趙志輝，王永清，熊慶廣，畢紅賓，孫晉保，李毅(天津醫(yī)科大學(xué)第四中心臨床學(xué)院，天津300140)

利福平對結(jié)核分枝桿菌在不同植入材料界面黏附力及生物膜形成的影響

趙志輝，王永清，熊慶廣，畢紅賓，孫晉保，李毅(天津醫(yī)科大學(xué)第四中心臨床學(xué)院，天津300140)

摘要:目的通過體外實驗研究利福平對結(jié)核分枝桿菌(MTB)在不同植入材料界面黏附力及生物膜形成的影響。方法隨機選取鈷鉻鉬合金、鈦合金、聚乙烯樣品各兩塊分別置入3支離心管中，加入8mLmiddlebrook7H9液體培養(yǎng)基，再接種初始濃度為1010CFU/mL的MTB懸液2mL混勻，恒溫(37℃)下培養(yǎng)30d，從每支離心管中，隨機取出一塊材料，經(jīng)固定、干燥、噴金后，應(yīng)用掃描電子顯微鏡觀察，比較MTB對不同植入材料的黏附力，同時觀察界面生物膜形成情況。然后每支離心管中加入2mL濃度為1 μg/mL的利福平溶液，同樣條件下繼續(xù)培養(yǎng)30d。取出材料塊，經(jīng)固定、干燥、噴金后，應(yīng)用掃描電子顯微鏡觀察，了解利福平對MTB黏附力的影響及對MTB生物膜的破壞情況。結(jié)果MTB對不同植入材料界面的黏附力由強到弱依次是聚乙烯、鈷鉻鉬、鈦合金;聚乙烯界面可見生物膜形成，鈷鉻鉬合金、鈦合金界面均未見生物膜形成;利福平干預(yù)后，植入物界面黏附的菌落數(shù)顯著減少，聚乙烯界面生物膜呈不同程度破壞。結(jié)論利福平能抑制MTB對不同植入材料界面的黏附及生物膜形成。

關(guān)鍵詞:結(jié)核分枝桿菌;利福平;細菌黏附;生物膜;植入物

Effects of rifampicin on adhesion ability and biofilm formation ofmycobacterium tuberculosis onto interfaces ofdifferent implantmaterials

ZHAO Zhi-hui，WANG Yong-qing，XIONG Qing-guang，BI Hong-bin，SUN Jin-bao，LI Yi(The Fourth Center Clinical College of Tianjinmedical University，Tianjin 300140，China)

Abstract:Objective To investigate the effects of rifampicin on the adhesion ability and biofilm formation ofmycobacterium tuberculosis(MTB)in vitro.Methods We each selected two samples of cobalt chromiummolybdenum alloy，titanium alloy and polyethylene and put them into 3 centrifuge tubes，respectively.Then，8mL ofmiddlebrook7H9 culturemedium and 2mL initial concentration of 1010cfu/mL of reinoculation ofmTB suspension liquid weremixed in centrifuge tubes and cultured under the constant temperature(37℃)for 30days.We randomly took out one sample from each centrifuge tube and used scanning electronmicroscope for observation after fixing，drying and spraying gold on it.Then，we compared the bioadhesion ability ofmTB ondifferent implantmaterials and at the same time we observed interface biofilm formation.After that，adding 2mL concentration of 1μg/mL of rifampicin solution into each centrifuge tube.Thirtydays of culturing under the same condition was performed and we took out the sample.After the same procedure with former samples they were observed by scanning electronmicroscope，we gained a better understanding of the effect of rifampicin on themTB adhesion force and thedamage tomTB biofilm.Results The adhesion ability to polyethylene was higher than those of titanium alloy and cobalt chromiummolybdenum alloy，and the adhesion ability with cobalt chromiummolybdenum alloy was higher than that of titanium alloy.No biofilm forms on the interface of cobalt chromiummolybdenum alloy and titanium alloy while it was available on the interface of polyethylene.After the rifampicin intervention，the number of colonies on the interface of implant reduced significantly，and the biofilm on the interface of polyethylene wasdestroyed to some extent.Conclusion Rifampicin can inhibit adhesion ability and biofilm formation ofmTB.

Key words:mycobacterium tuberculosis; rifampicin; bacterial adhesion; biofilms; implants

骨與關(guān)節(jié)結(jié)核是常見的肺外結(jié)核，其中脊柱結(jié)核約占50%［1］，髖膝關(guān)節(jié)結(jié)核占25%～35%［2］，骨關(guān)節(jié)結(jié)核發(fā)病率逐年上升［3～5］。骨結(jié)核引起的疼痛、骨質(zhì)破壞、功能受限、截癱等嚴重影響患者日常生活，給骨結(jié)核的治療帶來嚴峻挑戰(zhàn)。外科手術(shù)是解除患者痛苦、重建功能、提高生活質(zhì)量的可靠方法。1975年，Mironski等［6］報道一期病灶清除置入植入物治療骨結(jié)核，但國內(nèi)外學(xué)者將其視為活動性骨結(jié)核的禁忌。近年來，部分學(xué)者嘗試一期病灶清除置入植入物治療活動性骨結(jié)核，取得一定療效［7～10］，但仍擔(dān)心術(shù)后復(fù)發(fā)問題，其焦點主要集中于細菌生物膜。細菌黏附假體并形成生物膜，是假體周圍感染持續(xù)不愈的重要原因［11］。研究［12，13］表明，結(jié)核分枝桿菌(MTB)對不同材料的黏附力不同，能在“液體－空氣”界面形成生物膜［14］，但有關(guān)MTB黏附生物材料界面形成生物膜的情況尚未見報道，因此研究MTB對不同植入物材料的黏附性及生物膜形成情況對一期病灶清除置入植入物治療活動性骨結(jié)核的安全性有重要意義。本研究采用液體培養(yǎng)基模擬MTB黏附植入物、形成生物膜的過程，并加入抗結(jié)核藥利福平干預(yù)，通過掃描電子顯微鏡觀察MTB在植入物界面的黏附及生物膜形成情況。現(xiàn)將結(jié)果報告如下。

1　材料與方法

1.1材料MTB標(biāo)準(zhǔn)株H37Rv由天津市疾控中心提供。生物安全柜、CO2恒溫培養(yǎng)箱購自美國NUAIRE公司; CPD-030 CO2臨界點干燥儀、SCD-005噴涂刻蝕儀購自瑞士BAL-TEC公司。FEI Quanta 200掃描電子顯微鏡(SEM)購自荷蘭FEI公司。Middlebrook7H9液體培養(yǎng)基，利福平、戊二醛購自Sigma公司，四氧化鋨購自SPI公司，乙酸異戊酯購自天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司，磷酸緩沖液試劑、乙醇為國產(chǎn)分析醇; 50mL離心管購自Corning公司;鈦合金、鈷鉻鉬合金、聚乙烯材料由天津市金興達有限公司提供，加工制成直徑0.8 cm、厚0.2 cm圓片，經(jīng)蒸餾水、洗滌界面污漬后高溫高壓消毒，備用。

1.2細菌懸液的準(zhǔn)備選取生長良好的MTB標(biāo)準(zhǔn)株，用生理鹽水稀釋，振蕩搖勻，配制成濃度約1011CFU/mL的菌液，以1∶10的比例將MTB菌液注入Middlebrook7H9液體培養(yǎng)基中，制成初始濃度為1010CFU/mL的細菌懸液備用。

1.3不同植入物界面MTB黏附力及生物膜形成觀察隨機選取鈷鉻鉬合金、鈦合金、聚乙烯樣品各兩塊分別置入3支離心管中，加入8mLmiddlebrook7H9液體培養(yǎng)基，再接種上述MTB懸液2mL混勻，恒溫(37℃)下培養(yǎng)30d，從每支離心管中，隨機取出1塊，然后在每支離心管中加入2mL濃度為1mg/mL的利福平溶液，同樣條件下繼續(xù)培養(yǎng)30d，實驗重復(fù)10次。上述材料塊無菌磷酸緩沖液(PBS)漂洗3次后，依次經(jīng)3%戊二醛固定，1%四氧化鋨固定，30%～100%乙醇梯度脫水，乙酸異戊酯置換，CO2臨界點干燥，金離子濺射法鍍膜處理，SEM觀察MTB對植入物界面黏附及生物膜形成情況。放大500倍條件下，每塊材料表面隨機選取10個10 μm× 10 μm的視野，對黏附菌落進行計數(shù)。

1.4統(tǒng)計學(xué)方法采用SPSS17.0統(tǒng)計軟件。計量數(shù)據(jù)以珋x±s表示，利福平干預(yù)前不同植入物界面黏附的菌落數(shù)比較，行單因素方差分析和t檢驗。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2　結(jié)果

2.1植入物界面掃描電鏡觀察500倍視野下，聚乙烯界面可見MTB黏附，形成似“雪花狀”的菌落，且部分菌落間已相互融合(A);放大至5 000倍，可見大量MTB聚集，成為立體的、復(fù)雜的膜樣結(jié)構(gòu)，MTB周圍可見“膜狀”黏液樣物質(zhì)，將細菌間連接起來(B)，對“膜下”的細菌起保護作用;在500倍視野下，鈦合金和鈷鉻鉬合金界面可見MTB黏附，并形成菌落，但菌落間未見融合現(xiàn)象(E、I);放大至15 000倍，鈦合金和鈷鉻鉬合金界面未見生物膜形成，MTB呈單個樣黏附，彼此之間不發(fā)生聚集、粘連，有的已干癟、裂解死亡(F、J)。利福平干預(yù)后，500倍視野下植入物界面黏附菌落數(shù)減少，甚至未黏附菌落(C、G、K);放大至5 000倍，MTB出現(xiàn)干癟、裂解(H)，聚乙烯界面形成的生物膜有不同程度的破壞(D)。

2.2mTB在植入物界面黏附力比較利福平干預(yù)前，聚乙烯界面黏附的菌落數(shù)多于鈷鉻鉬界面(P＜0.05);聚乙烯界面黏附的菌落數(shù)多于鈦合金界面(P＜0.05);鈷鉻鉬界面黏附的菌落數(shù)與鈦合金界面比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05);利福平干預(yù)后，三種植入物界面黏附菌落數(shù)顯著減少，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(表1)。

3　討論

圖1　植入物界面掃描電鏡觀察(×圖500)

表1　利福平干預(yù)前后植入物界面黏附菌落數(shù)比較(個/視野，)

表1　利福平干預(yù)前后植入物界面黏附菌落數(shù)比較(個/視野，)

材料　菌落數(shù)量干預(yù)前　　干預(yù)后tP聚乙烯6.08±1.58　2.77±1.70　4.46　?。?.05鈷鉻鉬　2.16±1.24　0.93±0.56　2.85　　＜0.05鈦合金1.57±0.52　0.55±0.41　4.86　?。?.05

生物膜的形成分為細菌黏附、播散、胞外多聚物覆蓋3個步驟。植入物置入后，立即被組織液、血液、蛋白質(zhì)分子等包被，可逆性黏附植入物界面形成條件膜，之后細菌在范德華力、表面張力、靜電作用等非特異性因素作用下，附著于條件膜［15］，這種附著易受體液的沖刷、機體免疫反應(yīng)等作用被遷移。隨后，特異性黏附分子開始介導(dǎo)這一過程，細菌表面特定的黏附素蛋白識別宿主界面相應(yīng)受體［16］，牢靠黏附植入物界面。生物膜擴散、胞外多聚物覆蓋同時進行，細菌黏附植入物界面相互聚集形成微菌落;細菌為適應(yīng)環(huán)境，克隆、分泌大量多糖蛋白質(zhì)復(fù)合物，形成復(fù)雜致密的生物膜結(jié)構(gòu)，即成熟生物膜。

以往研究［12，13］表明，MTB對不同植入物的黏附力不同，但就其是否在植入物界面形成生物膜存在一定爭議，而且這些研究均是將植入物置于固態(tài)或半固態(tài)培養(yǎng)基培養(yǎng)，MTB與植入物直接接觸，與體內(nèi)環(huán)境相比，存在一定的缺陷。本研究則采用液體培養(yǎng)基模擬MTB體內(nèi)黏附植入物形成生物膜的過程，觀察抗結(jié)核藥干預(yù)前后MTB對不同植入物的黏附力及生物膜形成，期許闡明活動性骨結(jié)核一期置入植入物的安全性原因。

諸多學(xué)者對MTB在植入物界面的黏附力進行了探討，各種不斷改進的研究方法均證實MTB對不同植入物界面的黏附力不同，且大部分學(xué)者認為MTB對植入物的低黏附力是一期病灶清除內(nèi)固定治療脊柱結(jié)核安全的關(guān)鍵因素［17］。因此，本實驗在沿用這些成熟方法的同時，在MTB培養(yǎng)30d后，加入利福平干預(yù)，探討其對MTB黏附力和生物膜形成的影響。結(jié)果表明，MTB對聚乙烯、鈷鉻鉬合金、鈦合金的黏附力依次減弱，與以往同類研究［17］接近，筆者認為其可能與植入物界面的化學(xué)組成、自由能、表面電荷等有關(guān);亦有研究者認為是植入物界面的凹陷增加了細菌與植入物界面間的局部摩擦力，同時亦增加了植入物界面局部的表面張力，使細菌更易黏附于凹陷處［12］;凹陷的存在亦為MTB的黏附提供了一定的“優(yōu)勢”部位，一定程度上可防止細菌被流體物質(zhì)沖刷，因此本研究不排除是植入物材料性質(zhì)和植入物的界面狀態(tài)綜合作用的結(jié)果。該研究結(jié)果進一步證實，MTB對骨科植入材料的低黏附力是活動性骨結(jié)核一期置入植入物安全的重要原因。

目前，就MTB是否在骨科植入物界面形成生物膜意見尚不統(tǒng)一。綜合分析國內(nèi)外文獻與前期基礎(chǔ)研究［18］，筆者認為MTB在骨科植入物界面能形成生物膜。掃描電子顯微鏡觀察結(jié)果表明，MTB能在聚乙烯界面見生物膜形成，在鈦合金、鈷鉻鉬界面不形成生物膜，推測可能與植入物的生物相容性有關(guān)，植入物腐蝕釋放的離子對MTB有毒性作用，這種毒性刺激MTB，使其以極其精確、協(xié)調(diào)的步驟啟動或關(guān)閉特定的基因表達，克隆、分泌大量多糖-蛋白質(zhì)復(fù)合物，并形成生物膜［19］。既往研究證明細菌黏附是生物膜的前提，是細菌表面特定的黏附素蛋白識別宿主表面受體的結(jié)果［16］，因此MTB在植入物界面生物膜的形成具有選擇性和特異性。本研究結(jié)果能為MTB在植入物界面生物膜形成的基礎(chǔ)研究提供方向。

近年來，骨結(jié)核術(shù)后復(fù)發(fā)有增加趨勢，其主要原因可能是病灶殘留MTB死灰復(fù)燃的結(jié)果。由于病灶周圍血供減小、硬化骨的存在，病灶殘留MTB黏附植入物，形成生物膜的機會明顯增加，且容易耐藥，這對骨結(jié)核的治療是災(zāi)難性的;全身抗結(jié)核治療往往不夠，常需聯(lián)合局部抗結(jié)核治療，才能達到理想的殺菌或抑菌濃度。本實驗結(jié)果表明，利福平干預(yù)后，植入物界面黏附的菌落數(shù)顯著減少，差異有統(tǒng)計學(xué)意義，且聚乙烯界面的生物膜有不同程度的破壞，表明利福平能抑制MTB的黏附及生物膜形成，因此植入物的存在不影響抗結(jié)核藥物對MTB的殺滅效果，局部抗結(jié)核治療在活動性骨結(jié)核一期置入植入物中具有重要作用。

研究［20］證實利福平可抑制表皮葡萄球菌生物膜的形成。本研究發(fā)現(xiàn)，利福平干預(yù)后，部分MTB出現(xiàn)干癟、裂解，細菌的堆積變得更松散，生物膜有不同程度的破壞，表明利福平能破壞生物膜。藥物攻擊結(jié)核生物膜表層菌并在膜上產(chǎn)生裂隙，使更多的藥物滲入生物膜深層，從而提高藥物的抗菌作用，但這僅僅是基于形態(tài)上的猜測，還有待進一步證實。

現(xiàn)今，常用的骨科植入物主要由鈷鉻鉬、鈦合金、聚乙烯、陶瓷、骨水泥等材料制成，對結(jié)核病灶置入的植入物無統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn)，但均傾向于選擇生物相容性好、穩(wěn)定性好的材料。研究證實，細菌對生物材料的黏附性及生物膜形成受植入物材料的影響;植入物溶解或磨損時產(chǎn)生的離子或碎屑導(dǎo)致局部不良的軟組織反應(yīng)和破壞［21］，調(diào)節(jié)免疫系統(tǒng)和細菌生長［22］，為殘留結(jié)核桿菌的死灰復(fù)燃和繁殖創(chuàng)造條件。王永清等［10］認為植入物生物相容性越好，細菌的黏附性越差，形成生物膜的概率越小;因此，骨結(jié)核病灶置入植入物時，應(yīng)選擇生物相容性好，MTB對其黏附性差，不形成生物膜的植入材料。本研究表明MTB對鈦合金、鈷鉻鉬材料的黏附性差，且不形成生物膜，是用于骨結(jié)核病灶置入材料的可靠選擇;雖然聚乙烯界面有生物膜形成，但利福平能夠破壞其生物膜，故亦可安全置入病灶內(nèi)。

本研究尚存在一定的局限性，未設(shè)置對照組，無法與其他細菌進行比較，因此我們無法給出MTB與普通細菌黏附力強弱的比較。

綜上所述，MTB對鈦合金、鈷鉻鉬材料的黏附性差，且不形成生物膜，是用于骨結(jié)核病灶置入材料的可靠選擇;利福平能抑制MTB的黏附及生物膜形成，認為在選擇性應(yīng)用植入物和局部抗結(jié)核的前提下，活動性骨結(jié)核一期置入植入物安全可行，植入物的存在不會增加骨結(jié)核術(shù)后復(fù)發(fā)風(fēng)險。

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·基礎(chǔ)研究·

收稿日期:( 2015-04-14)

通信作者簡介:王永清(1962-)，主任醫(yī)師，博士，主要研究方向為骨與關(guān)節(jié)疾病。E-mail: 13820789626@139.com

作者簡介:第一趙志輝(1981-)，主治醫(yī)師，碩士研究生在讀，主要研究方向為骨與關(guān)節(jié)疾病。E-mail: zhaozhihui0929@126.com

基金項目:天津市衛(wèi)生局科技基金面上項目(2013KY05)。

文章編號:1002-266X(2015)33-0021-04

文獻標(biāo)志碼:A

中圖分類號:R52

doi:10.3969/j.issn.1002-266X.2015.33.007