作者單位：315000 寧波，寧波明州醫(yī)院神經(jīng)外科(江漢清)；510630 廣州，中山大學(xué)附屬第三醫(yī)院(羅侖，梁朝峰)

營(yíng)養(yǎng)缺乏自噬因子1對(duì)人腦膠質(zhì)瘤U251細(xì)胞增殖侵襲能力的影響

江漢清羅侖梁朝峰

【摘要】目的探討營(yíng)養(yǎng)缺乏自噬因子1對(duì)人腦膠質(zhì)瘤U251細(xì)胞增殖侵襲能力的影響。 方法 復(fù)蘇培養(yǎng)人腦膠質(zhì)瘤U251細(xì)胞，建立轉(zhuǎn)染小干擾RNA(siRNA)的NAF1組(si-NAF1組)、陰性對(duì)照組(si-NC組)、未轉(zhuǎn)染siRNA對(duì)照組(control組)，采用CCK-8實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞增殖能力、平板克隆形成實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞克隆形成能力、細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)檢測(cè)各組細(xì)胞遷移能力、Transwell法觀察各組細(xì)胞侵襲能力變化。結(jié)果與control組比較，NAF1-siRNA干預(yù)U251細(xì)胞后，si-NAF1組NAF1的mRNA和蛋白表達(dá)水平均明顯降低(P均<0.05)，其增殖細(xì)胞核抗原(PCNA)、基質(zhì)金屬蛋白酶-9(MMP-9)蛋白表達(dá)水平降低，細(xì)胞增殖能力下降，克隆形成能力明顯減弱，遷移能力明顯降低，穿過Transwell膜的細(xì)胞數(shù)量明顯減少(P均<0.05)。si-NC組與control組各項(xiàng)結(jié)果比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。結(jié)論轉(zhuǎn)染siRNA后NAF1表達(dá)下降，進(jìn)而下調(diào)PCNA水平，抑制人腦膠質(zhì)瘤U251細(xì)胞的增殖能力；同時(shí)MMP-9蛋白表達(dá)水平下降，抑制U251細(xì)胞的遷移和侵襲能力。

【關(guān)鍵詞】腦膠質(zhì)瘤；RNA干擾；細(xì)胞增殖；腫瘤侵襲

DOI：10.3969/g.issn.0253-9802.2015.02.004

通訊作者，梁朝峰，E-mail：lcfjeff@163.com

收稿日期：(2014-10-09)

Influence of nutrient-deprivation autophagy factor-1 on the proliferation and invasion of human glioma cell line U251JiangHanqing,LuoLun，LiangChaofeng.DepartmentofNeurosurgery，NingboMingzhouHospital,Ningbo315000,China

Correspondingauthor,LiangChaofeng,E-mail:lcfjeff@163.com

Abstract【】ObjectiveTo investigate the effect of nutrient-deprivation autophagy factor-1 (NAF1) upon the proliferation and invasion of human glioma cell line U251. MethodsResuscitation of human glioma cell line U251 was conducted. The cultured U251 cells were divided into the si-NAF1, si-NC and control groups. CCK-8 assay was performed to assess the proliferation of U251 cells. Plate cloning formation assay was utilized to evaluate the formation of cell cloning. Wound healing assay was conducted to investigate the migration of U251 cells. Changes in the migration of U251 cells were determined by Transwell invasion assay. ResultsThe expression of NAF1 in U251 cells transfected with NAF1-siRNA at both protein and RNA levels was significantly down-regulated compared with those in si-NC and control groups (both P<0.05). The protein expression of proliferating cell nuclear antigen (PCNA) and matrix metalloprotein-9 (MMP-9) was significantly down-regulated. The proliferation, formation of cell cloning and migration of U251 cells in the si-NAF1 group were obviously suppressed, and the count of U215 cells trespassing the Transwell membrane was significantly decreased compared with those in the control group (all P<0.05). There was no statistically significant difference between Si-NC group and the control group in above indexes(P>0.05). ConclusionsAfter transfection with siRNA, the expression of NAF1 was decreased, thereby down-regulating the expression of PCNA and inhibiting the proliferation of U251 cells. Down-regulated expression level of MMP-9 protein suppressed the proliferation and migration of U251 cells.

【Key words】Glioma; RNA interference; Cell proliferation; Neoplasm invasion

腦膠質(zhì)瘤是最常見的中樞神經(jīng)系統(tǒng)惡性腫瘤[1]。腦膠質(zhì)瘤的手術(shù)、放射治療、化學(xué)治療等治療方法在不斷改進(jìn)，但其療效仍然未得到明顯提高，患者預(yù)后較差，中位生存期僅13個(gè)月左右[2-3]。闡明腦膠質(zhì)瘤生存過程中導(dǎo)致增殖和侵襲的機(jī)制，有利于發(fā)現(xiàn)新的治療策略[4]。因此，尋找和研究在腦膠質(zhì)瘤的生物學(xué)過程中的關(guān)鍵分子具有重要的科學(xué)意義和臨床應(yīng)用價(jià)值。營(yíng)養(yǎng)缺乏自噬因子1(NAF1)基因定位于人4號(hào)染色體長(zhǎng)臂，是一種新發(fā)現(xiàn)的、與細(xì)胞能量代謝和增殖凋亡相關(guān)的蛋白[5]。近年研究表明，其表達(dá)與乳腺癌等多種惡性腫瘤的增殖、侵襲密切相關(guān)[6]。已證實(shí)其可能通過核因子-κB、Wnt等信號(hào)通路影響多種細(xì)胞和功能蛋白的表達(dá)[7]。該基因有望成為包括人腦膠質(zhì)瘤在內(nèi)的多種腫瘤治療靶點(diǎn)[8]。目前，NAF1對(duì)人腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖、侵襲的作用及其影響機(jī)制尚不明確[9]。為此，本研究采用針對(duì)NAF1的小干擾RNA(NAF1-siRNA)轉(zhuǎn)染人腦膠質(zhì)瘤U251細(xì)胞，觀察其對(duì)NAF1基因的沉默作用，并進(jìn)一步探討其對(duì)人腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖和侵襲能力的影響，現(xiàn)報(bào)告如下。

材料與方法

一、實(shí)驗(yàn)材料

人腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞株U251由中山大學(xué)附屬第三醫(yī)院神經(jīng)外科實(shí)驗(yàn)室凍存。

二、主要試劑和儀器

主要試劑有DMEM高糖培養(yǎng)基，胎牛血清(FBS)、胰酶、磷酸鹽緩沖液(PBS)、Trizol液、脂質(zhì)體2000( LipofectamineTM2000)購(gòu)自美國(guó)Invitrogen公司；CCK(cell counting kit)-8試劑盒購(gòu)自日本同仁公司；RT-PCR引物采用Primer 3軟件設(shè)計(jì)，由Invitrogen公司合成。實(shí)時(shí)熒光定量PCR試劑盒購(gòu)自日本Takara公司。兔抗人NAF1抗體、β-actin抗體購(gòu)自美國(guó)BD公司。辣根過氧化物酶標(biāo)記的山羊抗兔IgG二抗、蛋白免疫印跡顯色試劑盒、插入小干擾RNA的NAF1(NAF1-siRNA)、不表達(dá)NAF1的陰性對(duì)照siRNA(NC-siRNA)購(gòu)自廣州安邦生物科技有限公司。主要儀器包括細(xì)胞培養(yǎng)箱(美國(guó)Kendro公司)、倒置顯微鏡(日本Olympus公司)、酶標(biāo)儀(美國(guó)Molecular Devices公司)、Labcycler48 PCR儀(德國(guó) SensoQuest公司)和Mini-PROTEAN3 蛋白免疫印跡電泳系統(tǒng)(美國(guó) Bio-Rad公司)。

三、實(shí)驗(yàn)方法

1. 細(xì)胞培養(yǎng)和siRNA轉(zhuǎn)染

復(fù)蘇培養(yǎng)人腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞株U251。以含有10%胎牛血清的DMEM高糖培養(yǎng)基作為培養(yǎng)基，常規(guī)培養(yǎng)。細(xì)胞融合度達(dá)60%時(shí)，采用轉(zhuǎn)染試劑(脂質(zhì)體2000)和NAF1-siRNA、NC-siRNA，按照試劑盒說明書，分別作為si-NAF1、si-NC組轉(zhuǎn)染培養(yǎng)48 h。同時(shí)設(shè)立未轉(zhuǎn)染空白對(duì)照組(control組)。每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔，重復(fù)3次實(shí)驗(yàn)后取平均值。

2. NAF1 mRNA表達(dá)水平檢測(cè)

Trizol法提取各組U251細(xì)胞的總RNA，逆轉(zhuǎn)錄合成模板DNA。采用熒光實(shí)時(shí)定量PCR法檢測(cè)NAF1 mRNA表達(dá)水平。引物序列：NAF1上游5’-ATCATCATGTTCAATGCTTTTCT-3’，下游5’-TCAA-TGGCATCAGGGCTTCAC-3’，長(zhǎng)度173 bp；內(nèi)參照GAPDH上游5’-CAACGAATTTGGCTACAGCA-3’，下游5’-AGGGGTCTACATGGCAACTG-3’，長(zhǎng)度432 bp。PCR反應(yīng)條件：92℃ 30 s，92℃ 6 s，61℃ 35 s，共50個(gè)循環(huán)，循環(huán)延伸末端收集熒光信號(hào)，2-ΔΔCt法分析結(jié)果[10]。

3. NAF1 、增殖細(xì)胞核抗原、基質(zhì)金屬蛋白酶-9的蛋白表達(dá)強(qiáng)度檢測(cè)

U251細(xì)胞轉(zhuǎn)染后48 h，收集細(xì)胞，提取蛋白，使用蛋白免疫印跡法分析NAF1、增殖細(xì)胞核抗原(PCNA)、基質(zhì)金屬蛋白酶-9(MMP-9)和內(nèi)參照GAPDH的蛋白表達(dá)強(qiáng)度[11]。

4. U251細(xì)胞增殖能力檢測(cè)

采用CCK-8法檢測(cè)細(xì)胞增殖能力。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期U251細(xì)胞，3×103/孔接種于96孔板，每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔。培養(yǎng)12 h后分組轉(zhuǎn)染。細(xì)胞轉(zhuǎn)染后設(shè)24、48、72 h時(shí)間點(diǎn)，更換無血清培養(yǎng)基，按照試劑盒說明書加入12 μl CCK-8試劑[12]。37 ℃溫箱孵育2 h。用酶標(biāo)儀測(cè)定450 nm處吸光度值。

5. U251細(xì)胞克隆形成能力檢測(cè)

采用平板克隆形成實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞克隆形成能力。取24、48、72 h時(shí)間點(diǎn)的各組U251細(xì)胞制備單細(xì)胞懸液，調(diào)整細(xì)胞密度，分別取500個(gè)細(xì)胞接種于6孔板中，慢速晃動(dòng)培養(yǎng)10 min，使細(xì)胞分散均勻。于培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng)10 d，棄去培養(yǎng)液，多聚甲醛固定后1%結(jié)晶紫染色[13]。光鏡下計(jì)數(shù)細(xì)胞克隆數(shù)，設(shè)定細(xì)胞數(shù)大于20個(gè)為1個(gè)克隆，并計(jì)算克隆形成率，計(jì)算公式為：克隆形成率= (克隆形成數(shù)/接種細(xì)胞總數(shù))×100%。

6. U251細(xì)胞遷移能力檢測(cè)

分組轉(zhuǎn)染U251細(xì)胞后分別接種于6孔板。培養(yǎng)至約60%融合度時(shí)進(jìn)行劃痕。PBS沖洗3次去除漂浮細(xì)胞[14]。加入無血清培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)12 h后拍照，以細(xì)胞遷移距離代表細(xì)胞的遷移能力。

7. U251細(xì)胞侵襲能力檢測(cè)

Transwell小室上室加入40 μl稀釋后的Matrigel基質(zhì)膠，37℃孵育2 h凝固。分組轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞接種入小室上室。下室加入400 μl含血清完全培養(yǎng)基。常規(guī)培養(yǎng)24 h后取出小室，去除未過膜細(xì)胞后甲醇固定。1%結(jié)晶紫染色，顯微鏡下拍照，以穿過小孔的細(xì)胞數(shù)量表示細(xì)胞的侵襲能力。

四、統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

結(jié)果

一、 siRNA干擾對(duì)U251細(xì)胞NAF1 mRNA表達(dá)的影響

si-NAF1組NAF1 mRNA表達(dá)水平為control組的3.5%，為3組中最低(F=38.72，P<0.05)，即干擾效率達(dá)到96.5%，si-NAF1組與control組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=20.38，P<0.05)；而si-NC組與control組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=0.36，P>0.05)，說明NAF1-siRNA的基因沉默效果明顯，見圖1。

圖1　3組U251細(xì)胞NAF1 mRNA表達(dá)水平的比較

二、siRNA干擾對(duì)NAF1、PCNA、MMP-9蛋白表達(dá)的影響

與control組比較，si-NAF1組NAF1、PCNA、MMP-9蛋白的表達(dá)強(qiáng)度均明顯降低(t分別為32.75、26.88、21.42，P均<0.05)，而si-NC組與control組之間的NAF1、PCNA、MMP-9蛋白表達(dá)強(qiáng)度比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均>0.05)，見圖2。

三、siRNA干擾對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)曲線的影響

si-NAF1組U251細(xì)胞在24、48、72 h時(shí)吸光度值均明顯著低于control組 (t值分別為18.65、23.60、35.92，P均<0.05)；且細(xì)胞增殖能力的差異隨著時(shí)間的變化逐漸明顯。而各時(shí)間點(diǎn)si-NC組與control組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均>0.05)，見圖3。

圖23組U251細(xì)胞中NAF1、PCNA、MMP-9蛋白表達(dá)強(qiáng)度的比較

A：蛋白免疫印跡照片；B：定量分析結(jié)果，與control組比較，*P<0.05

四、siRNA干擾對(duì)細(xì)胞克隆形成能力的影響

各時(shí)間點(diǎn)si-NAF1組細(xì)胞的平板克隆形成率明顯低于si-NC組與control組(F=45.77，P<0.05)，而對(duì)照組與si-NC組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=0.341，P>0.05)，見圖4。

五、siRNA干擾對(duì)細(xì)胞遷移能力的影響

劃痕12h后，control組和si-NC組的遷移能力未受到明顯抑制，細(xì)胞表現(xiàn)出相似的遷移能力。si-NAF1組細(xì)胞在劃痕12h時(shí)遷移明顯受限；與control組比較，si-NAF1組的遷移距離縮短，見圖5。

圖3　3組 U251細(xì)胞生長(zhǎng)曲線的比較

六、siRNA對(duì)細(xì)胞侵襲能力的影響

培養(yǎng)24h后，si-NAF1組呈藍(lán)紫色的穿膜細(xì)胞數(shù)明顯少于對(duì)照組，而si-NC組與control組之間的差異不明顯，見圖6。

討論

NAF1蛋白是結(jié)合毒性鐵硫簇的NEET家族成員，與細(xì)胞的能量代謝有關(guān)[6]。近年研究發(fā)現(xiàn)，NAF-1可與凋亡相關(guān)蛋白Bcl-2/Bcl-XL結(jié)合配體發(fā)揮作用，調(diào)節(jié)細(xì)胞的自噬和凋亡，并在體內(nèi)通過調(diào)節(jié)細(xì)胞營(yíng)養(yǎng)和氧化應(yīng)激從而影響細(xì)胞的生存[15]。

圖43組U251細(xì)胞克隆形成能力的比較

A：平板克隆試驗(yàn)照片；B：定量分析結(jié)果，與control組比較，*P<0.05

圖5　3組 U251細(xì)胞在劃痕12 h后的細(xì)胞遷移能力比較

圖6　3組 U251細(xì)胞培養(yǎng)24 h后的侵襲能力比較

本研究通過RNA干擾技術(shù)，將合成的NAF1-siRNA轉(zhuǎn)染至人腦膠質(zhì)瘤U251細(xì)胞[16]。結(jié)果顯示，siRNA通過沉默NAF1基因的表達(dá)，減弱NAF1蛋白表達(dá)。研究進(jìn)一步利用CCK-8試驗(yàn)和平板克隆形成試驗(yàn)檢測(cè)了沉默NAF1表達(dá)后U251細(xì)胞的增殖能力。結(jié)果表明，細(xì)胞在轉(zhuǎn)染NAF1-siRNA后出現(xiàn)明顯的生長(zhǎng)抑制，克隆形成能力也明顯減弱。研究繼而利用細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)檢測(cè)了沉默NAF1表達(dá)后U251細(xì)胞的遷移能力。結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染NAF1-siRNA后的U251細(xì)胞在劃痕12h后，遷移能力受到明顯抑制。研究結(jié)果表明，NAF1-siRNA可能通過降低NAF1的表達(dá)抑制了人腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞的遷移能力。細(xì)胞侵襲能力顯示，轉(zhuǎn)染NAF1-siRNA后，通過凝膠的細(xì)胞數(shù)量明顯減少，提示腫瘤的侵襲能力隨著NAF1蛋白表達(dá)的降低，驗(yàn)證了NAF1蛋白與U251細(xì)胞侵襲能力的相關(guān)性。

本研究進(jìn)一步對(duì)U251細(xì)胞增殖、侵襲能力變化的可能分子機(jī)制進(jìn)行了研究。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，NAF1-siRNA的抗增殖和侵襲作用可能分別通過下調(diào)PCNA、MMP-9蛋白的表達(dá)而實(shí)現(xiàn)的。PCNA是真核細(xì)胞復(fù)制復(fù)合體的重要組成部分，可以通過調(diào)控細(xì)胞周期的相關(guān)蛋白影響細(xì)胞周期，進(jìn)而影響細(xì)胞的增殖能力[17]。既往報(bào)道也認(rèn)為PCNA含量的變化與膠質(zhì)瘤細(xì)胞的增殖能力呈正相關(guān)[18]。在本研究中，PCNA表達(dá)的抑制可能是人腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖能力下降的原因。此外，MMP-9參與了調(diào)控細(xì)胞外基質(zhì)的降解和基底膜的破壞等腫瘤侵襲與轉(zhuǎn)移過程[19]。腫瘤細(xì)胞可通過表達(dá)和分泌MMP-9等機(jī)制金屬蛋白酶,導(dǎo)致基底膜的降解。如果MMP-9表達(dá)量降低，人腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞的遷移和侵襲能力就會(huì)受到明顯抑制[20]。說明NAF1-siRNA對(duì)人腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞的遷移能力產(chǎn)生了明顯的減弱作用。

U251細(xì)胞為典型的人腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞株，在抑制其表達(dá)NAF1蛋白后，可能通過影響PCNA蛋白的表達(dá)，并降低MMP-9蛋白表達(dá)，抑制其增殖和侵襲能力。NAF1在膠質(zhì)細(xì)胞瘤中可能發(fā)揮了致癌因子的作用，BAF1的靶向性基因治療有望成為提高人腦膠質(zhì)瘤治療效果、改善預(yù)后的有效方法之一。

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(本文編輯：林燕薇)

臨床研究論著