姚允泰，龔志毅，李力兵，李立環(huán)( 中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院，北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院，國家心血管病中心，阜外心血管病醫(yī)院，心血管疾病國家重點實驗室，北京0007;北京協(xié)和醫(yī)院;解放軍總醫(yī)院)

不同七氟醚缺血處理方式對大鼠離體心臟缺血再灌注損傷的作用及其對基因表達(dá)譜的影響

姚允泰1，龔志毅2，李力兵3，李立環(huán)1
( 1中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院，北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院，國家心血管病中心，阜外心血管病醫(yī)院，心血管疾病國家重點實驗室，北京100037;2北京協(xié)和醫(yī)院;3解放軍總醫(yī)院)

摘要:目的比較七氟醚缺血預(yù)處理( SpreC)、七氟醚缺血后處理( SpostC)及SpreC + SpostC對大鼠離體心臟缺血再灌注損傷( MIRI)的保護作用及其對心肌基因表達(dá)譜的影響。方法自主跳動的40只大鼠離體心臟經(jīng)10 min平衡期灌注后，隨機分為4組:對照( CTRL)組、SpreC組、SpostC組和SpreC + SpostC組。觀察各組平衡期、缺血前及復(fù)灌15、60、120 min的血流動力學(xué)指標(biāo)變化;各組缺血后復(fù)灌15 min，檢測左室心肌煙酰胺腺嘌呤二核苷酸( NAD+)水平;平衡期和復(fù)灌120 min取各組冠狀動脈流出液，檢測乳酸脫氫酶( LDH)和磷酸肌酸激酶( CK-MB)水平;復(fù)灌120 min時測定心肌梗死面積及左室心肌取材行全基因芯片表達(dá)譜分析。結(jié)果與CTRL組比較，SpreC組、SpostC組和SpreC + SpostC組心臟功能改善、梗死面積減小、LDH及CK-MB水平降低( P均＜0.05)，且SpreC + SpostC的心肌保護效果優(yōu)于單純SpreC或SpostC( P均＜0.05)。SpreC組、SpostC組和SpreC + SpostC組心臟NAD+水平均高于CTRL組( P均＜0.05)，且SpreC + SpostC組高于SpreC或SpostC組( P均＜0.05)。基因譜分析顯示，僅有少數(shù)基因同時受SpreC、SpostC和SpreC + SpostC同向調(diào)節(jié)。結(jié)論SpreC和SpostC能為大鼠離體心臟的MIRI提供程度相近的保護作用，二者聯(lián)合應(yīng)用效果更佳。不同七氟醚缺血處理方式對MIRI后心肌基因表達(dá)譜的影響不同。

關(guān)鍵詞:再灌注損傷;七氟醚;線粒體通透性轉(zhuǎn)換孔;基因芯片;大鼠

Effects of different modalities of sevoflurane conditioning on isolated rat hearts subjected to ischemia-reperfusion injury and the influence on gene expression profiles

YAO Yun-tai1，GONG Zhi-yi，LI Li-bing，LI Li-huan
( 1 Chinese Academy of Medical Sciences，Peking Union Medical College，State Key Laboratory of Cardiovascular Diseases，F(xiàn)uwai Hospital，National Center for Cardiovascular Diseases，Beijing 100037，China)

Abstract:Objective To compare the cardioprotective effects of sevoflurane preconditioning ( SpreC)，sevoflurane postconditioning ( SpostC) and sevoflurane preconditioning plus postconditioning ( SpreC + SpostC) on the isolated rat hearts with myocardial ischemia-reperfusion injury ( MIRI)，and the influence on the myocardial gene expression profiles.Methods After 10 min of equilibration，the isolated rat hearts were randomly divided into four groups: the control group ( CTRL group)，SpreC group，SpostC group，and SpreC + SpostC group.Hemodynamics were compared within and between groups at baseline，before ischemia，at 15 min，60 min and 120 min upon reperfusion.The left ventricular myocardial nicotinamide adenine dinucleotide ( NAD+) were compared after 15 min of reperfusion.The coronary arteries ( coronary) effluent of each group were taken at equilibrium and 120 min of reperfusion to detect the levels of lactate dehydrogenase ( LDH) and creatine phosphate kinase ( CK-MB).Infarct size was determined at the end of 120 min of reperfusion.Left ventricular myocardium was collected at 15 min upon reperfusion to characterize the gene expression profiles.Results

Compared with the CTRL group，hearts in the SpreC，SpostC and SpreC + SpostC groups showed significantly better functional recovery，reduced myocardial infarct size，decreased LDH and CK-MB release ( all P＜0.05)，and the myocardial protective effect of the SpreC + SpostC group was better than that of SpreC or SpostC group ( all P＜0.05).Myocardial NAD+contents in the SpreC，SpostC，SpreC + SpostC groups were higher than that in the CTRL group ( all P＜0.05)，and SpreC + SpostC group was higher than either SpreC or SpostC group ( all P＜0.05).Microarray genome analysis dem-

onstrated that few genes were jointly regulated by SpreC，SpostC and SpreC + SpostC.Conclusions SpreC and SpostC were equally effective in protecting against MIRI.The combination of SpreC and SpostC offered additive protection.However，three sevoflurane treatment strategies had different influence on the myocardial gene expression profiles.

Key words:reperfusion injury; sevoflurane; mitochondrial permeability transition pore; microarray; rats

七氟醚是臨床常用的揮發(fā)性麻醉藥，有研究發(fā)現(xiàn)，七氟醚缺血預(yù)處理( SpreC)和七氟醚缺血后處理( SpostC)對心肌缺血再灌注損傷( MIRI)的保護作用效果相當(dāng)［1～3］。但二者聯(lián)合應(yīng)用是否具有協(xié)同作用，目前的研究結(jié)論并不一致［1，3］。線粒體通透性轉(zhuǎn)換孔( mPTP)是眾多信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的集合點，被認(rèn)為是MIRI信號通路中最重要的終末效應(yīng)器［4］。2008年6月～2009年6月，我們比較了SpreC、SpostC、SpreC + SpostC對大鼠離體心臟MIRI的保護作用及mPTP的變化，并借助DNA微陣列技術(shù)初步探究不同七氟醚缺血處理方式對MIRI后心肌基因表達(dá)的影響。

1　材料與方法

1.1材料成年雄性SD大鼠40只，體質(zhì)量200～250 g，購自北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司。壓力換能器(美國BD公司) ; Biopac 5100生物信號采集系統(tǒng)、AcqKnowledge4.0軟件(美國BIOPAC公司) ; Vapor2000七氟醚揮發(fā)罐(德國Drger公司) ; Hitachi7600自動生化分析儀(日本Hitachi公司) ; Beckman-DU640分光光度計(德國Beckman-Coulter公司) ; NanoDrop ND-1000分光光度計(美國Nano-Drop公司) ; DNA Microarray Scanner G2505B掃描儀、Agilent Feature Extraction 10.5.1.1軟件(美國Agilent公司) ; GeneSpring6.0軟件(美國Silicon Genetics公司) ; Rotor-Gene 3000 Realtime PCR儀(澳大利亞Corbett Research公司)。2，3，5-氯三苯四唑及乳酸脫氫酶( LDH)、肌酸激酶( CK-MB)試劑盒(德國Roche公司) ; TRIzol試劑盒(加拿大Invitrogen公司) ; RNeasy試劑盒(加拿大QIAGEN公司) ; Agilent芯片( Agilent 4×44 K Whole Rat Genome Oligo Microarray G4131A) (美國Agilent公司)。

1.2七氟醚缺血處理方法所有大鼠經(jīng)腹腔注射苯巴比妥鈉( 40 mg/kg)麻醉及肝素化( 1 000 IU/kg)，參照文獻［5］建立改良非循環(huán)式Langendorff系統(tǒng)。自主跳動的離體心臟經(jīng)10 min平衡期灌注后，隨機分為4組、每組10只。對照( CTRL)組繼續(xù)灌注K-H緩沖液25 min后，接受30 min全心缺血和120 min復(fù)灌; SpreC組:缺血前給予3%七氟醚飽和的K-H緩沖液灌注心臟15 min行預(yù)處理，后以未經(jīng)

七氟醚飽和的K-H緩沖液灌注心臟實施洗出10 min，其余處理同CRTL組; SpostC組:缺血后復(fù)灌最初15 min給予3%七氟醚飽和的K-H緩沖液灌注心臟行后處理(后改用未經(jīng)七氟醚飽和的K-H緩沖液繼續(xù)灌注心臟)，其余處理同CRTL組; SpreC + SpostC組:聯(lián)合使用SpreC組、SpostC組方案。K-H緩沖液以七氟醚通過揮發(fā)罐預(yù)先飽和。

1.3血流動力學(xué)指標(biāo)檢測在平衡期、缺血前及復(fù)灌15、60、120 min，通過Biopac 5100生物信號采集系統(tǒng)及相關(guān)軟件，以1 000 Hz的頻率在竇性節(jié)律時采集各組左室發(fā)展壓力( LVDP)、左室舒張末期壓力( LVEDP)、左室最大收縮及舒張速率( + dp/dt、－dp/dt)、心率( HR)及冠狀動脈(冠脈)流量( CF)等信號，取2 s內(nèi)的平均值。

1.4心肌損傷指標(biāo)檢測缺血后復(fù)灌15 min，各組隨機各取離體左室心肌組織5份，參照文獻［5］測定心肌中煙酰胺腺嘌呤二核苷酸( NAD+)水平。各組在平衡期和復(fù)灌120 min收集離體心臟冠脈流出液1 mL，檢測LDH、CK-MB水平。復(fù)灌120 min后，各組隨機各取5個離體心臟，參照文獻［5］測定心肌梗死面積。

1.5基因表達(dá)譜分析復(fù)灌120 min時，各組隨機各取離體左室心肌組織3份，立刻置入液氮保存，隨后轉(zhuǎn)入－80℃，集齊所有標(biāo)本后行基因表達(dá)譜分析。經(jīng)單因素方差分析，校正后強度比值≥1.5倍的基因視為差異表達(dá)基因，并對其進行后續(xù)分析。為驗證基因芯片結(jié)果的可靠性，從3個七氟醚處理組中各選取1個相對于CTRL組差異表達(dá)的目的基因，以管家基因GAPDH作為內(nèi)參，進行實時定量PCR測定，并比對PCR和芯片測定的結(jié)果(變化方向及倍數(shù))。每個基因的PCR反應(yīng)均重復(fù)3次，PCR反應(yīng)產(chǎn)物行1.5%瓊脂糖凝膠電泳。

1.6統(tǒng)計學(xué)方法采用SPSS13.0統(tǒng)計軟件。計量資料以珋x±s表示，結(jié)果比較采用重復(fù)測量方差分析、單因素方差分析，兩兩比較采用LSD-t檢驗。P ＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2　結(jié)果

2.1各組不同時間血流動力學(xué)指標(biāo)比較見表1。

2.2各組心肌組織NAD+水平、心肌梗死面積及冠脈流出液LDH、CK-MB水平比較見表2。

表1　各組不同時間血流動力學(xué)指標(biāo)比較( n =10，珔x±s)

表2　各組心肌組織NAD+水平、心肌梗死面積及冠狀動脈流出液LDH、CK-MB水平比較( n =5，珔x±s)

2.3基因芯片分析結(jié)果SpreC組、SpostC組及SpreC + SpostC組較CTRL組上調(diào)的基因數(shù)分別為21、289及160個，下調(diào)的基因數(shù)分別為19、310及219個。SpreC組上調(diào)及下調(diào)倍數(shù)最大的基因分別為TC607319(上調(diào)2.21倍)及Akr1b8(下調(diào)3.29 倍) ; SpostC組上調(diào)及下調(diào)倍數(shù)最大的基因分別為BF549419(上調(diào)5.12倍)及Akr1b8(下調(diào)5.62倍) ; SpreC + SpostC組上調(diào)及下調(diào)倍數(shù)最大的基因分別為Dhx36_predicted(上調(diào)3.65倍)及BF286392(下調(diào)5.92倍)。僅有少數(shù)基因同時受SpreC、SpostC 和SpreC + SpostC同向調(diào)節(jié)。SpreC組較SpostC組上調(diào)及下調(diào)的基因數(shù)分別為260、232個，上調(diào)和下調(diào)倍數(shù)最大的基因分別為Ucp3(上調(diào)9.05倍)和Ric8a(下調(diào)5.53倍)。SpreC + SpostC組較SpreC組上調(diào)及下調(diào)的基因數(shù)分別為164、193個，而較SpostC組上調(diào)及下調(diào)的基因數(shù)分別為34、42個:其中，SpreC + SpostC組較SpreC組上調(diào)及下調(diào)倍數(shù)最大的基因分別為Ric8a(上調(diào)5.53倍)及BF286392 (下調(diào)5.41倍) ; SpreC + SpostC組較SpostC組上調(diào)及下調(diào)倍數(shù)最大的基因分別為Ucp3(上調(diào)5.41倍) 及TC607319(下調(diào)3.59倍)。

3　討論

七氟醚是臨床常用的揮發(fā)性麻醉藥。臨床研究已經(jīng)證實，七氟醚對接受冠脈搭橋患者的心肌保護效果優(yōu)于靜脈麻醉藥異丙酚。不少研究也認(rèn)為，SpreC和SpostC對MIRI均有保護作用［1，3，6，7］。然而，目前關(guān)于“聯(lián)合應(yīng)用上述兩種抗MIRI手段是否能實現(xiàn)1 + 1＞1的心肌保護效果”的命題仍無定論。Deyhimy等［3］以Langendorff大鼠心臟的全心MIRI為實驗?zāi)Ｐ停⒁?.5%的七氟醚分別行缺血預(yù)處理、缺血后處理及聯(lián)合處理，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與SpreC或SpostC比較，SpreC + SpostC能提供更好的心肌保護作用，即“1 +1＞1”。而Obal等［1］研究結(jié)果顯示，聯(lián)合應(yīng)用2%七氟醚缺血預(yù)處理和缺血后處理并未為在體大鼠的局部MIRI提供“1 + 1＞1”的心肌保護作用。

本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與SpreC或SpostC比較，SpreC + SpostC能顯著改善大鼠心功能、減輕心肌結(jié)構(gòu)性損傷、降低心肌酶水平。說明SpreC和SpostC心肌保護作用可以疊加。有研究結(jié)果顯示，麻醉藥缺血預(yù)處理和麻醉藥缺血后處理的保護機制存在相似之處，如均有mPTP參與［6，7］。線粒體內(nèi)擁有組織中90%以上NAD+［8，9］，心肌缺血后復(fù)灌時，NAD+通過開放的mPTP從失活的及功能不全的線粒體被灌注液沖洗掉，故心肌組織中NAD+水平的高低能反映mPTP的開放程度，NAD+水平越低，mPTP的開放程度越大，心肌損傷程度越重［8，9］。本研究結(jié)果顯示，SpreC + SpostC組心臟組織NAD+水平高于SpreC、SpostC組，提示SpreC和SpostC對mPTP開放的抑制作用在SpreC + SpostC呈現(xiàn)疊加效應(yīng)。此外，本研究還比較了不同七氟醚缺血處理方式對大鼠MIRI后基因表達(dá)的影響，結(jié)果顯示，僅見少數(shù)基因同時受SpreC、SpostC和SpreC + SpostC同向調(diào)節(jié)。提示盡管SpreC和SpostC均可提供短期內(nèi)程度相當(dāng)?shù)目筂IRI作用，但二者對MIRI后基因表達(dá)的影響存在較大差異。

綜上所述，SpreC和SpostC能提供相似的抗MIRI保護作用，二者聯(lián)合應(yīng)用效果更佳。但不同七氟醚缺血處理方式對心肌基因表達(dá)譜的影響不同。

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·基礎(chǔ)研究·

收稿日期:( 2015-03-14)

作者簡介:第一姚允泰( 1978-)，男，副主任醫(yī)師，主要研究方向為缺血再灌注損傷、器官保護。E-mail: yuntaiyao@126.com

基金項目:國家自然科學(xué)基金資助項目( 81200109) ;高校博士點新教師基金資助項目( 20121106120008)。

文章編號:1002-266X( 2015)29-0017-04

文獻標(biāo)志碼:A

中圖分類號:R541.4; R614.2

doi:10.3969/j.issn.1002-266X.2015.29.006