李晶晶 李 云① 劉 紅 戴習(xí)林 蔣 飛 丁福江

(1. 上海海洋大學(xué)水產(chǎn)與生命學(xué)院 上海 201306; 2. 上海申漕特種水產(chǎn)開發(fā)公司 上海 201516)

凡納濱對(duì)蝦(Litopenaeus vannamei)又名南美白對(duì)蝦, 因其具有出肉率高、抗逆性強(qiáng)、生長(zhǎng)快、繁殖期長(zhǎng)、耐高密度及低鹽度養(yǎng)殖、便于活蝦運(yùn)輸?shù)葍?yōu)點(diǎn)(王興強(qiáng)等, 2004), 已成為我國(guó)重要的經(jīng)濟(jì)養(yǎng)殖蝦類,與羅氏沼蝦和斑節(jié)對(duì)蝦并稱為世界三大養(yǎng)殖蝦類。自我國(guó)凡納濱對(duì)蝦人工育苗技術(shù)成功突破以來(lái), 已在全國(guó)范圍內(nèi)進(jìn)行了大規(guī)模的人工養(yǎng)殖。但是近年來(lái)隨著養(yǎng)殖規(guī)模的不斷擴(kuò)大, 養(yǎng)殖強(qiáng)度的增加以及養(yǎng)殖環(huán)境的惡化, 特別是各類病毒及細(xì)菌性疾病的頻繁暴發(fā), 導(dǎo)致養(yǎng)殖產(chǎn)量驟降, 經(jīng)濟(jì)損失十分嚴(yán)重。所以急需通過(guò)生物學(xué)手段, 研究蝦體自身免疫調(diào)控, 從而尋找到有效提高蝦體免疫力及抗病力的方法, 運(yùn)用到凡納濱對(duì)蝦的人工養(yǎng)殖中。

與脊椎動(dòng)物不同, 無(wú)脊椎動(dòng)物不具備獲得性免疫系統(tǒng), 只具有依靠體液和細(xì)胞免疫的先天性免疫系統(tǒng)。Toll樣受體是進(jìn)化中比較保守的一個(gè)受體家族,是參與天然免疫的主要模式識(shí)別受體(Pattern recognition receptor, PRR)之一。Toll樣受體能識(shí)別細(xì)菌、真菌、病毒及寄生蟲的多種病原相關(guān)分子模式PAMP(pathogen associated molecular pattern)(包括脂類、脂蛋白、蛋白質(zhì)、聚糖和核苷酸), 也能識(shí)別體內(nèi)的代謝產(chǎn)物或組織細(xì)胞損傷、壞死時(shí)釋放或分泌的分子, 激活天然免疫系統(tǒng)來(lái)抵抗病原微生物的入侵, 是連接先天性免疫和獲得性免疫的橋梁(Kawai et al,2011; O’Neill et al, 2013)。特定的Toll樣受體能識(shí)別PAMP, 激活 MyD88(髓樣分化因子 88)依賴性和非MyD88依賴性細(xì)胞信號(hào)通路,觸發(fā)炎性細(xì)胞因子和Ⅰ型干擾素的釋放來(lái)進(jìn)行宿主防御, 誘導(dǎo)機(jī)體免疫系統(tǒng)對(duì)病原微生物進(jìn)行清除(羅兵等, 2011)。近年來(lái), 關(guān)于甲殼動(dòng)物Toll樣受體基因的研究也逐漸增多, 其中多種蝦類的Toll樣受體基因相繼被克隆, 例如: 斑節(jié)對(duì)蝦(Arts et al, 2007)、凡納濱對(duì)蝦(Yang et al, 2007)、日本囊對(duì)蝦(Mekata et al, 2008)、中國(guó)明對(duì)蝦(Yang et al, 2008)等。而越來(lái)越多的報(bào)道證明在蝦類存在多種不同類型的Toll樣受體基因, 其中日本囊對(duì)蝦已報(bào)道2種Toll樣受體基因(Mekata et al, 2008), 凡納濱對(duì)蝦中已發(fā)現(xiàn) 3種不同類型 Toll樣受體基因(Yang et al,2007; Wang et al, 2012)。Wang 等(2012)研究發(fā)現(xiàn), 白斑綜合癥病毒感染可以引起凡納濱對(duì)蝦鰓部LvToll1、LvToll2和LvToll3基因的表達(dá)顯著升高; 而感染溶藻弧菌(Vibrio alginolyticus)只能引起鰓中LvToll1基因的表達(dá)顯著升高。與之相反, 多種病原相關(guān)分子模式均可以引起日本囊對(duì)蝦血淋巴Toll2基因的表達(dá)量的顯著提高(Mekata et al, 2008)。所以推測(cè)蝦類不同類型的 Toll樣受體基因可能具有不同的免疫調(diào)控功能。但由于之前對(duì)于病原體感染所引起的蝦類 Toll樣受體基因表達(dá)變化的相關(guān)研究主要集中于單一組織(Yang et al, 2008; Wang et al, 2012), 所以關(guān)于不同類型 Toll樣受體在不同組織參與免疫調(diào)控機(jī)理以及生理功能差異還有待進(jìn)一步研究。

本文比較和分析了目前所知的幾種凡納濱對(duì)蝦Toll樣受體基因在蝦體感染不同病原微生物后不同免疫組織中的表達(dá)變化差異。同時(shí)比較了短期和長(zhǎng)期感染情況下, 不同組織中幾種Toll樣受體的表達(dá)變化情況, 并初步探討了不同類型Toll樣受體基因參與先天免疫調(diào)控的機(jī)理, 為進(jìn)一步研究凡納濱對(duì)蝦的免疫調(diào)控機(jī)制和不同類型 Toll樣受體的具體生理功能差異提供一定的理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

凡納濱對(duì)蝦采自上海申漕特種水產(chǎn)開發(fā)公司,體長(zhǎng)(12 ± 0.8)cm, 體重(10.8 ± 0.6)g。選取體格健壯,規(guī)格大致相同的實(shí)驗(yàn)用蝦分養(yǎng)于多個(gè)水族缸里。實(shí)驗(yàn)開始前, 隨機(jī)抽取實(shí)驗(yàn)用蝦進(jìn)行白斑綜合癥病毒和溶藻弧菌感染檢測(cè), 以確保實(shí)驗(yàn)用蝦不存在病原體感染。養(yǎng)殖期間保持自然光照, 水溫(26 ± 1)°C, 鹽度30 ± 0.5, pH值8.0 ± 0.2, 24h保持人工通氣和循環(huán)過(guò)濾海水。感染實(shí)驗(yàn)前實(shí)驗(yàn)用蝦馴養(yǎng)1周, 使其適應(yīng)實(shí)驗(yàn)環(huán)境。

1.2 方法

1.2.1 溶藻弧菌(Vibrio alginolyticus)菌懸液的制備參考劉志剛等(2012)制備方法將經(jīng)液體石蠟保藏法保存的溶藻弧菌菌種接種于牛肉膏蛋白胨液體培養(yǎng)基上(蛋白胨0.5g, 牛肉膏0.3g, 酵母粉0.1g, NaCl 2g,去離子水 100mL, pH 調(diào)至 7.2左右)活化后, 再經(jīng)

TCBS培養(yǎng)基活化一次, 37°C培養(yǎng) 24h, 然后挑取長(zhǎng)勢(shì)良好的溶藻弧菌菌落接種到牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基中, 放置于恒溫振蕩培養(yǎng)箱。在28°C, 200r/min條件下富集培養(yǎng) 24h后, 在 4°C, 4000r/min條件下離心10min, 將上清液棄去, 采用無(wú)菌生理鹽水洗滌沉淀2次。利用細(xì)菌平板計(jì)數(shù)法, 按要求稀釋成濃度為2.4×106CFU/mL的菌懸液, 于4°C冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 白斑綜合癥病毒(White Spot Syndrome Virus,WSSV)病毒的制備 WSSV病毒精提液病毒粒子由上海海洋大學(xué)食品學(xué)院王永杰教授處提供, 原濃度 1×108copy/μL, –80°C 保存, 使用之前將病毒液在冰上解凍, 用預(yù)冷的無(wú)菌生理鹽水將濃度稀釋為 103copy/μL。

1.2.3 感染試驗(yàn) 隨機(jī)挑選健康規(guī)格一致的蝦體作為實(shí)驗(yàn)用蝦, 平均體重為11.45g。將實(shí)驗(yàn)用蝦分為兩組, 采用為肌肉注射法進(jìn)行致病微生物感染。其中一組注射0.2mL濃度為2.4×106CFU/mL的溶藻弧菌;另一組注射0.2mL濃度為103copies/μL的白斑綜合癥病毒, 每組分三個(gè)平行組, 每個(gè)平行組為30尾蝦。分別于注射后 0、1、3、6、9、12、24h收集各組組織樣品。注射14d后, 收集存活個(gè)體血淋巴及鰓組織樣品。各組織樣品于–80°C冰箱中保存, 以用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)各目的基因表達(dá)量的測(cè)定。

1.2.4 總 RNA的提取 將凍存的組織樣品取出,勻漿后, 按照TRIzol?reagent試劑盒操作說(shuō)明提取總RNA。采用核酸蛋白測(cè)定儀測(cè)定所提 RNA樣品的OD260及 OD280值, 以確定 RNA 的濃度, 并用OD260/OD280的比值判斷其純度。0.8%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)RNA質(zhì)量。

1.2.5 反轉(zhuǎn)錄及引物設(shè)計(jì) 按照 TaKaRa PrimeScript?RT reagent Kit With gDNA Eraser(Perfect Real Time)試劑盒操作說(shuō)明, 將之前所提取的總 RNA 反轉(zhuǎn)錄獲得 cDNA。反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物于–20°C保存?zhèn)溆?。根?jù)本實(shí)驗(yàn)之前所克隆的凡納濱對(duì)蝦Toll樣受體基因片段序列(葉旻玉等, 2008)以及目前已報(bào)道的幾種凡納濱對(duì)蝦Toll樣受體基因(GenBank序列號(hào): JN180638, JN180637)和 18S基因的序列(NCBI GenBank序列號(hào): EU920969)設(shè)計(jì)特異性引物(表1)。

表1 Real-time PCR檢測(cè)所用引物序列Tab.1 Nucleotide sequences of the primers used in Real-time PCR

使用 ABI PRISM?7900 Sequence Detection System儀器, 參照SYBR?Green Realtime PCR Master Mix試劑盒說(shuō)明對(duì)實(shí)驗(yàn)各組樣品的Toll樣受體基因、18S基因 cDNA進(jìn)行定量測(cè)定。ABI PRISM?7900 Sequence Detection System的具體反應(yīng)程序設(shè)計(jì)為:

95°C 預(yù)變性 20s, 95°C 變性 3s, 60°C 退火 30s,72°C延伸 30s, 共 40個(gè)循環(huán)。最后進(jìn)行融解曲線分析, 以確定PCR產(chǎn)物質(zhì)量。

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

Real-time PCR 分析中, 采用 2–ΔΔt計(jì)算法對(duì)各組樣品所測(cè)基因進(jìn)行定量分析。最后采用目的基因與內(nèi)參基因18S的比值來(lái)表示目的基因的相對(duì)定量結(jié)果。所有數(shù)據(jù)采用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差(means ± SD)表示。采用SPSS 18.0 統(tǒng)計(jì)軟件來(lái)分析數(shù)據(jù), 用Duncan's multiple range test來(lái)檢驗(yàn)統(tǒng)計(jì)差異, 當(dāng)P＜0.05認(rèn)為差異顯著。

2 結(jié)果

2.1 凡納濱對(duì)蝦不同類型 Toll樣受體基因的組織表達(dá)情況

通過(guò)real-time PCR法檢測(cè)發(fā)現(xiàn)三種Toll樣受體基因在所測(cè)各組織中均有表達(dá)。Toll1基因在肌肉、血淋巴、心臟和鰓均有較高表達(dá), 其中心臟表達(dá)量最高; Toll2基因在血淋巴、心臟和鰓均有較高表達(dá), 其中在鰓表達(dá)量最高; Toll3基因在鰓和心臟有較高表達(dá), 其中在鰓表達(dá)量最高(圖1)。

圖1 凡納濱對(duì)蝦3種Toll樣受體基因在不同組織表達(dá)情況Fig.1 The expressions of 3 Toll mRNA in different tissues of white shrimp

2.2 感染溶藻弧菌后凡納濱對(duì)蝦不同類型 Toll樣受體基因表達(dá)變化情況

感染實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明: 在溶藻弧菌感染后 1h, 實(shí)驗(yàn)用蝦血淋巴3種Toll樣受體基因mRNA水平均顯著提高(P＜0.05), 分別為感染前水平的 4.51倍、2.34倍和3.17倍(圖2)。感染6h后Toll2 mRNA水平達(dá)到最高值, 為感染前水平的12.89倍, 且明顯高于Toll1和 Toll3 mRNA水平。感染后 12h后 Toll1和 Toll3 mRNA水平均達(dá)到最高值, 分別為感染前水平的12.62倍和6.68倍, 其中Toll1 mRNA水平顯著高于其它2種受體。感染后24h后3種Toll樣受體基因mRNA水平均下降, 分別為感染前水平的 3.86倍、4.31倍和2.98倍, 仍明顯高于感染前水平(P＜0.05), 且Toll2 mRNA水平顯著高于其它2種Toll樣受體基因。

圖2 溶藻弧菌感染后凡納濱對(duì)蝦血淋巴Toll樣受體基因表達(dá)變化情況Fig.2 Changes of three Toll mRNA levels at the haemolymph of white shrimp after injection of V. alginolyticus Data are represented as means ± SEM (n=35).

在溶藻弧菌感染后 1h, 實(shí)驗(yàn)用蝦鰓中 Toll1和Toll2 mRNA水平均提高, 分別為感染前水平的 1.22倍和 1.35倍, 但相對(duì)于感染前水平差異不顯著(P＞0.05), 其中Toll1 mRNA水平顯著高于其它2種受體(圖3)。感染3h后Toll1 mRNA水平達(dá)到最高值, 為感染前水平的 2.78倍, 明顯高于感染前水平(P＜0.05)。感染后12h后Toll3 mRNA水平達(dá)到最高值, 為感染前水平的 5.85倍, 明顯高于感染前水平(P＜0.05)。感染后24h, Toll1和Toll2 mRNA水平分別為感染前水平的 1.12倍和 1.45倍, 且差異不顯著(P＞0.05), 而Toll3 mRNA水平顯著高于感染前水平,為感染前水平的 4.61倍, 且顯著高于 Toll1和 Toll2 mRNA水平(P＜0.05)。在溶藻弧菌感染 24h內(nèi), 凡納濱對(duì)蝦鰓的Toll2 mRNA水平相對(duì)感染前水平均無(wú)顯著升高(P＞0.05)。

圖3 溶藻弧菌感染后凡納濱對(duì)蝦鰓Toll樣受體基因表達(dá)變化情況Fig.3 Changes of three Toll mRNA levels at the gill of white shrimp after injection of V. alginolyticus

2.3 感染W(wǎng)SSV后凡納濱對(duì)蝦不同類型Toll樣受體基因表達(dá)變化情況

感染實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明: 在 WSSV感染后 1h, 實(shí)驗(yàn)用蝦血淋巴3種Toll樣受體基因mRNA水平相對(duì)于感染前均無(wú)顯著提高。感染3h后3種Toll樣受體基因mRNA水平均顯著提高(P＜0.05), 分別為感染前水平的9.10倍、11.43倍和8.72倍, 其中Toll2 mRNA水平明顯高于其它2種Toll基因(圖4)。感染6h后3種 Toll mRNA水平均達(dá)到最高值, 分別為感染前水平的13.27倍、34.56倍和9.31倍, 其中Toll2 mRNA水平仍明顯高于其它 2種 Toll基因 mRNA水平(P＜0.05)。感染后9h后3種Toll mRNA水平均明顯下降, 其中Toll1 mRNA水平為感染前的2.62倍, 仍明顯高于感染前水平(P＜0.05), 且明顯高于其它 2種Toll基因mRNA水平(P＜0.05)。感染后12h, 3種Toll mRNA水平分別為感染前水平的2.21倍、3.75倍和4.19倍, 均顯著高于感染前水平(P＜0.05), 其中 Toll2 mRNA水平顯著高于其它2種Toll基因。感染后24h,Toll1 mRNA水平為感染前的2.48倍, 顯著高于感染前水平(P＜0.05), Toll2和Toll3 mRNA水平分別為感染前水平的1.25倍和1.39倍, 與感染前水平差異不顯著(P＞0.05)。

圖4 WSSV感染后凡納濱對(duì)蝦血淋巴Toll樣受體基因表達(dá)變化情況Fig.4 Changes of three Toll mRNA levels at the haemolymph of white shrimp after injection of WSSV

WSSV感染后1h, 實(shí)驗(yàn)用蝦鰓3種Toll樣受體基因 mRNA水平相對(duì)于感染前均無(wú)顯著提高(P＞0.05),其中Toll2 mRNA水平顯著高于其它2種基因(圖5)。感染3h后3種Toll樣受體基因mRNA水平均顯著提高(P＜0.05), 分別為感染前水平的7.12倍、5.89倍和6.18倍, 其中Toll2 mRNA水平最高, Toll1次之。感染6h后3種Toll mRNA水平均達(dá)到最高值, 分別為感染前水平的11.02倍、5.91倍和7.65倍, 其中Toll3 mRNA水平明顯低于其它2種基因, 而Toll1與Toll2 mRNA水平之間差異不顯著(P＞0.05)。感染后9h后3種 Toll mRNA水平均明顯下降, 分別為感染前水平的2.39倍、0.86倍和1.51倍, 其中Toll1 mRNA水平明顯高于感染前水平和其它2種基因(P＜0.05)。感染后 12h, Toll1與 Toll3基因表達(dá)量明顯提高(P＜0.05),分別為感染前水平的 4.36倍和 3.85倍, 明顯高于感染前水平, 其中Toll1 mRNA水平最高, Toll3次之。感染24h后, 3種Toll mRNA水平分別為感染前水平的1.07倍、0.73倍和1.38倍, 與感染前水平差異不顯著(P＞0.05)。

2.4 感染溶藻弧菌或WSSV 14d后凡納濱對(duì)蝦3種Toll樣受體基因表達(dá)情況

感染溶藻弧菌 14d后, 試驗(yàn)用蝦存活率為25.56%。采用Real-time PCR技術(shù)對(duì)存活個(gè)體的血淋巴及鰓部樣品進(jìn)行檢測(cè)。存活個(gè)體血淋巴 3種 Toll mRNA水平均顯著高于對(duì)照組(P＜0.05), 分別為感染前水平的16.88倍、18.79倍和3.07倍, 其中Toll2 mRNA水平明顯高于其它 2種基因(P＜0.05), Toll3 mRNA水平最低; 鰓部3種Toll mRNA水平均顯著高于對(duì)照組(P＜0.05), 分別為感染前水平的 17.34倍、6.04倍和6.76倍, 其中Toll1 mRNA水平明顯高于其它2種基因(P＜0.05), 而Toll3 mRNA水平最低(圖 6)。

圖5 WSSV感染后凡納濱對(duì)蝦鰓Toll樣受體基因表達(dá)變化情況Fig.5 Changes of three Toll mRNA levels at the gill of white shrimp after injection of WSSV

圖6 溶藻弧菌感染14d后凡納濱對(duì)蝦Toll樣受體基因表達(dá)變化情況Fig.6 Changes of three Toll mRNA levels of white shrimp 14 days after injection of V. alginolyticus

感染W(wǎng)SSV 14d后, 試驗(yàn)用蝦存活率為11.67%。存活個(gè)體血淋巴3種Toll mRNA水平均顯著高于對(duì)照組(P＜0.05), 分別為感染前水平的105.15倍、36.13倍和18.46倍, 其中Toll1 mRNA水平最高, 明顯高于其它2種基因(P＜0.05), Toll3 mRNA水平最低; 鰓部3種Toll mRNA水平均顯著高于對(duì)照組(P＜0.05), 分別為感染前水平的 7.21倍、17.76倍和 2.82倍, 其中Toll2 mRNA水平最高, 明顯高于其它 2種基因(P＜0.05), Toll3 mRNA 水平最低(圖 7)。

3 討論

圖7 WSSV感染14d后凡納濱對(duì)蝦Toll樣受體基因表達(dá)變化情況Fig.7 Changes of three Toll mRNA levels of white shrimp 14 days after injection of WSSV

本研究發(fā)現(xiàn)凡納濱對(duì)蝦三種 Toll樣受體基因在各組織中均有表達(dá)。其中Toll1基因在肌肉, 血淋巴,心臟和鰓均有較高表達(dá), 且心臟表達(dá)量最高; Toll2基因在血淋巴, 心臟和鰓均有較高表達(dá), 其中在鰓表達(dá)量最高; Toll3基因在鰓和心臟有較高表達(dá), 其中在鰓表達(dá)量最高。這與Yang等(2008)在中國(guó)明對(duì)蝦, Wang等(2012)在凡納濱對(duì)蝦的研究報(bào)道相一致。鰓與血淋巴是甲殼動(dòng)物受到致病微生物感染的主要組織和器官(Johansson et al, 2000), 也是機(jī)體進(jìn)行先天性免疫的主要部位。因此, Toll樣受體基因在鰓和血淋巴的高表達(dá), 將有利于 Toll樣受體基因識(shí)別相關(guān)病原體,介導(dǎo)先天性免疫反應(yīng), 從而抵抗病原微生物的感染。

本研究還發(fā)現(xiàn), 人工感染W(wǎng)SSV后6h內(nèi), 凡納濱對(duì)蝦鰓部和血淋巴中 3種不同類型的 Toll 樣受體mRNA水平均顯著提高, 且均達(dá)到各自表達(dá)量的峰值。隨后3種Toll 樣受體mRNA水平逐漸下降, 在人工感染W(wǎng)SSV 24h后, 除血淋巴Toll1 mRNA水平仍顯著高于對(duì)照組水平, 其余兩種 Toll樣受體基因mRNA水平均回落到感染前水平, 這與Wang等(2012)的研究結(jié)果相一致。同時(shí)有研究報(bào)道, poly I:C和咪喹莫特(Imiquimod)可以明顯提高日本囊對(duì)蝦 Toll樣受體基因的表達(dá)量, 從而顯著提高蝦體感染 WSSV后的存活率(Kono et al, 2015)。由此推測(cè)凡納濱對(duì)蝦Toll樣受體基因可能參與WSSV感染所引起的免疫調(diào)控。甲殼動(dòng)物在外源病原微生物感染以后, 缺乏一套像脊椎動(dòng)物一樣完善的后天性免疫系統(tǒng)(獲得性免疫系統(tǒng)), 而主要依靠先天性免疫系統(tǒng)抵御病毒和細(xì)菌等病原微生物入侵。先天性免疫系統(tǒng)的激活, 主要是通過(guò)自身的模式識(shí)別受體(Pattern recognition receptor,PRR)與病毒和細(xì)菌上存在的病原相關(guān)分子模式(Pathogen-associated molecular pattern, PAMP)特異性結(jié)合來(lái)實(shí)現(xiàn)(Akira et al, 2006)。Toll樣受體就是一種重要的先天性免疫模式識(shí)別受體(PRR)。因此當(dāng)WSSV感染蝦體后, 凡納濱對(duì)蝦Toll樣受體基因在病毒感染的主要部位鰓和血淋巴中大量表達(dá), 通過(guò)識(shí)別相關(guān)的病原相關(guān)分子模式, 激活相關(guān)下游信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo), 從而參與蝦體的先天性免疫調(diào)控。

與之前的病毒感染實(shí)驗(yàn)結(jié)果不同, 在人工感染溶藻弧菌3h后, 凡納濱對(duì)蝦鰓部Toll1 mRNA水平顯著提高, 但Toll2 mRNA水平并無(wú)顯著性提高, Toll3 mRNA水平直到感染后12h才開始有顯著提高, 這與Yang等(2008)在中國(guó)明對(duì)蝦以及Wang等(2012)在凡納濱對(duì)蝦的研究成果相似。同時(shí)有研究發(fā)現(xiàn), 通過(guò)RNAi技術(shù)介導(dǎo) Toll1基因沉默后會(huì)明顯提高凡納濱對(duì)蝦 Vibrio harveyi感染后的死亡率(Wang et al,2010)。因此說(shuō)明Toll1在凡納濱對(duì)蝦細(xì)菌感染所引起的免疫調(diào)控中發(fā)揮著重要作用。但隨后通過(guò)對(duì)溶藻弧菌感染蝦體的血淋巴中 Toll樣受體基因的表達(dá)情況研究發(fā)現(xiàn), 3種Toll樣受體基因mRNA水平在感染后均有顯著提高, 其中Toll2 mRNA水平在感染后6h達(dá)到最高值, 且明顯高于其它 2種 Toll基因, 而 Toll1和Toll3 mRNA水平在感染后12h達(dá)到最高值, 這與Wang等(2012)在凡納濱對(duì)蝦中的研究結(jié)果有所不同。Wang等(2012)的研究發(fā)現(xiàn)溶藻弧菌感染只能引起凡納濱對(duì)蝦鰓部Toll1基因的表達(dá)顯著升高, 而Toll2與Toll3基因的表達(dá)并無(wú)顯著變化。我們推測(cè)造成結(jié)果差異的主要原因可能是不同類型的 Toll樣受體基因參與蝦體免疫調(diào)控的主要部位有所不同。血淋巴細(xì)胞是甲殼動(dòng)物免疫系統(tǒng)中十分重要的組成部分, 其細(xì)胞免疫主要是通過(guò)血細(xì)胞。由于甲殼動(dòng)物不具有抗體介導(dǎo)的后天獲得性免疫, 所以其體液免疫也主要通過(guò)血淋巴中的一些相關(guān)酶(如溶菌酶、酚氧化酶、堿性磷酸酶、酸性磷酸酶和超氧化物歧化酶等)以及免疫相關(guān)因子(如抗菌肽、凝集素、溶血素等)等來(lái)實(shí)現(xiàn)(劉靖華等, 2001), 例如: 凡納濱對(duì)蝦在感染弧菌后,其血淋巴中 Toll樣受體基因和溶菌酶基因的表達(dá)均會(huì)顯著上調(diào)(Burge et al, 2007; Wang et al, 2010), Toll樣受體基因可能通過(guò)介導(dǎo)下游信號(hào)傳導(dǎo), 從而促進(jìn)血淋巴中溶菌酶基因的表達(dá), 最終參與體液免疫調(diào)控。溶菌酶通過(guò)水解構(gòu)成細(xì)菌細(xì)胞壁成分的多糖胞壁質(zhì)中的 N-乙酰葡萄糖胺與 N-乙酰胞壁酸之間的β-1 ,4-糖苷鍵, 從而使細(xì)菌因滲透壓不平衡而破裂,達(dá)到防御外源致病細(xì)菌的侵害(徐海圣等, 2001)。同時(shí)有研究發(fā)現(xiàn), 凡納濱對(duì)蝦 Toll2基因具有明顯增強(qiáng)相關(guān)抗菌肽基因啟動(dòng)子活性的作用(Wang et al,2012)。除此之外, β-葡聚糖, 脂多糖以及肽聚糖均可以顯著提高日本囊對(duì)蝦以及中華絨螯蟹血淋巴中Toll2基因的表達(dá)量(Mekata et al, 2008; Yu et al, 2013),而 β-葡聚糖, 脂多糖以及肽聚糖正是先天性免疫系統(tǒng)中各種致病細(xì)菌主要的病原相關(guān)分子模式(O’Neill,2004; Akira et al, 2006)。因此在凡納濱對(duì)蝦的免疫系統(tǒng)中, Toll2基因極有可能通過(guò)提高在血淋巴中的表達(dá), 從而參與由細(xì)菌所引起的免疫調(diào)控。所以本研究推測(cè)在外源細(xì)菌感染以后, 凡納濱對(duì)蝦血淋巴以及鰓中Toll1與Toll3基因表達(dá)量明顯升高, 從而介導(dǎo)下游信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo), 參與蝦體的先天性免疫。而 Toll2基因雖然在鰓中表達(dá)量沒(méi)有顯著提高, 而是通過(guò)提高在血淋巴中的表達(dá)量, 從而增加對(duì)相關(guān)病原相關(guān)分子模式的識(shí)別, 刺激相關(guān)免疫因子或酶的表達(dá), 最終共同參與病原細(xì)菌感染所引起的免疫調(diào)控。但是關(guān)于不同類型 Toll樣受體基因在凡納濱對(duì)蝦先天性免疫調(diào)控中的具體生理功能和調(diào)控機(jī)制的差異還有待進(jìn)一步的研究。

除此之外, 本研究還通過(guò)對(duì)感染 WSSV或溶藻弧菌14d后的存活個(gè)體的Toll樣受體基因表達(dá)情況檢測(cè)發(fā)現(xiàn), 在感染W(wǎng)SSV或溶藻弧菌14d后的存活個(gè)體的鰓部和血淋巴中3種Toll mRNA水平均顯著高于對(duì)照組, 其中感染W(wǎng)SSV個(gè)體血淋巴中Toll1 mRNA水平最高, 鰓部Toll2 mRNA水平最高; 感染溶藻弧菌個(gè)體中, 血淋巴的Toll2 mRNA表達(dá)水平最高, 而在鰓部以Toll1 mRNA的表達(dá)水平為最高, 以上結(jié)果與之前凡納濱對(duì)蝦感染 WSSV或溶藻弧菌后短期內(nèi)Toll樣受體基因的表達(dá)情況有所不同。在致病細(xì)菌或病毒感染的早期, 凡納濱對(duì)蝦Toll樣受體基因表達(dá)水平在短時(shí)間內(nèi)迅速升高, 從而啟動(dòng)先天性免疫。但在達(dá)到一定峰值后, 由于Toll信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中的多種負(fù)向調(diào)控因子的負(fù)反饋?zhàn)饔?Liew et al, 2005), 從而導(dǎo)致Toll樣受體基因表達(dá)水平在短時(shí)間內(nèi)(24h內(nèi))又恢復(fù)到感染前水平。但是在長(zhǎng)期感染過(guò)程中, 可能由于較高濃度的病原微生物的持續(xù)刺激, 生物體只有在主要感染部位(鰓與血淋巴)不斷保持較高的Toll樣受體基因表達(dá)水平, 從而將免疫水平維持在一個(gè)較高的水平, 才可以抵抗病毒或細(xì)菌的不斷侵害, 這也可能是感染W(wǎng)SSV或溶藻弧菌14d后, 蝦體血淋巴及鰓中各種 Toll樣受體基因表達(dá)水平均顯著高于對(duì)照組的主要原因。

4 結(jié)論

本研究首次比較了凡納濱對(duì)蝦在短期或長(zhǎng)期感染不同病原微生物情況下, 不同免疫組織中幾種Toll樣受體基因的表達(dá)變化情況, 并分析了不同類型Toll樣受體基因參與先天免疫調(diào)控的機(jī)理, 推測(cè)凡納濱對(duì)蝦已知的三種 Toll樣受體可能參與病毒或弧菌所引起的不同組織的免疫調(diào)控, 為進(jìn)一步研究凡納濱對(duì)蝦的先天免疫調(diào)控機(jī)理以及不同類型 Toll樣受體的具體生理功能差異提供理論基礎(chǔ)。

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