通信作者：劉琳(1983-)，女，主要從事內(nèi)分泌疾病的基礎(chǔ)及臨床治療。E-mail：115398427@qq.com

正交試驗(yàn)優(yōu)選玉女煎多糖提取工藝研究

李生茂劉琳*陳珍王彪萬章平陳小云

四川省川北醫(yī)學(xué)院，四川南充637000

【摘要】目的：探索玉女煎多糖提取的最佳方法。方法：采用苯酚-硫酸顯色測(cè)定玉女煎多糖的含量，采用L9(3`4)正交試驗(yàn)考察提取溶劑用量、提取時(shí)間和提取次數(shù)對(duì)玉女煎多糖提取的影響，并確定多糖最佳提取工藝。結(jié)果：玉女煎最佳提取工藝為12倍量的蒸餾水回流提取3次，每次30min。結(jié)論：該工藝穩(wěn)定可行，可用于玉女煎多糖的提取。

【關(guān)鍵詞】玉女煎；多糖；正交試驗(yàn)；苯酚-硫酸法

基金項(xiàng)目：川北醫(yī)學(xué)院科研發(fā)展計(jì)劃項(xiàng)目青年項(xiàng)目(CBY11-A-QN11，CBY12-A-QN14)。

作者簡介：李生茂(1981-)，男，主要從事中藥的藥效物質(zhì)基礎(chǔ)及質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)規(guī)范化研究。E-mail：lsm9110@163.com

【中圖分類號(hào)】R284.2

【文獻(xiàn)標(biāo)志碼】A

【文章編號(hào)】1007-8517(2015)22-0017-02

Abstract:Objective To optimize the condition of extraction of polysaccharide from Yunv decoction. Method The content of polysaccharide from Yunv decoction was determined by phenol-sulfuric acid method, and L`9(3`4) orthogonal design was used to optimize the extraction technology of polysaccharide by taking solid-liquid ratio, extraction time and times as factors. Result The optimum conditions of extraction of polysaccharide from Yunv decoction was as follow: 12 fold water, 3 times, 30min per. Conclusion The process is stable and feasible，which can be used to extract the polysaccharide from Yunv decoction.

Keywords:uniform design; Yunv Decoction;Poly sacchar ide; optimum prescription

收稿日期：(2015.08.10)

Study on Extraction of Polysaccharide from Yunv Decoction

LI ShengmaoLIU Lin*CHEN ZhenWANG BiaoWAN ZhangpinCHEN Xiaoyun

North Sichuan Medical College, Nanchong 637000，China

玉女煎首載于《景岳全書》[1]：“生石膏三、五錢，熟地三、五錢或一兩，麥冬二錢，知母、牛膝各錢半，水一鍾半，煎七分，溫服或冷服”，用于“治水虧火盛，六脈浮洪滑大，少陰不足，陽明有余，煩熱干渴，頭痛，牙疼，失血等癥”。玉女煎為滋陰潤燥的代表方之一，臨床常以其為基本方加減治療糖尿病及并發(fā)癥[2-7]，并取得良好效果。藥理研究[8-10]證實(shí)，玉女煎及其加減對(duì)多種糖尿病動(dòng)物模型有降血糖的作用、方中熟地[11-12]、麥冬[13-16]、知母[17-18]和牛膝[19-23]藥材均含多糖類成分，且具有降血糖作用。實(shí)驗(yàn)采用正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)優(yōu)選了玉女煎多糖提取工藝，并采用硫酸-苯酚比色法測(cè)定其含量，以期為玉女煎多糖降血糖作用進(jìn)一步研究提供依據(jù)。

1儀器與材料

1.1儀器島津1750紫外分光光度計(jì)(日本島津公司)；HH-2K4型恒溫水浴鍋(鞏義市予華儀器有限責(zé)任公司)；UP HW-IV-90T純水機(jī)(四川優(yōu)普超純科技有限公司)；Ohaus Discovery十萬分之一電子分析天平(奧豪斯儀器(上海)有限公司)。

1.2材料熟地黃、石膏、麥冬、知母、牛膝均購于南充市便民大藥房，經(jīng)川北醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院李毅主任藥師鑒定，均符合2010年版中國藥典標(biāo)準(zhǔn)；水為蒸餾水，其余試劑均為分析純。

2方法與結(jié)果

2.1溶液的制備

2.1.1標(biāo)準(zhǔn)溶液的制備取干燥至恒重的葡萄糖對(duì)照品適量，精密稱定，加蒸餾水配制成濃度為0.2mg/ml的葡萄糖對(duì)照品儲(chǔ)備溶液，4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

2.1.2供試品溶液的制備取玉女煎(按石膏∶地黃∶麥冬∶知母∶牛膝比例為15∶30∶6∶5∶5組方)約1g，精密稱定，置于圓底燒瓶中，精密加入12ml蒸餾水，稱定重量，回流提取3次，每次30min，放冷，再稱定重量，用蒸餾水補(bǔ)足減失的重量，搖勻，濾過，合并三次濾液，即得。

2.2標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制分別精密吸取葡萄糖對(duì)照品儲(chǔ)備溶液0.5、1、1.5、2、2.5ml置10 ml容量瓶中，用蒸餾水稀釋至刻度，搖勻。精密量取上述各溶液2ml，加入1ml 6%的苯酚溶液，再加入5ml硫酸，90℃顯色40min，取出，流水快速冷卻至室溫。以蒸餾水2ml按上述條件處理的溶液作為空白，在490nm處測(cè)定吸光度，以吸光度(A)為縱坐標(biāo)，濃度(C)為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算得回歸方程：A=11.671C+0.0665(R=0.9993)。結(jié)果表明，葡萄糖濃度在10~50μg/ml范圍內(nèi)的線性關(guān)系良好。

2.3方法學(xué)考察

2.3.1精密度試驗(yàn)取玉女煎約1g，精密稱定，按“2.1”制備供試品溶液，按“2.2”項(xiàng)下方法測(cè)定吸光度值，重復(fù)測(cè)定6次，吸光度值RSD為0.82%，表明儀器精密度良好。

2.3.2重復(fù)性試驗(yàn)取玉女煎6份，每份約1g，精密稱定，按“2.1”制備供試品溶液，按“2.2”項(xiàng)下方法測(cè)定吸光度值，吸光度值RSD為4.15%，表明方法的重復(fù)性良好。

2.3.3穩(wěn)定性試驗(yàn)取同一供試品溶液按“2.1”項(xiàng)下方法顯色后，分別在0、15、30、45、60 min 5個(gè)時(shí)間點(diǎn)測(cè)定吸光度，吸光度值的RSD為2.64%，表明樣品在1h內(nèi)穩(wěn)定。

2.3.4加樣回收率試驗(yàn)取玉女煎5份，每份約0.5g，精密稱定，每份加入20mg葡萄糖，按“2.1”制備供試品溶液，按“2.1”項(xiàng)下方法測(cè)定吸光度值，計(jì)算回收率。結(jié)果表明葡萄糖的平均回收率為97.62%，RSD為3.98%。

2.4正交試驗(yàn)以多糖為指標(biāo)，選用L9(34)正交表對(duì)提取次數(shù)(A)、提取時(shí)間(B)和提取溶劑用量(C)3個(gè)主要因素進(jìn)行考察，每個(gè)因素?cái)M設(shè)3個(gè)水平，見表1。按正交實(shí)驗(yàn)表1條件對(duì)玉女煎中多糖類成分進(jìn)行提取，按“2.2”項(xiàng)下方法測(cè)定吸光度值，并計(jì)算其含量。由表2、3可知，影響玉女煎中多糖提取效果的因素大小順序?yàn)锳>C>B，即提取次數(shù)>溶劑用量>提取時(shí)間，提取次數(shù)對(duì)試驗(yàn)結(jié)果有極顯著性影響(P<0.01)，溶劑用量對(duì)試驗(yàn)結(jié)果有顯著性影響(P<0.05)。結(jié)合直觀分析，最佳提取方法為A3B1C3：即以12倍量的蒸餾水回流提取3次，每次30min。

表1　因素水平表

表2　正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果

表3　方差分析表

2.5驗(yàn)證試驗(yàn)取玉女煎3份，每份約1g，精密稱定，置于圓底燒瓶中，用確定的最佳提取條件進(jìn)行提取，按“2.2”項(xiàng)下方法顯色測(cè)定吸光度值，并計(jì)算多糖的含量，多糖的含量分別為101.228、98.572和104.403mg/g(平均含量為101.068mg/g)，RSD為3.38%，表明該工藝穩(wěn)定可行。

3討論

苯酚-硫酸法是測(cè)定多糖含量的常用方法之一[24]，其原理為多糖在濃硫酸作用下水解成單糖分子，并迅速脫水生成糠醛衍生物而與苯酚縮合生成有色化合物，該有色物具有紫外吸收且生成量與多糖濃度存在定量關(guān)系，故可用分光光度法在適當(dāng)波長處測(cè)定吸光度，進(jìn)而計(jì)算得到多糖含量。影響苯酚-硫酸法顯色的因素較多[25]，前期采用單因素考察的方法對(duì)苯酚-硫酸法中顯色的影響因素：6%苯酚用量(0.5、1、1.5ml)、硫酸用量(4、5、6ml)、顯色溫度(50、70、90、100℃)、顯色時(shí)間(30、40、50min)進(jìn)行了考察，結(jié)果表明6%苯酚1ml、硫酸5ml、溫度90℃、水解時(shí)間40min顯色最佳。

研究通過正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)對(duì)玉女煎多糖提取工藝進(jìn)行了優(yōu)化，根據(jù)直觀分析和方差分析可知，提取次數(shù)和提取溶劑用量對(duì)玉女煎多糖提取效果的影響最大，提取時(shí)間對(duì)多糖提取效果影響較小，從而確定玉女煎多糖最佳的提取工藝條件是12倍量的蒸餾水回流提取3次，每次30min。該工藝穩(wěn)定可行，可用于玉女煎多糖的提取。

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