劉玲，聶丹，鄒倩，詹平，任黔川，陳建瓊，毛熙光(瀘州醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院，四川瀘州646000)

大蒜素對(duì)人宮頸癌HeLa細(xì)胞周期和凋亡的影響

劉玲，聶丹，鄒倩，詹平，任黔川，陳建瓊，毛熙光(瀘州醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院，四川瀘州646000)

摘要:目的探討大蒜素對(duì)人宮頸癌HeLa細(xì)胞周期和凋亡的影響。方法將2.5、5、10、20、40、80、120 μg/mL大蒜素分別作用于體外培養(yǎng)的HeLa細(xì)胞，24、48、72 h后，于倒置相差顯微鏡下觀察HeLa細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化;采用WST-8法測(cè)定HeLa細(xì)胞的增殖抑制率;流式細(xì)胞術(shù)測(cè)定HeLa細(xì)胞的凋亡率和細(xì)胞周期。結(jié)果倒置相差顯微鏡下觀察到細(xì)胞凋亡的形態(tài)學(xué)改變。大蒜素干預(yù)后HeLa細(xì)胞增殖受抑，且呈濃度與時(shí)間依賴(lài)性(P均＜0.05);隨著大蒜素濃度的增加，細(xì)胞凋亡率增加，G1期細(xì)胞比例增加。結(jié)論大蒜素能阻滯HeLa細(xì)胞的周期進(jìn)展，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。

關(guān)鍵詞:宮頸腫瘤;大蒜素; HeLa細(xì)胞;細(xì)胞周期;細(xì)胞凋亡

Influence of Allicin on cell cycle and apoptosis of human cervical carcinoma HeLa cells

LIU Ling，NIEdan，ZOU Qian，ZHAN Ping，REN Qian-chuan，CHEN Jian-qiong，MAO Xi-guang(The Affiliated Hospital of Luzhoumedical College，Sichuan 646000，China)

Abstract:ObjectiveTo investigate the influence of allicin on the cell cycle progression and apoptosis of human cervical carcinoma HeLa cells.Methods The HeLa cells cultured in vitro were treated withdifferent concentrations of allicin(2.5，5，10，20，40，80 and 120 μg/mL)for 24 h，48 h and 72 h.Then，themorphologic changes were observed by inverted phase contrastmicroscope.WST-8 was used tomeasure the proliferative inhibition rate of allicin on HeLa cells，and the cell cycle progression and apoptosis rate weredetected by flow cytometry.ResultsThemorphological changes of apoptosis was observed by inverted phase contrastmicroscope.The proliferation of HeLa cells was inhibited after the intervention of Allicin，which was in adose-and time-dependentmanner(all P＜0.05).With the increasing concentration of allicin，the apoptosis rate was increased and the proportion of G0/G1cells was increased significantly.ConclusionAllicin can inhibit the HeLa cell proliferation，whichmay be related to the inducing cell apoptosis and blocking cell cycle progression.

Key words:cervical carcinoma; allicin; HeLa cells; cell cycle; apoptosis

大蒜素是從大蒜的球形鱗莖中提取的揮發(fā)性油

狀物具有抗菌、抗病毒、抗真菌及原蟲(chóng)、抗氧化、抗腫瘤、抗血小板聚集、降壓、降低膽固醇、提高機(jī)體免疫等多種生物學(xué)功能［1］。大蒜中含有廣泛的多硫化物，可在細(xì)胞內(nèi)分解產(chǎn)生烯丙基硫醇和烯丙甲基硫化物，修飾含巰基的酶類(lèi)，從而發(fā)揮大蒜素的各種治療作用，能解毒致癌物質(zhì)，抑制活性氧的產(chǎn)生，調(diào)節(jié)細(xì)胞周期和誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，在腫瘤治療中具有化學(xué)預(yù)防劑的作用［2，3］。2013年1月，我們以人宮頸癌HeLa細(xì)胞系為研究對(duì)象，用大蒜素對(duì)其進(jìn)行體外干預(yù)，探討大蒜素對(duì)細(xì)胞周期和細(xì)胞凋亡的影響。

1　材料與方法

1.1材料大蒜素(純度95%)購(gòu)自南京澤朗醫(yī)藥科技有限公司，以DMEM F-12培養(yǎng)基配制大蒜素工作液，濃度分別為2.5、5、10、20、40、80、120 μg/mL。細(xì)胞凋亡試劑盒購(gòu)自南京凱基生物科技發(fā)展有限公司，CCK-8試劑盒購(gòu)自江蘇碧云天生物技術(shù)研究所。人宮頸癌HeLa細(xì)胞株購(gòu)自重慶醫(yī)科大學(xué)病理生理學(xué)教研室(培養(yǎng)體系為DMEM F-12培養(yǎng)液，10%胎牛血清，37℃、5% CO2條件下培養(yǎng)，每天

換液1次，每2～3d傳代1次。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞用于本實(shí)驗(yàn))。

1.2細(xì)胞增殖抑制率測(cè)算接種對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期HeLa細(xì)胞至96孔培養(yǎng)板，每孔加入100 μL(約5×103個(gè)細(xì)胞)，培養(yǎng)24 h后，加入各濃度組大蒜素，陰性對(duì)照組不加藥物，空白對(duì)照組為完全培養(yǎng)基，每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔，培養(yǎng)24、48、72 h后，分別在各時(shí)間段結(jié)束前1 h每孔加入CCK-8原液10 μL，繼續(xù)培養(yǎng)1 h后上酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀測(cè)定各孔吸光度值(OD值)，計(jì)算細(xì)胞增殖抑制率。重復(fù)實(shí)驗(yàn)3次。細(xì)胞增殖抑制率(%)=(1－實(shí)驗(yàn)組OD均值/對(duì)照組OD均值)× 100%。終止培養(yǎng)前，倒置相差顯微鏡下觀察各組HeLa細(xì)胞的形態(tài)學(xué)變化。

1.3細(xì)胞凋亡率測(cè)算接種對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期HeLa細(xì)胞至6孔培養(yǎng)板，每孔加入2mL(約1×107個(gè)細(xì)胞)，培養(yǎng)24 h后，加入各濃度大蒜素，并按WST-8法設(shè)陰性對(duì)照及空白對(duì)照各1孔，繼續(xù)培養(yǎng)24 h。另一6孔板加入含10 μg/mL大蒜素的培養(yǎng)液，共3孔，分別繼續(xù)培養(yǎng)24、48、72 h。如前法設(shè)陰性對(duì)照及空白對(duì)照各1孔。然后用0.25%胰酶消化細(xì)胞，2 000 r/min離心5min，PBS漂洗，加入5 μL Annexin V-FTTC混勻，加入5 μL Propidium Lodide混勻;室溫、避光反應(yīng)5～15min，1 h內(nèi)以標(biāo)準(zhǔn)程序用流式細(xì)胞儀檢測(cè)，Annexin V-FITC(+)/PI(－)細(xì)胞判定為凋亡細(xì)胞。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.4細(xì)胞周期測(cè)算細(xì)胞的準(zhǔn)備同1.3。將制備的單細(xì)胞懸液室溫離心，以2% PBS液0.5mL重懸細(xì)胞，于冰上操作，100%乙醇1.5mL固定，4℃保存過(guò)夜。1 000 r/min離心5min，2% PBS液3mL洗滌，100 μL RNase A 37℃水浴30min，400 μL的PI染色混勻，4℃避光30min。上流式細(xì)胞儀檢測(cè)，記錄激發(fā)波長(zhǎng)488 nm處紅色熒光。使用CellQuest軟件分析數(shù)據(jù)。

1.5統(tǒng)計(jì)學(xué)方法采用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)量數(shù)據(jù)以珋x±s表示，進(jìn)行單因素方差分析和t檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2　結(jié)果

2.1大蒜素對(duì)人宮頸癌HeLa細(xì)胞增殖的影響隨著大蒜素濃度和時(shí)間的增加，細(xì)胞增殖抑制率逐漸升高，呈濃度和時(shí)間依賴(lài)性(P均＜0.05)。見(jiàn)表1。

表1　不同濃度大蒜素干預(yù)人宮頸癌HeLa細(xì)胞后不同時(shí)點(diǎn)細(xì)胞增殖抑制率(%，)

表1　不同濃度大蒜素干預(yù)人宮頸癌HeLa細(xì)胞后不同時(shí)點(diǎn)細(xì)胞增殖抑制率(%，)

注:相同時(shí)點(diǎn)不同濃度組間兩兩比較，P＜0.05;相同濃度不同時(shí)點(diǎn)兩兩比較，P＜0.05。

細(xì)胞大蒜素濃度(μg/mL)細(xì)胞增殖抑制率24 h　48 h　72 h 2.5　24.42±2.67　28.45±3.32　42.19±2.76 5 26.32±1.74　31.48±1.59　55.34±1.34 10　33.27±1.33　36.67±1.58　57.32±1.80 20　36.17±0.98　41.33±1.40　59.27±1.09 40　38.40±0.96　46.39±1.10　67.11±0.86 80　43.42±1.28　67.45±1.07　73.31±1.06 120　49.44±1.25　70.36±0.68　82.37±1.02

2.2大蒜素對(duì)HeLa細(xì)胞凋亡的影響隨著大蒜素濃度和時(shí)間增加，HeLa細(xì)胞凋亡率逐漸升高，呈明顯濃度時(shí)間依賴(lài)性(P均＜0.05)，見(jiàn)表2、表3。

2.3大蒜素對(duì)HeLa細(xì)胞周期的影響不同濃度大蒜素(分別為2.5、5、10、20、40、80、120 μg/mL)作用HeLa細(xì)胞24 h后，低于10 μg/mL大蒜素對(duì)He-La細(xì)胞周期阻滯作用不明顯;當(dāng)大蒜素濃度≥10 μg/mL時(shí)，隨著大蒜素濃度的增加，G0/G1期細(xì)胞比例增加，S期細(xì)胞比例降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05);而G2/M期的細(xì)胞數(shù)目變化不明顯，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)，見(jiàn)表2。10 μg/mL大蒜素分別干預(yù)HeLa細(xì)胞24、48、72 h，隨著作用時(shí)間的延長(zhǎng)，G0/G1期細(xì)胞比例增加，S期細(xì)胞比例減少，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05); G2/M期細(xì)胞比例變化不明顯，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)，見(jiàn)表3。

表2　不同濃度大蒜素干預(yù)24 h對(duì)HeLa細(xì)胞凋亡及細(xì)胞周期的影響(%，)

表2　不同濃度大蒜素干預(yù)24 h對(duì)HeLa細(xì)胞凋亡及細(xì)胞周期的影響(%，)

注:與0mg/mL比較，ΔP＜0.05。

大蒜素濃度(μg/mL)　　細(xì)胞凋亡率　各期細(xì)胞比例G0/G1期　G2/M期　S期0 3.29±0.38　34.20±1.21　21.79±0.85　44.01±1.53 2.5　7.02±0.12Δ　29.30±1.34　28.10±0.47　42.60±1.24 5 10.82±0.34Δ32.60±2.13　25.90±1.25　41.50±1.58 10　14.48±0.28Δ　38.10±1.62Δ8.80±1.05　53.10±1.02Δ20　18.21±0.24Δ　49.20±1.07Δ8.60±1.08　42.20±1.42Δ40　21.97±1.17Δ　56.10±1.62Δ　5.00±0.72　38.90±1.15Δ80　27.95±2.31Δ　59.80±1.20Δ　9.60±1.12　30.60±1.36Δ120　63.06±5.32Δ　66.60±3.25Δ　8.60±1.04　24.80±1.19Δ

表3　10 μg/mL大蒜素干預(yù)不同時(shí)間對(duì)HeLa細(xì)胞凋亡及細(xì)胞周期的影響(%，)

表3　10 μg/mL大蒜素干預(yù)不同時(shí)間對(duì)HeLa細(xì)胞凋亡及細(xì)胞周期的影響(%，)

注:不同時(shí)間點(diǎn)細(xì)胞凋亡率及G0/G1期、S期細(xì)胞比例比較，P ＜0.05。

作用時(shí)間　　細(xì)胞凋亡率　各期細(xì)胞比例G0/G1期　G2/M期　S期24 h　9.37±1.39　38.10±1.62　8.80±1.05　53.10±1.02 48 h　45.43±4.37　40.40±2.37　18.20±3.26　41.40±2.64 72 h　61.84±3.74　47.20±4.24　17.60±2.83　35.20±2.35

2.4細(xì)胞形態(tài)學(xué)改變不同濃度大蒜素干預(yù)后，HeLa細(xì)胞均明顯皺縮，體積縮小，細(xì)胞大小較均等，密度降低，間隙增大，細(xì)胞漂浮，胞質(zhì)及核濃縮，細(xì)胞內(nèi)顆粒逐漸增多，顏色加深。隨大蒜素作用濃度增

加及時(shí)間延長(zhǎng)細(xì)胞形態(tài)改變逐漸明顯。10 μg/mL大蒜素干預(yù)HeLa細(xì)胞2 h后，細(xì)胞形態(tài)即有明顯凋亡表現(xiàn)。而對(duì)照組細(xì)胞均貼壁生長(zhǎng)，狀態(tài)良好，細(xì)胞伸展，呈梭形或不規(guī)則多角形，細(xì)胞核較大。

3　討論

大蒜素主要依賴(lài)烯丙基和含硫基團(tuán)在細(xì)胞內(nèi)分解為二硫及三硫化合物，修飾含巰基的酶類(lèi)，從而抑制腫瘤細(xì)胞的惡性增殖［4，5］。張敏等［6］發(fā)現(xiàn)大蒜素對(duì)人宮頸癌HeLa和Caski細(xì)胞有明顯增殖抑制作用，大蒜素對(duì)Caski細(xì)胞作用更敏感。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，大蒜素呈劑量和時(shí)間依賴(lài)方式抑制人宮頸癌HeLa細(xì)胞的增殖，與其他癌細(xì)胞系報(bào)道一致［6］。本實(shí)驗(yàn)以2.5 μg/mL大蒜素作用HeLa細(xì)胞24 h，細(xì)胞增殖抑制率即為24%，說(shuō)明小劑量大蒜素短時(shí)間內(nèi)即可部分抑制HeLa細(xì)胞的增殖。此外，本研究還觀察到大蒜素作用后的HeLa細(xì)胞體積縮小，多數(shù)細(xì)胞形態(tài)由多角形變成卵圓形或圓形，胞核變小，大蒜素可能通過(guò)控制細(xì)胞體積來(lái)調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖。

細(xì)胞凋亡常參與多種疾病的發(fā)生與發(fā)展，尤其與腫瘤密切相關(guān)。研究認(rèn)為，如果可以人為地啟動(dòng)腫瘤細(xì)胞凋亡系統(tǒng)則能達(dá)到臨床治療目的。張敏等［7］研究發(fā)現(xiàn)大蒜素通過(guò)上調(diào)死亡受體4、5的表達(dá)、提高caspase-3、8的活性以增強(qiáng)TRAIL誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡，從而抑制人卵巢癌細(xì)胞SKOV-3的增殖。李民華等［8］研究顯示，大蒜素通過(guò)上調(diào)TRAIL表達(dá)，進(jìn)而活化caspase-3、8、9誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，從而實(shí)現(xiàn)對(duì)宮頸癌HeLa和Caski細(xì)胞生長(zhǎng)的抑制作用。Oommen等［9］研究發(fā)現(xiàn)，大蒜素能激活caspase-3、8、9家族，從而促進(jìn)人宮頸癌HeLa、Siha細(xì)胞(宮頸鱗癌細(xì)胞)、人大腸癌Sw480細(xì)胞凋亡。Xiao等［10］發(fā)現(xiàn)，大蒜素可激活NIH 3T3細(xì)胞caspase-3誘導(dǎo)其凋亡。本研究發(fā)現(xiàn)，大蒜素能促進(jìn)HeLa細(xì)胞的凋亡，隨著大蒜素濃度的增加，作用時(shí)間的延長(zhǎng)，HeLa細(xì)胞的凋亡率逐漸升高。2.5 μg/mL大蒜素即可致(8.54±1.53)%的HeLa細(xì)胞凋亡，明顯高于對(duì)照組的凋亡率(3.76±2.03)%，表明大蒜素對(duì)HeLa細(xì)胞的凋亡有較強(qiáng)促進(jìn)作用。因此，本研究認(rèn)為大蒜素可能通過(guò)激活某些信號(hào)傳導(dǎo)途徑，促進(jìn)宮頸癌細(xì)胞凋亡，達(dá)到抑制癌細(xì)胞無(wú)限增殖的目的。

細(xì)胞在增殖、分化和凋亡方面的異常均參與了腫瘤的發(fā)生和發(fā)展，其中細(xì)胞周期紊亂是腫瘤發(fā)生機(jī)制之一。細(xì)胞周期由G1期、S期、G2期和M期構(gòu)成。王霞等［11］研究證實(shí)，大蒜素可將黑色素瘤B16細(xì)胞阻滯于G0/G1期。張敏等［12］研究證實(shí)大蒜素可使人宮頸癌Hela細(xì)胞周期阻滯于G2/M期。本研究發(fā)現(xiàn)，大蒜素以濃度和時(shí)間依賴(lài)的方式使宮頸癌HeLa細(xì)胞G1期細(xì)胞所占比例升高，S期細(xì)胞所占比例下降，而對(duì)G2/M期細(xì)胞無(wú)影響，表明大蒜素可通過(guò)某些方式抑制細(xì)胞周期G0/G1期到S期的轉(zhuǎn)換，阻滯細(xì)胞周期的進(jìn)展，抑制細(xì)胞增殖。

大蒜素對(duì)胃癌、結(jié)腸癌、肝癌、肺癌、前列腺癌、乳腺癌、卵巢癌、胃腺癌、白血病等多種腫瘤細(xì)胞均有明顯抑制作用［12］，與化療藥物合用，能增強(qiáng)抗腫瘤藥物的殺傷作用，并在一定程度減輕化療不良反應(yīng)［13］。本研究發(fā)現(xiàn)大蒜素可阻滯細(xì)胞周期的進(jìn)展，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，抑制人宮頸癌細(xì)胞的增殖。

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收稿日期:( 2015-01-18)

通信作者簡(jiǎn)介:毛熙光(1965-)，男，教授，碩士，主要研究方向?yàn)閶D科腫瘤。E-mail:mxg6639@163.com

作者簡(jiǎn)介:第一劉玲(1981-)，女，主治醫(yī)師，碩士，主要研究方向?yàn)閶D科腫瘤、生殖內(nèi)分泌。E-mail: Eye99@163.com

基金項(xiàng)目:瀘州市科技計(jì)劃項(xiàng)目(2011-S-36);四川省科技廳項(xiàng)目(2008JY0014-1)。

文章編號(hào):1002-266X(2015)33-0015-03

文獻(xiàn)標(biāo)志碼:A

中圖分類(lèi)號(hào):R737.33

doi:10.3969/j.issn.1002-266X.2015.33.005