盧海龍，楊榮禮，李雷(徐州醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院，江蘇徐州221006)

體外高糖環(huán)境對(duì)H9C2心肌細(xì)胞增殖的影響及其機(jī)制探討

盧海龍，楊榮禮，李雷
(徐州醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院，江蘇徐州221006)

摘要:目的觀察體外高糖環(huán)境對(duì)H9C2心肌細(xì)胞增殖的影響，并探討其作用機(jī)制。方法將體外培養(yǎng)鼠胚心肌細(xì)胞H9C2隨機(jī)分為四組，1組培養(yǎng)液中加入終濃度為5.5 mmol/L的D-葡萄糖，2組加入終濃度為27.5 mmol/L的甘露醇和5.5 mmol/L的D-葡萄糖，3組加入終濃度為33 mmol/L的D-葡萄糖，4組加入終濃度為2 μmol/L的經(jīng)典瞬時(shí)受體蛋白( TRPC)阻滯劑SKF96365和終濃度為33 mmol/L的D-葡萄糖。分別在培養(yǎng)24、48、72 h時(shí)，采用CCK8法測(cè)定細(xì)胞增殖率，實(shí)時(shí)定量PCR法測(cè)定經(jīng)典瞬時(shí)受體蛋白6( TRPC6)、活化T細(xì)胞核因子3( NFAT3) mRNA; 72 h時(shí)采用Western blotting法檢測(cè)TRPC6及NFAT3蛋白。結(jié)果培養(yǎng)72 h時(shí)1、2、3、4組細(xì)胞增殖率分別為105.88%±10.01%、98.67%±8.97%、28.55%±6.32%、49.18%±7.14%，3組較1、2組降低( P均＜0.05)，4組較3組增高( P＜0.05) ; 3組TRPC6、NFAT3 mRNA及蛋白相對(duì)表達(dá)量較1、2組增加( P均＜0.05)，4組較3組下降( P均＜0.05)。結(jié)論高糖抑制心肌細(xì)胞增殖;促進(jìn)心肌細(xì)胞TRPC6表達(dá)，導(dǎo)致TRPC通道開(kāi)放，啟動(dòng)鈣調(diào)神經(jīng)素( CaN)/活化T細(xì)胞核因子( NFAT)通路，可能是其作用機(jī)制。

關(guān)鍵詞:糖尿病心肌病;高糖;鼠胚心肌細(xì)胞株H9C2;經(jīng)典瞬時(shí)受體蛋白6;活化T細(xì)胞核因子3

糖尿病心肌病( DCM)早期表現(xiàn)為舒張性左心功能不全，晚期容易并發(fā)惡性心律失常、心力衰竭、甚至猝死［1，2］。迄今為止，DCM發(fā)病機(jī)制仍不完全明確，治療未有實(shí)質(zhì)性突破［3］。研究發(fā)現(xiàn)，心肌細(xì)胞內(nèi)鈣超載與DCM的發(fā)生有關(guān)［4］。高血糖是糖尿病患者的主要特征之一，能夠直接損傷心肌細(xì)胞，引起心肌病變［5］。但是，高血糖對(duì)心肌細(xì)胞內(nèi)鈣超載是否有促進(jìn)作用及其可能機(jī)制，文獻(xiàn)報(bào)道較少。2012年9月～2013年7月，本研究以體外培養(yǎng)的鼠胚心肌細(xì)胞H9C2為研究對(duì)象，觀察體外高糖環(huán)境對(duì)細(xì)胞形態(tài)及增殖的影響，并探討其作用機(jī)制。

1　材料與方法

1.1材料鼠胚心肌細(xì)胞H9C2購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院。DMEM培養(yǎng)基、D-葡萄糖、胎牛血清( FBS) (美國(guó)Gibco公司)，細(xì)胞計(jì)數(shù)盒CCK-8(日本Dojindo Lab)，細(xì)胞總RNA提取試劑盒、核蛋白提取試劑盒、經(jīng)典瞬時(shí)受體蛋白6( TRPC6)和GAPDH引物、DNA marker(上海生物工程有限公司)，實(shí)時(shí)定量PCR試劑盒(大連TaKaRa公司)，兔抗大鼠TRPC6單克隆抗體、兔抗大鼠活化T細(xì)胞核因子3 ( NFAT3)單克隆抗體、經(jīng)典瞬時(shí)受體通道蛋白( TRPC)通道阻滯劑SKF96365(以色列Alomone Labs公司)。

1.2細(xì)胞培養(yǎng)及分組處理H9C2細(xì)胞在含10% FBS的低糖( 5 mmol/L) DMEM培養(yǎng)基中培養(yǎng)，待細(xì)胞生長(zhǎng)85%左右培養(yǎng)面積后，0.25%胰酶消化，1∶2傳代，8～9代細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)。待細(xì)胞成對(duì)數(shù)生長(zhǎng)后，調(diào)整細(xì)胞數(shù)為1×105/L，接種于6孔培養(yǎng)板，培養(yǎng)24 h;待細(xì)胞成融合狀態(tài)換用無(wú)血清低糖DMEM培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)24 h，使細(xì)胞呈靜止?fàn)顟B(tài)，隨機(jī)分為四組。1組:培養(yǎng)液中加入終濃度為5.5 mmol/L 的D-葡萄糖; 2組:培養(yǎng)液中加入終濃度為27.5 mmol/L的甘露醇和終濃度為5.5 mmol/L的D-葡萄糖; 3組:培養(yǎng)液中加入終濃度為33 mmol/L的D-葡萄糖; 4組:培養(yǎng)液中加入終濃度為2 μmol/L的SKF96365和終濃度為33 mmol/L的D-葡萄糖。

1.3細(xì)胞存活率檢測(cè)將各組細(xì)胞接種于96孔培養(yǎng)板，分別在培養(yǎng)24、48、72 h時(shí)每孔加入CCK-8 10 μL和DMEM 90 μL，37℃、5% CO2條件下孵育1 h，采用酶標(biāo)儀(λ= 450 nm)記錄各孔光密度( OD)值，計(jì)算細(xì)胞增殖率。細(xì)胞增殖率( %) = (處理組OD450－空白孔OD450)/(對(duì)照組OD450－空白孔

OD450)×100%，每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次?？瞻卓诪槲醇蛹?xì)胞懸液的DMEM培養(yǎng)液，1組即對(duì)照組。

1.4 TRPC6、NFAT3 mRNA檢測(cè)采用實(shí)時(shí)定量PCR方法。各組細(xì)胞分別在處理24、48、72 h提取細(xì)胞總RNA，測(cè)定RNA濃度。TRPC6引物序列:上游: 5'-GTCGGTGGTCATCAACTACAATC-3'，下游: 5'-CCACATCCGCATCATCCTCAATT-3'; NFAT3引物序列:上游: 5'-ACAGAAGAGGGGGCGTCTC-3'，下游: 5'-ACCAATAGGGGCAGCACCATA-3'; GAPDH引物序列:上游: 5'-ACGGCAAATTCAACGGCACAGTCA-3'，下游: 5'-TGGGGGCATCGGCAGAAGG-3'。PCR反應(yīng)條件: 95℃變性5 min、95℃30 s、58℃30 s、70℃30 s，40個(gè)循環(huán)。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。以GAPDH為內(nèi)參照，2－ΔΔCt法計(jì)算各組TRPC6、NFAT3 mRNA相對(duì)表達(dá)量。

1.5 TRPC6、NFAT3蛋白檢測(cè)各組細(xì)胞在培養(yǎng)72 h時(shí)(根據(jù)前期實(shí)驗(yàn)結(jié)果確定時(shí)間點(diǎn))采用0.25%胰酶常規(guī)消化并收集，采用Western blotting法檢測(cè)TRPC6( 1∶500)、NFAT3( 1∶2 000)蛋白。具體步驟參照試劑盒說(shuō)明書(shū)。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，以GAPDH作為內(nèi)參照。采用Quantity-One軟件分析各組TRPC6、NFAT3蛋白的相對(duì)表達(dá)量。

1.6統(tǒng)計(jì)學(xué)方法采用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件。符合正態(tài)分布的計(jì)量資料采用珋x±s表示，組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2　結(jié)果

2.1各組細(xì)胞增殖率比較在培養(yǎng)72 h時(shí)，3組細(xì)胞增殖率較1、2組降低( P均＜0.05)，4組較3組增高( P＜0.05) ; 3組72 h時(shí)細(xì)胞增殖率較48 h時(shí)降低( P＜0.05) ; 1、2組細(xì)胞增殖率在各時(shí)間點(diǎn)均無(wú)明顯差異( P均＞0.05) ;見(jiàn)表1。

表1　四組不同時(shí)間點(diǎn)細(xì)胞增殖率比較( %，±s)

表1　四組不同時(shí)間點(diǎn)細(xì)胞增殖率比較( %，±s)

注:與同時(shí)間點(diǎn)1、2組比較，*P均＜0.05;與同時(shí)間點(diǎn)3組比較，△P＜0.05;與同組48 h比較，#P＜0.05。

組別　細(xì)胞增殖率24 h　48 h　72 h 1組25.72±1.89　 65.77±6.87　 105.88±10.01 2組　22.55±2.02　 61.92±5.99　 98.67±8.97 3組　16.78±1.36　 43.22±4.59　 28.55±6.32* #4組　18.79±2.65　 55.43±6.01　 49.18±7.14△

2.2各組TRPC6、NFAT3 mRNA相對(duì)表達(dá)量比較

在培養(yǎng)72 h時(shí)，3組TRPC6、NFAT3 mRNA相對(duì)表達(dá)量較1、2組增加( P均＜0.05)，4組較3組下降( P均＜0.05) ; 3組各時(shí)間點(diǎn)比較，P均＜0.05;見(jiàn)表2。

表2　四組不同時(shí)間點(diǎn)TRPC6、NFAT3 mRNA相對(duì)表達(dá)量比較(±s)

表2　四組不同時(shí)間點(diǎn)TRPC6、NFAT3 mRNA相對(duì)表達(dá)量比較(±s)

注:與同時(shí)間點(diǎn)1、2組比較，*P均＜0.05;與同時(shí)間點(diǎn)3組比較，△P＜0.05;與同組各時(shí)間點(diǎn)比較，#P＜0.05。

組別TRPC6 mRNA 24 h　48 h　72 h NFAT3 mRNA 24 h　48 h　72 h 1組　1.03±0.13　0.96±0.09　1.02±0.11　0.97±0.17　0.99±0.13　1.06±0.19 2組　1.07±0.08　1.12±0.15　1.09±0.26　1.14±0.14　1.11±0.11　1.13±0.18 3組　7.23±0.52　11.39±1.17　16.15±1.49* #　5.23±1.43　9.88±1.96　14.44±2.09* #4組　4.64±0.35　6.79±0.44　10.13±0.69#　2.94±0.24　5.32±0.94　8.97±1.73△

2.3各組TRPC6、NFAT3蛋白相對(duì)表達(dá)量比較在培養(yǎng)72 h時(shí)，1、2、3、4組TRPC6蛋白相對(duì)表達(dá)量分別為0.302±0.017、0.351±0.023、1.874± 0.124、1.214±0.097; NFAT3蛋白相對(duì)表達(dá)量分別為0.247±0.026、0.298±0.034、1.199±0.104、0.656±0.038; 3、4組均高于1、2組( P均＜0.05)，4組均低于3組( P均＜0.05)。

3　討論

研究發(fā)現(xiàn)，持續(xù)高血糖狀態(tài)會(huì)造成心肌細(xì)胞胞質(zhì)內(nèi)、線粒體內(nèi)Ca2 +濃度明顯升高，導(dǎo)致心肌細(xì)胞舒縮功能障礙及凋亡增加［5，6］。在病理狀態(tài)下，胞外鈣的內(nèi)流和胞內(nèi)鈣庫(kù)的釋放則造成細(xì)胞質(zhì)內(nèi)鈣超載［7］。細(xì)胞外鈣內(nèi)流主要通過(guò)電壓門(mén)控鈣信道( VOC)、受體門(mén)控鈣通道( ROC)和鈣庫(kù)操縱性鈣通道( SOC)，其中VOC和ROC主要介導(dǎo)胞外鈣在短時(shí)間內(nèi)大量?jī)?nèi)流，SOC則介導(dǎo)小量持續(xù)鈣內(nèi)流。但是，組成SOC及ROC的具體分子實(shí)體仍不十分明確。研究發(fā)現(xiàn)，TRPC的同源異構(gòu)體是構(gòu)成細(xì)胞膜上SOC和ROC的分子實(shí)體，TRPC通道的啟動(dòng)開(kāi)放可引起心肌細(xì)胞內(nèi)Ca2 +濃度變化，通過(guò)鈣調(diào)神經(jīng)素( CaN)/NFAT信號(hào)通路在細(xì)胞內(nèi)Ca2 +增加誘導(dǎo)的心肌重構(gòu)過(guò)程中發(fā)揮關(guān)鍵作用，進(jìn)而觸發(fā)心肌肥大相關(guān)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，引起心肌重構(gòu)和病理性肥厚［8］。Onohara等［9］發(fā)現(xiàn)，血管緊張素Ⅱ( AngⅡ)誘導(dǎo)的新生大鼠心肌細(xì)胞肥大模型TRPC3、TRPC6 mRNA表達(dá)均顯著上調(diào);而敲除TRPC3 或TRPC6中的任何一個(gè)，都會(huì)明顯抑制心肌細(xì)胞肥大效應(yīng); PLC介導(dǎo)的1，2-二酰甘油( DAG)的生成增多對(duì)上述過(guò)程有直接啟動(dòng)作用。TRPC3與TPRC6均可直接受DAG的啟動(dòng)開(kāi)放，TRPC3與TRPC6通道之間有協(xié)同關(guān)系。研究發(fā)現(xiàn)，TRPC6表達(dá)程度與心肌細(xì)胞

肥大密切相關(guān)，并且證實(shí)這種促進(jìn)心肌細(xì)胞肥大的效應(yīng)是由TRPC介導(dǎo)的Ca2 +-NFAT信號(hào)通路完成［7］。在CaN被持續(xù)啟動(dòng)后，小鼠心肌細(xì)胞膜TRPC6表達(dá)量明顯增加;在人類(lèi)心力衰竭的心肌細(xì)胞中，TRPC6亦出現(xiàn)類(lèi)似過(guò)表達(dá)。Nishida等［10］研究發(fā)現(xiàn)，內(nèi)皮素-1( ET-1)、AngⅡ刺激體外大鼠心肌細(xì)胞和心肌成纖維細(xì)胞，可以顯著提高TRPC6的表達(dá)水平;血小板凝結(jié)抑制劑Forskolin可以顯著下調(diào)TRPC6表達(dá); ET-1的這種作用是由Gα12/13( G-12家族蛋白的亞單位)所介導(dǎo)的，并且這種作用通過(guò)NFAT的持續(xù)激活持續(xù)啟動(dòng)。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，過(guò)表達(dá)TRTRPC6的轉(zhuǎn)基因小鼠NFAT的轉(zhuǎn)錄活性增強(qiáng)，并參與Ca2 +-CaN/NFAT信號(hào)通路的正回饋機(jī)制，通過(guò)抑制5型磷酸二酯酶途徑抑制TRPC6表達(dá)活性增加造成的病理性心肌肥大［11］。高糖通過(guò)增加人類(lèi)足突細(xì)胞黏連蛋白聚糖-4( SDC-4)和活性氧簇( ROS)的表達(dá)調(diào)節(jié)TRPC6的表達(dá)［12］。沒(méi)有基礎(chǔ)心臟病的Klotho基因缺陷小鼠會(huì)出現(xiàn)應(yīng)激狀態(tài)下的心肌細(xì)胞肥大和心室重構(gòu);在健康成年小鼠的心肌細(xì)胞中，Klotho通過(guò)下調(diào)TRPC6而發(fā)揮心臟保護(hù)作用［13］。如果抑制Klotho基因缺陷小鼠TRPC6蛋白的表達(dá)，則可以阻止壓力誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞重構(gòu)。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，TRPC6高表達(dá)的小鼠會(huì)自發(fā)出現(xiàn)心肌重構(gòu);而Klotho過(guò)表達(dá)則可以明顯抑制TRPC6導(dǎo)致的心肌重構(gòu)，延長(zhǎng)小鼠生存期。Kinoshita等［14］證明，TPRC6蛋白是心鈉肽/腦鈉肽-鳥(niǎo)苷酸環(huán)化酶A ( ANP/BNP-GC-A)信號(hào)通路介導(dǎo)的心肌肥大作用的關(guān)鍵靶點(diǎn)。上述研究均證明，TRPC6在心肌肥厚的發(fā)生、發(fā)展過(guò)程中發(fā)揮重要的橋梁作用。

高糖可使心肌細(xì)胞內(nèi)Na+-K+-ATP酶、Ca2 +-Mg2 +活性減低，使心肌細(xì)胞對(duì)鈣的攝取和輸送能力下降，導(dǎo)致心肌收縮功能受損。但高糖是否會(huì)通過(guò)上調(diào)TRPC蛋白的表達(dá)，導(dǎo)致胞內(nèi)鈣超載，從而啟動(dòng)CaN/NFAT信號(hào)通路，目前國(guó)內(nèi)外尚無(wú)相關(guān)研究予以證實(shí)。

H9C2細(xì)胞源于胚胎期大鼠心臟，具有心肌細(xì)胞的很多特性; 33 mmol/L葡萄糖作為研究心肌細(xì)胞高糖損傷的條件，已經(jīng)被廣泛證實(shí)并應(yīng)用［15］。本研究將H9C2心肌細(xì)胞在33 mmol/L葡萄糖條件下培養(yǎng)，細(xì)胞出現(xiàn)肥大、變性、壞死，增殖率降低，說(shuō)明高糖造成細(xì)胞損傷。在培養(yǎng)72 h時(shí)，3組TRPC6、NFAT3 mRNA及蛋白相對(duì)表達(dá)量較1、2組增高;加用TRPC通道阻滯劑skf96365后，心肌細(xì)胞增殖率有所增加，TRPC6、NFAT3 mRNA及蛋白相對(duì)表達(dá)量下調(diào)。上述結(jié)果提示，在高糖條件下TRPC6可能通過(guò)CaN/NFAT3通路造成心肌細(xì)胞損傷。

綜上所述，高糖抑制心肌細(xì)胞增殖，造成心肌細(xì)胞損傷;促進(jìn)心肌細(xì)胞TRPC6表達(dá)，導(dǎo)致TRPC通道開(kāi)放，引起心肌細(xì)胞內(nèi)鈣超載，啟動(dòng)CaN/NFAT3通路，可能是其作用機(jī)制。

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收稿日期:( 2014-12-30)

通信作者:楊榮禮，E-mail: yrl6502@ sina.com

基金項(xiàng)目:徐州市科技計(jì)劃項(xiàng)目( KC14SH110)。

文章編號(hào):1002-266X( 2015) 28-0024-03

文獻(xiàn)標(biāo)志碼:A

中圖分類(lèi)號(hào):R541

doi:10.3969/j.issn.1002-266X.2015.28.008