標(biāo)，采用纖維素酶提取川牛膝多糖。對(duì)藥材粒徑、酶的用量、酶解溫度、酶解時(shí)間、溶劑pH、液固比和提取時(shí)間等因素進(jìn)行了考察，結(jié)合正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)，得到最佳工藝條件：藥材粒徑550～830 μm、酶用量4 mg/g、酶解溫度50 ℃、酶解時(shí)間90 min、溶劑pH5.0、液固比60(mL/g)和提取時(shí)間30 min，發(fā)現(xiàn)在此條件下，川牛膝多糖得率為71.70%。

關(guān)鍵詞：川牛膝；多糖；纖維素酶；提取

doi:10.3969/j.issn.1672-3678.2015.06.014

收稿日期：2014-12-30

基金項(xiàng)目：國(guó)家大學(xué)生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓(xùn)練計(jì)劃(131025159)

作者簡(jiǎn)介：谷旭晗(1992—)，男，遼寧丹東人，學(xué)士，研究方向：中藥制藥工程；韓 偉(聯(lián)系人)，教授，E-mail:whan@ecust.edu.cn

中圖分類號(hào)：R284.2

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

文章編號(hào)：1672-3678(2015)06-0075-06

Abstract：Cellulase was applied to extract polysaccharide from Cyathula officinalis Kuan. Factors influencing particle size of the herb,the concentration of cellulase,enzyme treatment temperature and time, solvent pH value, liquid to solid ratio and extractive duration were studied. The optimal conditions were verified by the orthogonal experiment. The optimum extracting parameters were as follows:particle size 550 to 830 μm,enzyme concentration 4 mg/g, temperature 50 ℃,enzyme treatment time 90 min,pH=5.0,the liquid to solid ratio 60,extractive duration 30 min. Under these conditions,the yield of polysaccharide from Cyathula officinalis Kuan was 71.70%.

Keywords：Cyathula officinalis Kuan; polysaccharide; cellulase; extraction

Cellulase-assisted extraction of polysaccharide from Cyathula officinalis Kuan

GU Xuhan1,LIU Aoxia1,CHENG Yue1,XIA Yuting1,HAN Wei1,2

(1.Engineering Center for Traditional Chinese Medicine Modernization,School of Pharmacy,East China University of Science

and Technology,Shanghai 200237,China; 2. Shanghai Key Laboratory of New Drug Design,Shanghai 200237,China)

川牛膝(CyathulaRadix)為莧科植物川牛膝(CyathulaofficinalisKuan)的干燥根，為著名川產(chǎn)藥材，從明代李時(shí)珍的《本草綱目》到《現(xiàn)代中藥學(xué)大辭典》上都記載了其具有補(bǔ)肝腎、強(qiáng)筋骨、治療腰膝酸麻、肝腸眩暈、散癖血和消痛腫等功效，是臨床常用的中藥。川牛膝多糖是從川牛膝根中提取的一種生物活性多糖，相對(duì)分子質(zhì)量為1 000～2 200，是一高度分支的果聚糖?，F(xiàn)代藥理研究表明，川牛膝多糖具有促進(jìn)細(xì)胞免疫、抗腫瘤和減輕環(huán)磷酰胺Cy(cyclophosphomidun)所致外周白細(xì)胞減少等療效。

傳統(tǒng)提取工藝常常存在提取時(shí)間長(zhǎng)、提取率低等問題，酶處理技術(shù)的高選擇性轉(zhuǎn)化特點(diǎn)則大大彌補(bǔ)了傳統(tǒng)工藝的不足。選用適當(dāng)?shù)拿缸饔糜谒幱弥参锊牧?，可以使?xì)胞壁及細(xì)胞間質(zhì)中的纖維素、半纖維素和果膠質(zhì)等物質(zhì)降解，破壞細(xì)胞壁的致密構(gòu)造，減小細(xì)胞壁、細(xì)胞間質(zhì)等傳質(zhì)屏障對(duì)有效成分從胞內(nèi)向提取介質(zhì)擴(kuò)散的傳質(zhì)阻力，從而有利于有效成分的溶出。酶法提取技術(shù)具有條件溫和、提取時(shí)間短、提取率高和綠色節(jié)能等優(yōu)點(diǎn)。

本文中，筆者以川牛膝多糖的提取得率為考察指標(biāo)，采用纖維素酶法提取川牛膝多糖，以期得到其最佳的提取工藝條件，開辟川牛膝多糖提取的新方法。

1材料與方法

1.1　材料與儀器

1.1.1材料與試劑

川牛膝，上海華宇藥業(yè)有限公司，產(chǎn)地四川；纖維素酶，上海海洋生物技術(shù)有限公司；葡萄糖，上海天蓮精細(xì)化工有限公司；36%HCl、NaOH、苯酚、98%H2SO4等均為國(guó)產(chǎn)分析純，上海凌峰化學(xué)試劑有限公司；體積分?jǐn)?shù)95%乙醇，工業(yè)級(jí)；去離子水，上海華震科技有限公司。

1.1.2主要儀器設(shè)備

UV1900PC型紫外-可見分光光度計(jì)，上海亞研電子科技有限公司；DF-101S型集熱式恒溫加熱磁力攪拌器，鞏義市予華儀器有限責(zé)任公司；YH系列電熱器，江蘇近湖鎮(zhèn)教學(xué)儀器廠；SHZ-DⅢ型循環(huán)水式多用真空泵，上海予華儀器設(shè)備有限公司；pHS-2C型數(shù)字式pH計(jì)，上海雷磁儀器廠；JA31002型電子天平，上海天平儀器廠；AL204型分析天平，上海梅特勒-托利多儀器有限公司；烘箱，上虞市滬南電爐烘箱廠。

1.2　實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1藥材的預(yù)處理

將川牛膝粉碎過篩成干粉后預(yù)處理：用10倍量的體積分?jǐn)?shù)95%工業(yè)乙醇回流1 h，冷卻至室溫，回收乙醇，烘干藥渣，裝袋于蔭涼處儲(chǔ)存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液和苯酚試劑的配制

1)葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制精確稱取105 ℃干燥至恒質(zhì)量的葡萄糖50 mg，加去離子水溶解并定容至500 mL容量瓶，配制成0.10 mg/mL的葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液。

2)質(zhì)量分?jǐn)?shù)5%苯酚溶液的配制稱取精制苯酚2.50 g，加去離子水溶液并定容至50 mL棕色容量瓶，配制成質(zhì)量分?jǐn)?shù)5%苯酚溶液。

1.2.3最大吸收波長(zhǎng)的測(cè)定

1)稱取川牛膝藥粉3.00 g，加入150 mL去離子水于250 mL圓底燒瓶，在45 ℃下恒溫?cái)嚢?0 min后，迅速升溫回流提取30 min，冷卻至室溫，搖勻，減壓抽濾，取濾液2.5 mL定容至50 mL容量瓶，作為供試品溶液。

2)精密吸取一定體積的葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液和供試品溶液，分別置于25 mL具塞比色管中，補(bǔ)充去離子水至2.0 mL。加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)5%苯酚試劑1.0 mL，搖勻，迅速加入98%H2SO45.0 mL，搖勻，室溫靜置30 min，于400～600 nm范圍內(nèi)測(cè)定吸光度。結(jié)果表明，葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液和供試品溶液的最大吸收波長(zhǎng)均為489 nm。

1.2.4標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

精密吸取葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)液0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2和1.4 mL，分別置于25 mL具塞比色管中，補(bǔ)充去離子水至2.0 mL。加入5%苯酚溶液1.0 mL，搖勻，迅速加入98%H2SO45.0 mL，搖勻，室溫靜置30 min。用紫外分光光度計(jì)，分別在489 nm波長(zhǎng)處測(cè)定其吸光度。以吸光度A為縱坐標(biāo)，葡萄糖質(zhì)量濃度ρ為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，如圖1所示。

圖1　 葡萄糖濃度的標(biāo)準(zhǔn)曲線 Fig.1　 Standard curve of glucose

經(jīng)計(jì)算得回歸方程為A=12.040 48ρ-0.024 32，相關(guān)系數(shù)R=0.999 22。結(jié)果表明葡萄糖質(zhì)量濃度在0.01～0.08 mg/mL范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

1.2.5川牛膝多糖的提取過程及含量測(cè)定

稱取預(yù)處理后的藥渣3.00 g，并精確稱取一定量的纖維素酶一起加入圓底燒瓶中，再加入不同體積和pH的去離子水，調(diào)節(jié)溫度于恒溫加熱磁力攪拌器中酶解一定時(shí)間，迅速升溫回流提取，根據(jù)實(shí)驗(yàn)條件改變提取時(shí)間，冷卻至室溫，搖勻、減壓抽濾，取一定量濾液定容至容量瓶稀釋，作為供試品溶液。取稀釋后供試品溶液0.2 mL，補(bǔ)加去離子水至2 mL；加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)5%苯酚溶液1.0 mL，搖勻；迅速加入98%H2SO45.0 mL，搖勻，室溫靜置30 min。用紫外分光光度計(jì)在489 nm 波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算多糖得率。

(1)

式中：ρ為樣品中多糖的質(zhì)量濃度(mg/mL)；V為提取液體積(mL)；n為稀釋倍數(shù)；m為川牛膝藥材質(zhì)量(g)。

2結(jié)果與討論

2.1　酶法提取單因素的考察

2.1.1 藥材粒徑的影響

在酶用量3 mg/g、液固比50(mL/g)的條件下，選取6組不同粒徑的藥材，在45 ℃條件下酶解30 min，然后回流提取30 min，考察藥材粒徑對(duì)提取的影響，結(jié)果如圖2所示。由圖2可知：在對(duì)粒徑為550～830 μm的藥材提取時(shí)，多糖得率達(dá)到最大值；之后，隨著藥材粒徑的增大，多糖得率隨之下降。這是由于藥材粒徑越小，藥材與溶劑的接觸越充分，有利于溶劑的滲透，并且增加酶解的有效面積，提高提取效率；但藥材粒徑過小會(huì)使相互之間吸附作用過強(qiáng)，從而影響擴(kuò)散作用，故選取最佳藥材粒徑為550～830 μm。

圖2　 藥材粒徑對(duì)多糖得率的影響 Fig.2　 Effects of particle size on the yield of polysac- charide from Cyathula officinalis Kuan

2.1.2酶用量的影響

根據(jù)酶解反應(yīng)機(jī)制，酶量越多，溶劑中酶濃度越大，酶解反應(yīng)的速率就越快，酶解破壁效果就越好。在液固比50(mL/g)、酶解溫度45 ℃的條件下，酶解30 min，回流提取30 min，考察不同酶用量對(duì)提取結(jié)果的影響，結(jié)果如圖3所示。由圖3可以看出：多糖得率隨著酶用量的增加而上升，當(dāng)酶用量超過6 mg/g后，多糖得率隨之下降。這是因?yàn)樵诘兔笣舛认拢概c底物可較充分結(jié)合，酶濃度越高，酶解破壁效果越好；當(dāng)酶濃度過高時(shí)，底物濃度不能對(duì)酶達(dá)到飽和，從而抑制酶解過程，同時(shí)抑制多糖向溶劑擴(kuò)散的速率。故并非酶量越多，酶解效果越好，取最佳酶用量為6 mg/g。

圖3　 酶用量對(duì)多糖得率的影響 Fig.3　 Effect of enzyme concentration on the yield of polysaccharide from Cyathula officinalis Kuan

2.1.3酶解溫度的影響

溫度是酶解反應(yīng)的重要影響因素之一。根據(jù)纖維素酶酶制劑的說明書，一般在30～60 ℃的范圍內(nèi)選擇不同溫度條件進(jìn)行研究。在酶用量6 mg/g、液固比50(mL/g)、酶解溫度45 ℃的條件下，酶解30 min，回流提取30 min，考察酶解溫度對(duì)提取的影響，結(jié)果如圖4所示。由圖4可以看出：在較低溫度范圍內(nèi)，多糖得率隨溫度升高而增加，45 ℃時(shí)多糖得率達(dá)到最大值；但當(dāng)溫度繼續(xù)升高，多糖得率迅速下降。這是由于溫度的升高能使酶解反應(yīng)速率增加，但過高的溫度會(huì)使酶活性降低，導(dǎo)致酶解反應(yīng)速率降低，故選取45 ℃為最佳酶解溫度。

圖4　 酶解溫度對(duì)多糖得率的影響 Fig.4　 Effect of enzyme temperature on the yield of polysaccharide from Cyathula officinalis Kuan

2.1.4酶解時(shí)間的影響

一般情況下，酶解時(shí)間越長(zhǎng)，酶解反應(yīng)進(jìn)行越完全，酶解破壁效果就越好。在酶用量6 mg/g、液固比50(mL/g)、酶解溫度45 ℃的條件下，酶解不同的時(shí)間后回流提取30 min，考察酶解時(shí)間的影響，結(jié)果如圖5所示。由圖5可以看出：在30～75 min區(qū)間范圍內(nèi)，多糖得率隨酶解時(shí)間的增長(zhǎng)而緩慢增加，在75 min后下降。一般酶解時(shí)間越長(zhǎng)，酶解反應(yīng)越完全；但當(dāng)酶解反應(yīng)比較完全時(shí)，再增加酶解時(shí)間，可能對(duì)多糖產(chǎn)生分解和破壞作用，這里選取最佳酶解時(shí)間為75 min。

圖5　 酶解時(shí)間對(duì)多糖得率的影響 Fig.5　 Effect of enzyme time on the yield of polysaccharide from Cyathula officinalis Kuan

2.1.5 溶劑pH的影響

酶解反應(yīng)需在一定pH條件下進(jìn)行。當(dāng)酶處于最佳pH時(shí)，酶解反應(yīng)的速率將達(dá)到最高值。pH太高或者太低都會(huì)使蛋白質(zhì)變性，影響酶的活性。在酶用量6 mg/g、液固比50(mL/g)、酶解溫度45 ℃的條件下，以不同的介質(zhì)pH酶解75 min，然后回流提取30 min，考察溶劑pH的影響，結(jié)果如圖6所示。由圖6可以看出：在溶劑的pH處于4.0～6.0范圍內(nèi)，特別是pH為5.0時(shí)，多糖得率最高，此時(shí)纖維素酶活性最大；pH低于或高于5.0時(shí)，多糖得率均較低，所以溶劑pH選擇為5.0。

圖6　 溶劑pH對(duì)多糖得率的影響 Fig.6　 Effect of solvent pH on the yield of polysaccharide from Cyathula officinalis Kuan

2.1.6液固比的影響

液固比會(huì)影響到溶劑與藥材細(xì)胞之間的傳質(zhì)推動(dòng)力。在溶劑pH為5.0、酶用量6 mg/g、酶解溫度45 ℃條件下，選取不同液固比進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，先酶解75 min，然后回流提取30 min，考察液固比對(duì)提取的影響，結(jié)果如圖7所示。由圖7可以發(fā)現(xiàn)：液固比增大，多糖得率逐漸上升，在液固比為50(mL/g)時(shí)達(dá)到最大值，液固比繼續(xù)增大時(shí)得率反而下降。這是由于液固比的增加可以增大川牛膝與溶劑間的濃度差，加大傳質(zhì)推動(dòng)力，有利于川牛膝多糖的提取；但液固比過大時(shí)會(huì)降低底物川牛膝和酶的濃度，從而使酶解反應(yīng)速率降低，最后確定最佳液固比為50(mL/g)。

圖7　 液固比對(duì)多糖得率的影響 Fig.7　 Effect of liquid to solid ratio on the yield of polysaccharide from Cyathula officinalis Kuan

2.1.7提取時(shí)間的影響

在溶劑pH為5.0、酶用量6 mg/g、酶解溫度 45 ℃條件下，先酶解75 min，然后回流提取，考察不同時(shí)間對(duì)提取結(jié)果的影響，結(jié)果如圖8所示。由圖8可以看出：提取時(shí)間為30 min時(shí)，多糖得率較高；延長(zhǎng)提取時(shí)間，多糖得率下降。這是因?yàn)樘崛r(shí)間延長(zhǎng)會(huì)使得提取物增加，但長(zhǎng)時(shí)間的高溫提取會(huì)對(duì)有效成分造成破壞，因此提取時(shí)間確定為30 min。

圖8　 提取時(shí)間對(duì)多糖得率的影響 Fig.8　 Effect of extractive duration on the yield of polysaccharide from Cyathula officinalis Kuan

2.2　酶法提取正交試驗(yàn)

根據(jù)單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果，選取對(duì)川牛膝多糖得率影響較大的因素：酶用量(A)、酶解溫度(B)、酶解時(shí)間(C)和液固比(D)，設(shè)計(jì)L9(34)正交試驗(yàn)表，結(jié)果如表1～3所示。

表1　L 9(3 4)正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果

表2　正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)極差分析

由表2可以看出：各因素對(duì)酶法提取川牛膝多糖的影響順序從大到小依次為B、D、A、C，即酶解溫度對(duì)川牛膝多糖提取效果的影響最大，其次是液固比，再次是酶用量，酶解時(shí)間對(duì)其影響較弱。通過極差分析確定最佳的提取工藝應(yīng)為：A1B3C3D3，即酶用量為4 mg/g、酶解溫度為50 ℃、酶解時(shí)間為90 min和液固比為60(mL/g)。在此條件下川牛膝多糖得率為71.70%。

表3　正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)方差分析

表3對(duì)正交結(jié)果進(jìn)行了方差分析，酶解溫度F>F0.05，對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果有顯著的影響；液固比F0.05>F>F0.1，對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果有影響，但無(wú)顯著性差異；酶用量F

2.3　酶法提取與其他方法比較

劉友平等通過采用80%乙醇等處理樣品后，用水提取川牛膝多糖12 h，最終測(cè)定多糖得率為50.51%。趙磊等通過水提醇沉法研究川牛膝多糖的提取工藝，確定最佳工藝(提取時(shí)間2 h)所得的多糖得率為49.18%。梁歌等通過水提醇沉法確定提取川牛膝多糖在最佳工藝下的得率為49.42%，提取時(shí)間8 h。王書林等[10]通過超聲法提取川牛膝多糖，提取時(shí)間50 min，得率51.93%。通過比較可以看出，本文采用的酶法提取川牛膝多糖得率最高，提取時(shí)間較短。

3結(jié)論

1)本文采用纖維素酶提取川牛膝的多糖，考察了各單因素對(duì)多糖得率的影響，并結(jié)合正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)得到優(yōu)化的工藝條件：藥材粒徑550～830 μm、酶用量4 mg/g、酶解溫度50 ℃、酶解時(shí)間90 min、溶劑pH為5.0、液固比60(mL/g)和提取時(shí)間30 min。在該工藝下川牛膝多糖的得率為71.70%。

2)酶法提取與索氏提取法、水提醇沉法以及超聲提取法相比得率最高。酶法提取工藝條件溫和、得率高、綠色節(jié)能，實(shí)現(xiàn)低溫下中藥有效成分的提取，不破壞有效成分的生物活性，有利于保持原有藥效，是一種良好的現(xiàn)代提取方法。

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(責(zé)任編輯周曉薇)