周仁芳， 胡朝軍， 李永哲

(中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院 北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院 北京協(xié)和醫(yī)院風濕免疫科 風濕免疫病學(xué)教育部重點實驗室，北京 100730)

ChinJAllergyClinImmunol，2016，10(4)：385- 389

自身抗體作為自身免疫性疾病(autoimmune diseases，AID)的血清學(xué)標志，其中抗核抗體(antinuclear antibodies，ANA)是臨床應(yīng)用最廣泛、最基礎(chǔ)的一組自身抗體，已在臨床應(yīng)用60多年。ANA常見于系統(tǒng)性紅斑狼瘡(systemic lupus erythematosus，SLE)、干燥綜合征(Sjogren’s syndrome，SS)、系統(tǒng)性硬化病(systemic sclerosis，SSc)、混合結(jié)締組織病(mixed connective tissue disease，MCTD)及多發(fā)性肌炎(polymyositis，PM)/皮肌炎(dermatomyositis，DM)等系統(tǒng)性AID患者。同時ANA也可見于器官特異性AID患者(如自身免疫性肝病等),甚至可存在于慢性感染、腫瘤及健康人群中。檢測ANA對AID的診斷、鑒別診斷、分型及活動性監(jiān)測等具有重要的臨床意義[1]。近年來，盡管ANA在AID臨床應(yīng)用中取得重大進步，但仍存在標準化和正確應(yīng)用的新挑戰(zhàn)。

ANA的標準化

術(shù)語概念的標準化

由于細胞核是ANA靶抗原所在的最重要的結(jié)構(gòu)部位，所以傳統(tǒng)意義上的ANA指的是抗細胞核抗原成分的自身抗體的總稱。隨著ANA檢測技術(shù)的改進，尤其是培養(yǎng)細胞抗原基質(zhì)(如HEp- 2細胞)的廣泛應(yīng)用，對ANA的認識已不僅局限于細胞核成分的自身抗體。ANA靶抗原成分已由細胞核擴展到整個細胞成分，包括細胞核、細胞質(zhì)、細胞骨架及細胞分裂周期蛋白等[2]。因此，ANA術(shù)語概念已經(jīng)落后并且容易引起混淆，不能完全涵蓋相關(guān)自身抗體。對于ANA術(shù)語概念的標準化問題也引起諸多學(xué)者的關(guān)注。對此，經(jīng)過實驗室專家和臨床醫(yī)師討論形成的有關(guān)ANA檢測的國內(nèi)外專家建議指南中，均指出ANA是以細胞的各種成分為靶抗原的自身抗體總稱(anticellular antibodies)[3- 4]。但由于大部分學(xué)術(shù)著作、教科書、診治指南及疾病診斷標準等仍采用傳統(tǒng)的ANA術(shù)語概念，所以標準化的ANA新術(shù)語概念被醫(yī)務(wù)工作人員廣泛接受，仍需要一段時間的適應(yīng)過程。

同樣，目前對于以HEp- 2細胞為實驗基質(zhì)的間接免疫熒光法(indirect immune fluorescence，IIF)檢測ANA，其熒光模型命名和描述術(shù)語缺乏標準化，不同的行業(yè)學(xué)會和專家建議指南采用不同的分類命名原則和描述術(shù)語[3- 4]。因此，如何實現(xiàn)IIF-ANA熒光模型命名和描述的標準化顯得尤為重要，這也是實現(xiàn)IIF-ANA檢測結(jié)果在不同實驗室間互認的前提。在第12屆自身抗體和自身免疫國際研討會(International Workshop on Autoantibodies and Autoimmunity，IWAA)召開期間，就專門成立了ANA熒光模型國際共識(ICAP)，提出關(guān)于ANA熒光模型標準化命名的第一個國際共識[5]。

檢測方法的標準化

1958年，F(xiàn)rious建立間接免疫熒光法檢測ANA(IIF-ANA)，是ANA檢測的里程碑。40多年前以HEp- 2細胞為實驗基質(zhì)的IIF-ANA建立，使ANA對系統(tǒng)性AID(特別是SLE、SSc等)診斷發(fā)生了革命性的變化。近些年，隨著ANA檢測的臨床推廣應(yīng)用，經(jīng)典的IIF-ANA受到其他檢測方法學(xué)的挑戰(zhàn)。發(fā)展了基于純化抗原、重組抗原及人工合成肽，簡單、快速、易自動化的酶法、化學(xué)發(fā)光法及免疫微球等檢測方法[6]。但由于上述方法學(xué)存在針對不同的抗原靶位，具有不同的敏感性和特異性，從而導(dǎo)致ANA檢測標準化的缺乏和結(jié)果合理解釋問題[3]。對此，IIF仍然被美國風濕病學(xué)會、歐洲自身免疫標準化促進會及國內(nèi)的專業(yè)學(xué)會推薦為ANA檢測的參考方法或首選方法[3- 4,7]。

另外，由于IIF-ANA也存在方法學(xué)的局限性，如實驗操作的費時、費力及工作效率難以提高，結(jié)果判讀的主觀性影響及特殊培訓(xùn)等，也限制了IIF-ANA的臨床推廣應(yīng)用。對此，隨著生物工程技術(shù)的飛速發(fā)展，已可以提供IIF-ANA的自動化方案，它不僅包括實驗操作的自動化(前處理)，也包括實驗結(jié)果的自動判讀。目前，此類自動化儀器對ANA陰/陽性判讀具有較高的診斷效能，對典型的ANA熒光模型具有較好的識別能力，能減少ANA檢測結(jié)果在實驗室的室內(nèi)、室間差異，且能提高實驗室IIF-ANA 的工作效率[8]。同時，儀器制造商也正在積極開發(fā)新的軟件系統(tǒng)，以實現(xiàn)更好的自動識別熒光模型和光信號相關(guān)滴度的最終判斷。未來這些新技術(shù)可避免人為判斷ANA滴度進行的血清稀釋，從而對提高經(jīng)濟效益和工作效率具有重要的意義。因此，實現(xiàn)IIF-ANA檢測的自動化對其標準化進展起重要的推動作用[3]。

檢測程序的標準化

在ANA檢測方法中，根據(jù)多級診斷程序(multistage diagnostic process)，分成總抗體的篩查試驗和特異性自身抗體的確認試驗。由于不同方法存在靶抗原特點、敏感度及特異度差異，造成篩查試驗和確認試驗結(jié)果的不一致性。因此ANA篩查試驗與特異性自身抗體確認試驗的檢測程序問題一直是備受關(guān)注的話題。在筆者以往的研究中，發(fā)現(xiàn)對IIF-ANA總抗體的篩查試驗和15項ANA特異性自身抗體線性免疫印跡法(line immune assay，LIA)的確認試驗進行平行檢測分析時，兩者結(jié)果存在不一致。對此，提出在ANA臨床檢測中可先用篩查試驗(IIF-ANA)進行ANA篩查，若陽性需進一步進行ANA特異性自身抗體檢測，為疾病確認提供依據(jù)。另外，由于檢測方法敏感度及靶抗原特點，可存在IIF-ANA陰性而特異性自身抗體陽性的情況。

因此，當IIF-ANA陽性時，需對ANA特異性自身抗體進行進一步檢測；當臨床高度疑似，不論ANA檢測結(jié)果如何，都需要對特異性抗體進行檢測。例如，臨床疑似炎癥性肌病需檢測抗Jo- 1抗體，臨床疑似SLE需檢測抗核糖體P蛋白抗體，臨床疑似先天性心臟傳導(dǎo)阻滯/新生兒狼瘡/SS/亞急性皮膚型狼瘡需檢測抗SSA抗體[3]。

結(jié)果報告的標準化

ANA對AID的臨床應(yīng)用價值毋庸置疑，但如何規(guī)范檢測結(jié)果報告，仍是臨床實驗室面臨的一大問題。對此，第2屆ANA ICAP研討會達成共識[9]，IIF-ANA檢測結(jié)果報告應(yīng)包括：方法、結(jié)果(陽性/陰性、熒光模型、滴度)及建議(臨床相關(guān)性、進一步選擇的特異性抗體檢測)。還應(yīng)有適合各實驗室的參考區(qū)間和臨界值(cut-off值)[3- 4]。如對于ANA滴度的參考區(qū)間，以高于95%的當?shù)亟】祵φ杖巳核奖灰暈楫惓?。同樣，驗證ANA 臨界值(cut-off值)，推薦使用年齡和性別相匹配的當?shù)亟】等巳貉澹琧ut-off值應(yīng)設(shè)置為第95百分位；特異性自身抗體(如抗雙鏈DNA抗體、抗可溶性抗原抗體)cut-off值，推薦使用相關(guān)AID、疾病對照和健康對照人群的足夠量標本進行驗證，cut-off值需通過受試者工作特征曲線(receiver operator characteristic curve，ROC)分析加以設(shè)置[3]。

檢測試劑的標準化

目前，我國的自身抗體檢測試劑存在多樣化，檢測質(zhì)量良莠不齊的現(xiàn)狀。不同廠家的檢測試劑采用不同的抗原(如抗原特性、分布、含量等)，對ANA或其特異性自身抗體的結(jié)合能力不同，從而可導(dǎo)致檢測結(jié)果的不一致性。同時，不同廠家的檢測試劑對ANA檢測結(jié)果的cut-off值設(shè)定、參考區(qū)間及檢測范圍的不一致性，也可導(dǎo)致結(jié)果的可比性差。如IIF-ANA目前仍無文獻詳細說明以HEp- 2細胞為實驗基質(zhì)的不同廠家的檢測試劑的敏感性、特異性差異。另外，目前由于國內(nèi)醫(yī)療保險、收費價格等因素的限制，ANA特異性自身抗體仍采用定性檢測試劑為主。如廠家從市場利益出發(fā)隨意進行多個項目組合的LIA-ANA特異性自身抗體檢測，由于包被不同特性的靶抗原在同一反應(yīng)體系中檢測多種自身抗體，可導(dǎo)致檢測項目的臨床診斷效能下降。因此，如何實現(xiàn)ANA檢測試劑的標準化，是確保檢測結(jié)果準確、可靠的前提。對此，行業(yè)組織應(yīng)形成檢測試劑的標準化要求，專業(yè)學(xué)會應(yīng)定期組織實驗室進行不同廠家的檢測試劑比對分析。

ANA的臨床正確應(yīng)用

項目的合理應(yīng)用

自20世紀60年代，ANA主要應(yīng)用于風濕免疫科的就診患者，而近些年隨著ANA項目的臨床推廣應(yīng)用，已廣泛應(yīng)用于除風濕免疫科外的皮膚科、神經(jīng)科、消化科等其他臨床學(xué)科患者。在關(guān)于ANA陽性結(jié)果的臨床診斷效能評價中[10]，232例ANA陽性患者中，診斷為狼瘡患者為2.1%，診斷為ANA相關(guān)性風濕病(antinuclear antibody-associated rheumatic disease，AARD)患者為9.1%，說明ANA對AARD診斷為低陽性預(yù)測價值指標。另外，2012年美國國家健康和營養(yǎng)調(diào)查顯示，美國人群中ANA總體樣本陽性率為13.8%，其中女性陽性率為17.8%，男性陽性率為9.6%。因此，如何加強在臨床路徑管理背景下進行ANA 檢測項目的合理選擇，是專業(yè)學(xué)會今后需開展的引導(dǎo)性工作。針對自身抗體的臨床應(yīng)用，專家建議也指出[4]，對臨床懷疑AID的患者建議進行自身抗體檢測，對沒有特征性AID臨床表現(xiàn)的個體不建議進行自身抗體的篩查。

IIF-ANA熒光模型的臨床應(yīng)用

IIF-ANA熒光模型與其靶抗原在細胞內(nèi)的分布相關(guān)。雖然熒光模型與ANA特異性自身抗體存在一定的相關(guān)性，但并非嚴格意義上的完全一致，不能僅從熒光模型來推斷特異性自身抗體。如細胞核均質(zhì)型的ANA熒光模型可能對應(yīng)的是抗雙鏈DNA抗體，但抗雙鏈DNA抗體并不一定局限于細胞核均質(zhì)型的熒光模型，同樣細胞核均質(zhì)型的熒光模型也并非一定為抗雙鏈DNA抗體或見于SLE患者[11]。同時，ANA熒光模型也可作為鑒別ANA陽性的健康人群和AID患者的重要指標[12]，如細胞核均質(zhì)型、粗顆粒斑點型、著絲點型熒光模型僅見于AID患者，細胞核致密細斑點型熒光模型(dense fine speckled，DFS)僅見于健康人群，細顆粒斑點型熒光模型在AID患者和健康人群中均可見，但健康人群中的陽性率低于AID患者(P<0.001)。在SLE患者的不同ANA熒光模型中，細胞核均質(zhì)型與SLE患者的免疫學(xué)異常呈正相關(guān)，細胞核斑點型與SLE患者的關(guān)節(jié)炎、器官損傷呈負相關(guān)[13]。

另外，除常見的ANA熒光模型外，少見的ANA熒光模型也可與AID相關(guān)，如細胞核多點型、核膜型與自身免疫性肝病相關(guān)，細胞周期相關(guān)的熒光模型主要見于腫瘤患者[1]。DFS[14]、高爾基體型熒光模型[15]、細胞漿棒狀/環(huán)狀熒光模型(rods and rings，RR)[16]及瘧原蟲感染相關(guān)的特殊熒光模型[17]等ANA熒光模型，其相關(guān)特異性自身抗體和臨床意義的研究已引起諸多實驗室的關(guān)注。因此，熒光模型作為IIF-ANA檢測結(jié)果的重要參數(shù)，對進行下一步特異性自身抗體的檢測具有一定的指導(dǎo)意義，并與某些特異性自身抗體或AID的特殊臨床表現(xiàn)存在一定的相關(guān)性。

滴度的臨床應(yīng)用

ANA滴度為多少才具有明確的臨床意義？由于正常機體也會存在微弱的自身免疫應(yīng)答，產(chǎn)生生理性的自身抗體，因此，健康人群(包括孕婦、老年人等)也會檢測到低滴度的ANA。另外，感染性疾病、腫瘤等也會由于機體的自身免疫反應(yīng)產(chǎn)生ANA。所以ANA陽性并非一定為AID[4,10]。同時，由于IIF檢測ANA與試劑、設(shè)備和其他因素有關(guān)，ANA滴度的參考區(qū)間可因地而異。目前，雖然對于ANA滴度達到多少才具有明確的臨床意義，仍無明確的結(jié)論，但文獻中明確了ANA滴度越高與AID的相關(guān)性越大[3- 4]。

ANA滴度能否作為AID病情監(jiān)測指標？由于ANA滴度與病情嚴重性沒有必然聯(lián)系，因此，不推薦使用ANA滴度的變化來反映AID的活動性和療效反應(yīng)性[3- 4]。但對于某些ANA特異性自身抗體，如抗雙鏈DNA抗體滴度可作為SLE疾病活動性的監(jiān)測指標之一，應(yīng)定期進行監(jiān)測。如對于SLE疾病活動期的患者，每隔6～12周進行抗雙鏈DNA 抗體檢測為宜，而對于病情較為穩(wěn)定的患者，每隔6～12 個月進行檢測即可[18]。

不同廠商試劑采用不同的滴度系統(tǒng)，其結(jié)果能否直接比較？由于以HEp- 2細胞為實驗基質(zhì)的IIF-ANA，不同廠商的檢測試劑的敏感度和特異度存在差異，因此其稀釋滴度系統(tǒng)也存在不同。目前國際上諸多實驗室常采用1∶40、 1∶80、1∶160、1∶320等的倍比稀釋滴度系統(tǒng)，但國內(nèi)常采用1∶100、1∶320、1∶1 000、1∶3 200等的10的立方根為因子的稀釋滴度系統(tǒng)。雖然上述稀釋系統(tǒng)均有1∶320 存在，但兩者的臨床意義差別較大，不能直接比較，需溯源到國際單位(kU/L)后才能進行比較。

特異性自身抗體的臨床應(yīng)用

ANA的靶抗原包括細胞核、細胞質(zhì)、細胞骨架及細胞分裂周期蛋白等150多種細胞成分，其相應(yīng)的特異性自身抗體對AID的診斷與鑒別診斷、病情監(jiān)測與療效觀察、病程轉(zhuǎn)歸與預(yù)后判斷及疾病預(yù)警等方面具有重要的意義[2,10]。目前，僅有少數(shù)ANA特異性自身抗體被確定疾病相關(guān)性，且隨著ANA臨床應(yīng)用的廣泛開展，對其特異性自身抗體賦予新的解釋。一方面，如抗增殖細胞核抗原抗體一直被認為是SLE的特異性自身抗體，而后發(fā)現(xiàn)抗增殖細胞核抗原抗體并非SLE所特有，可見于多種疾病患者如淋巴瘤、慢性乙型肝炎及慢性丙型肝炎等[19]。另一方面，新的特異性自身抗體不斷被了解，如抗DFS70抗體作為DFS熒光模型的特異性自身抗體，該抗體最初發(fā)現(xiàn)于間質(zhì)性膀胱炎，而后該抗體還見于特應(yīng)性皮炎、慢性炎癥性疾病、腫瘤、AID等多種疾病及健康人群中。目前，抗DFS70抗體可作為系統(tǒng)性AID排除診斷的實驗室指標[20]?？傊?，對于各種ANA特異性自身抗體的確切臨床意義，仍需大量流行病學(xué)資料和臨床實踐，才能真正明確其臨床應(yīng)用價值。

無臨床癥狀者的ANA陽性情況

在ANA臨床應(yīng)用中，無臨床癥狀者中的ANA陽性情況十分常見。在一項國際調(diào)查中，健康人群中存在31.7%的低滴度(1∶40)ANA陽性，5%滴度為1∶160的ANA陽性。而在另一報道中[12]，健康人群ANA的陽性率為12.9%；且40例ANA陽性的健康者經(jīng)隨訪無一例進展為AID，其中29例(72.5%)經(jīng)隨訪后ANA仍呈陽性。由于ANA的產(chǎn)生存在遺傳學(xué)背景的差異，發(fā)現(xiàn)HLA-DRB1*0405基因(位點為rs23195)是日本人群產(chǎn)生ANA的易感基因，且ANA陽性的健康人群與SLE患者的基因重疊有限[21]。因此，對于無臨床癥狀者的ANA陽性情況，大部分為機體正常的免疫反應(yīng)。但是，也不可忽略ANA陽性可存在于某些AID患者的臨床前期，如ANA及其特異性自身抗體(抗SSA抗體、抗SSB抗體等)可存在于SLE、SS患者出現(xiàn)臨床癥狀前數(shù)年[22- 23]。對此，檢測ANA可使AID的早期預(yù)警成為可能，據(jù)此學(xué)術(shù)界也提出“預(yù)測性抗體”的新概念，也是ANA及其他自身抗體檢測的前景所在。

總　　結(jié)

隨著ANA的臨床推廣應(yīng)用，加強ANA的標準化，實現(xiàn)ANA檢測的臨床正確應(yīng)用，使ANA被臨床正確理解和合理解釋，是今后臨床實驗室人員和臨床醫(yī)師共同努力的方向。

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