呂嘉櫪， 閆亞梅， 王霄鵬， 李文娟， 杜　冰

(陜西科技大學(xué) 食品與生物工程學(xué)院, 陜西 西安　710021)

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10株益生菌益生特性的比較研究

呂嘉櫪， 閆亞梅， 王霄鵬， 李文娟， 杜冰

(陜西科技大學(xué) 食品與生物工程學(xué)院, 陜西 西安710021)

摘要：選用10株益生菌對其耐膽鹽、降膽固醇和降甘油三酯的益生特性進(jìn)行了比較研究，并選用蔬菜培養(yǎng)基測定發(fā)酵過程中10株益生菌的活菌數(shù)變化，篩選出增菌效果明顯的7株益生菌，研究發(fā)酵過程中的總酸、SOD酶和亞硝酸鹽含量變化.結(jié)果表明：在膽鹽濃度為0.3%時，LC、LP和LGG的存活率均大于30%,LB、LC、LGG、LP、LCP和EF對膽固醇的降解能力依次為45.63%、48.13%、30.63%、23.16%、20.63%、16.88%，LB、LC、LR、Bb-12和EF對甘油三酯的降解能力依次為23.06%、16.72%、44.60%、31.08%、22.90%；ST、Bb-12和EF的活菌數(shù)在107cfu/mL以下，其余7株的活菌數(shù)都達(dá)到108cfu/mL；分別接入7株益生菌發(fā)酵24 h時酸度在0.4%～0.8%之間，LCP和LA在發(fā)酵過程中產(chǎn)生SOD酶，活力達(dá)到189.09 U/mL，添加LB、LP、LC、LA和LGG亞硝峰消失，發(fā)酵48 h后亞硝酸鹽的含量低于0.2 mg/kg.

關(guān)鍵詞：益生菌； 益生特性； 蔬菜； SOD酶

0引言

益生菌是指當(dāng)攝入一定數(shù)量后，能以活菌狀態(tài)到達(dá)胃腸道的單一或特定微生物的混合物，它作為促進(jìn)機(jī)體健康的有益菌[1-3]，具有促進(jìn)營養(yǎng)物質(zhì)的消化吸收、降低膽固醇、抑制癌細(xì)胞生長等功能[4-6].

目前國內(nèi)外學(xué)者對益生菌益生特性的研究顯得非常活躍.陳路清、李青青等[7]測定了實(shí)驗(yàn)室保藏9株食品級雙歧桿菌體外降膽固醇的能力以及耐酸、耐膽鹽和細(xì)胞粘附的益生特性[8]；郭志華、楊洪[9]選取從藏靈菇中分離的2株乳酸菌研究了其耐熱、耐膽鹽等益生特性.

林曉姿、梁璋成等[10]以自選植物乳桿菌R23和干酪乳桿菌R35為目標(biāo)菌，以德氏乳桿菌保加利亞亞種6045為對照菌，考察各菌對模擬胃液酸度和腸道膽鹽的抗逆性以及凝集能力、表面疏水性等黏附性能，評價其發(fā)酵液對超氧陰離子和羥基自由基的清除能力等體外抗氧化功能.然而，關(guān)于益生菌降解甘油三酯的能力以及產(chǎn)SOD酶的能力的研究比較少，同時益生菌的益生特性研究不是很全面.

本論文選用10株益生菌對其耐膽鹽、降膽固醇和降甘油三酯的益生特性進(jìn)行了比較研究，并選用蔬菜培養(yǎng)基研究了發(fā)酵過程中10株益生菌的活菌數(shù)變化，篩選出增菌效果明顯的7株益生菌，研究了它們在發(fā)酵過程中蔬菜培養(yǎng)基的總酸、SOD酶和亞硝酸鹽含量變化.為益生菌益生特性的研究以及功能性食品的開發(fā)提供理論依據(jù).

1材料與方法

1.1　原材料與試劑

1.1.1原材料

黃瓜，胡蘿卜，山藥，白蘿卜，蓮花白，小白菜，小青菜，油麥菜，芹菜，湖北莊農(nóng)貿(mào)市場提供.

1.1.2菌種

保加利亞乳桿菌(Lactobacillusbulgaricus簡稱LB)，嗜酸乳桿菌(Lactobacillusacidophilus簡稱LA)，植物乳桿菌(LactobacillusPlantarum簡稱LP)，乳雙歧桿菌(Bifidobacteriumanimalissubsp.lactisBb-12簡稱Bb-12)，鼠李糖乳桿菌(Lactobacillusrhamnosus簡稱LGG)，副干酪乳桿菌(Lactobacillusparacasei簡稱LCP)，糞鏈球菌(Enterococcusfaecalis簡稱EF)，嗜熱鏈球菌(Streptococcusthermophilus簡稱ST)，干酪乳桿菌(Lactobacilluscasei簡稱LC)，羅伊氏乳桿菌(Lactobacillusreuteri簡稱LR)，由陜西科技大學(xué)食品與生物工程學(xué)院微生物研究室提供.

1.1.3試劑

N-1-萘乙二胺鹽酸鹽(分析純) 天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司；亞硝酸鈉(分析純) 天津市紅巖化學(xué)試劑廠；冰醋酸(分析純) 西安三浦精細(xì)化工廠；膽固醇(分析純)，蔗糖酯(分析純)，膽固醇試劑盒和甘油三酯試劑盒 長春匯力生物技術(shù)有限公司；豬膽鹽 北京奧博星生物技術(shù)有限公司；超氧化物歧化酶(SOD酶)試劑盒 南京建成科技有限公司.

1.2　儀器與設(shè)備

B203LEDR型生物顯微鏡：重慶奧特光學(xué)儀器有限公司；AC-0629型普通光學(xué)顯微鏡：重慶光學(xué)儀器有限公司；DS-1型高速組織搗碎機(jī)：上海標(biāo)本模型廠； DHP9080型電熱恒溫培養(yǎng)箱：上海佳勝實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司；LS-C50L型立式壓力蒸汽滅菌鍋：江陰濱江醫(yī)療設(shè)備廠；UV-2600型紫外可見分光光度計(jì)：尤尼柯儀器有限公司；冷凍離心機(jī)：安徽中科中佳科學(xué)儀器有限公司；上海儀電科學(xué)儀器股份有限公司.

1.3　培養(yǎng)基

(1)MRS培養(yǎng)基：蛋白胨10 g，牛肉膏5 g，檸檬酸二胺2 g，牛肉膏10 g，葡萄糖20 g，Tween-80 1 mL，乙酸鈉5 g，磷酸氫二鉀2 g，硫酸鎂0.58 g，硫酸錳0.25 g，蒸餾水1 000 mL，pH值6.0，在121 ℃滅菌20 min.

(2)膽固醇(TC)培養(yǎng)基：準(zhǔn)確稱量0.1 g膽固醇于小燒杯，加入1 mL Tween-80，0.1 g蔗糖酯，攪拌均勻后加入5.0 mL冰乙酸，邊加熱邊攪拌至充分溶解，超聲處理15 min后再加入MRS培養(yǎng)基中，邊加邊攪拌，使膽固醇濃度為0.1 mg/mL，然后加入0.2%巰基乙酸鈉，調(diào)pH值為6.0，121 ℃滅菌15 min.

(3)甘油三酯(TG)培養(yǎng)基：將Tween-80與豬油按1∶5比例混合，邊加熱邊攪拌至充分溶解，保溫5 min后乳化，得到甘油三酯膠束.按6%的比例將甘油三酯膠束加入MRS培養(yǎng)基中，邊加邊攪拌，然后加入0.2%巰基乙酸鈉，調(diào)pH值為6.0，121 ℃滅菌15 min.

(4)蔬菜培養(yǎng)基：小白菜30 g，小青菜30 g，油麥菜30 g，清洗、切段后，使蔬菜和水的比例為1∶1，用高速組織搗碎機(jī)打漿，過40目篩，添加10 g玉米淀粉，105 ℃條件下滅菌15 min，冷卻后備用.

1.4　實(shí)驗(yàn)方法

1.4.110株益生菌對膽鹽的耐受能力[11]

將不同濃度的豬膽鹽加入到MRS培養(yǎng)基中，按1%的量接種后在最適溫度下培養(yǎng)48 h，以未加入膽鹽的培養(yǎng)基作為對照，用分光光度計(jì)在600 nm處測量OD值.

1.4.210株益生菌對膽固醇的降解能力[12]

將10株益生菌接種到膽固醇培養(yǎng)基后在最適溫度下培養(yǎng)48 h，每隔6個小時測定TC降解量，以不含TC為對照，將培養(yǎng)基5 000 r/min離心10 min，用膽固醇試劑盒測定TC的量.

1.4.310株益生菌對甘油三酯的降解能力[13]

將10株益生菌接種到甘油三酯培養(yǎng)基后在最適溫度下培養(yǎng)48 h，每隔6個小時測定TG降解量，以不含TG為對照，將培養(yǎng)基5 000 r/min離心10 min，用甘油三酯試劑盒測定TG的量.

1.4.410株益生菌發(fā)酵過程中的活菌數(shù)變化[14]

將10株益生菌(保加利亞乳桿菌、嗜酸乳桿菌、植物乳桿菌、乳雙歧桿菌、鼠李糖乳桿菌、副干酪乳桿菌、糞鏈球菌、嗜熱鏈球菌、干酪乳桿菌、羅伊氏乳桿菌)分別接種在蔬菜培養(yǎng)基中，測定發(fā)酵過程中的活菌數(shù)變化，優(yōu)選出生長較好的益生菌.

1.4.57株益生菌發(fā)酵過程中總酸變化

將7株生長較好的益生菌(保加利亞乳桿菌、嗜酸乳桿菌、植物乳桿菌、鼠李糖乳桿菌、副干酪乳桿菌、干酪乳桿菌、羅伊氏乳桿菌)分別接種在蔬菜培養(yǎng)基中，在0 h、8 h、16 h、24 h、32 h、40 h、48 h發(fā)酵過程中測定總酸變化.

1.4.67株益生菌發(fā)酵過程中SOD酶的活性變化[15]

將7株生長較好的益生菌(保加利亞乳桿菌、嗜酸乳桿菌、植物乳桿菌、鼠李糖乳桿菌、副干酪乳桿菌、干酪乳桿菌、羅伊氏乳桿菌)分別接種在蔬菜培養(yǎng)基中，在0 h、8 h、16 h、24 h、32 h、40 h、48 h發(fā)酵過程中測定SOD酶的活性變化.

1.4.77株益生菌發(fā)酵過程中亞硝酸鹽含量變化

將7株生長較好的益生菌(保加利亞乳桿菌、嗜酸乳桿菌、植物乳桿菌、鼠李糖乳桿菌、副干酪乳桿菌、干酪乳桿菌、羅伊氏乳桿菌)分別接種在蔬菜培養(yǎng)基中，在0 h、8 h、16 h、24 h、32 h、40 h、48 h發(fā)酵過程中測定亞硝酸鹽含量變化.

1.5　測定方法

(1)膽固醇含量測定方法：膽固醇試劑盒.

(2)甘油三酯含量測定方法：甘油三酯試劑盒.

(3)活菌數(shù)測定方法：高層瓊脂柱計(jì)數(shù).

(4)總酸測定方法：酸堿滴定法.

(5)SOD酶活力的測定方法：試劑盒(羥胺法).

(6)亞硝酸鹽含量測定方法[16,17]：鹽酸萘乙二胺法GB/T 5009.33-2010.

2結(jié)果與討論

2.1　10株益生菌對膽鹽的耐受能力

膽汁鹽具有抗菌性，乳桿菌被食入后菌體要能夠抵抗膽汁鹽，菌種對膽鹽的耐受性是衡量益生菌的重要指標(biāo)[18].對10株益生菌進(jìn)行了膽鹽耐受性測試，由圖1可知，當(dāng)膽鹽濃度為0.1%時，LB、LC、LP、LCP和LGG的菌種存活率范圍在37%~88%之間，在膽鹽濃度為0.3%時，LC、LP和LGG的菌種存活率均大于30%；隨著膽鹽濃度的增加，菌的存活率逐漸下降，膽鹽濃度為0.4%時，LC、LP和LGG的菌種存活率在30%左右，其它7種菌的存活率低于5%.

圖1　10株益生菌對膽鹽的耐受能力

2.2　10株益生菌對膽固醇的降解能力

對10株益生菌進(jìn)行體外膽固醇降解實(shí)驗(yàn).由圖2可知，隨著時間的增加，菌株對膽固醇的降解量逐漸增加.LB、LC、LGG、LP、LCP和EF 5種益生菌降解膽固醇效果較好，分別為45.63%、48.13%、30.63%、20.80%、20.63%，16.88%；其中，LC對膽固醇的降解能力顯著高于其他菌株，達(dá)到45.60μg/mL，LA、LR和Bb-12對膽固醇的降解能力在5%左右，降解能力比較差.

圖2　10株益生菌對膽固醇的降解能力

2.3　10株益生菌對甘油三酯的降解能力

對10株益生菌進(jìn)行體外甘油三酯的降解實(shí)驗(yàn).由圖3可知，隨著時間的增加，菌株對甘油三酯的降解量逐漸增加,LB、LC、Bb-12、LR和EF降解甘油三酯效果較好，分別為23.06%、16.72%、31.08%、 44.6%、22.9%，其中，LR對甘油三酯的降解能力顯著高于其他菌株，達(dá)到1.66 mg/mL，LA、LP、LGG、ST和LCP降解甘油三酯的能力比較差，降解能力在5%~10%之間.

2.4　10株益生菌發(fā)酵過程中的活菌數(shù)變化

圖3　10株益生菌對甘油三酯的降解能力

由圖4可知，10種益生菌在蔬菜培養(yǎng)基中均能生長，嗜酸乳桿菌、植物乳桿菌和羅伊氏乳桿菌在穩(wěn)定期生長最好，活菌數(shù)達(dá)到109cfu/mL，嗜酸乳桿菌在24 h達(dá)到穩(wěn)定期，植物乳桿菌和羅伊氏乳桿菌在48 h達(dá)到穩(wěn)定期，保加利亞乳桿菌、干酪乳桿菌、副干酪乳桿菌和鼠李糖乳桿菌在穩(wěn)定期時生長情況較好，活菌數(shù)均在5×108～9.9×108cfu/mL，4種菌均在48 h達(dá)到穩(wěn)定期；嗜熱鏈球菌和糞鏈球菌生長情況較差，活菌數(shù)為107cfu/mL，乳雙歧桿菌在穩(wěn)定期時生長情況最差，活菌數(shù)在1×106~9×106cfu/mL之間，選取保加利亞乳桿菌、植物乳桿菌、干酪乳桿菌、副干酪乳桿菌、嗜酸乳桿菌、鼠李糖乳桿菌和羅伊氏乳桿菌進(jìn)行下一步實(shí)驗(yàn).

圖4　10株益生菌發(fā)酵過程中的活菌數(shù)變化

2.5　7株益生菌基發(fā)酵過程中總酸變化

由圖5可知，以不添加益生菌作為空白，分別向蔬菜培養(yǎng)基中添加7株益生菌，測定發(fā)酵過程中的總酸變化.發(fā)酵過程中接菌比不接菌的總酸含量要高，發(fā)酵48 h時空白組蔬菜培養(yǎng)基的總酸含量為0.1%，添加嗜酸乳桿菌的總酸含量達(dá)到0.92%，添加干酪乳桿菌的蔬菜培養(yǎng)基總酸含量達(dá)到0.78%，添加其它幾株菌的蔬菜培養(yǎng)基總酸含量在0.4%～0.6%之間.

圖5　7株益生菌發(fā)酵過程中的總酸變化

2.6　7株益生菌發(fā)酵過程中SOD酶的活性變化

由圖6可知，以不添加益生菌作為空白，分別向蔬菜培養(yǎng)基中添加7株益生菌，測定發(fā)酵過程中的SOD酶變化.發(fā)酵0 h時SOD酶的活力為127.87 U/mL，發(fā)酵24 h時SOD酶的活力達(dá)到153.27 U/mL，在繼續(xù)發(fā)酵過程中SOD酶的活力開始下降，發(fā)酵48 h時為128.29U/mL，而添加副干酪乳桿菌和嗜酸乳桿菌的蔬菜培養(yǎng)基中SOD酶的活力最終達(dá)到189.09 U/mL，而且這2種菌在發(fā)酵過程中會產(chǎn)生較多的SOD酶，羅伊氏乳桿菌發(fā)酵過程中幾乎不產(chǎn)SOD酶，添加其它幾株益生菌的蔬菜培養(yǎng)基中SOD酶的變化與空白組相比差別不大.

圖6　7株益生菌發(fā)酵過程中的SOD酶變化

2.7　7株益生菌發(fā)酵過程中亞硫酸鹽含量變化

由圖7可知，以不添加益生菌作為空白，分別向蔬菜培養(yǎng)基中添加7株益生菌，測定發(fā)酵過程中的亞硝酸鹽含量變化.不接菌時發(fā)酵40 h出現(xiàn)亞硝酸峰，亞硝酸鹽含量達(dá)到19.40 mg/kg，接入不同益生菌亞硝峰提前至16～24 h之間，羅伊氏乳桿菌降解亞硝酸的能力相對較差，亞硝峰為11.24 mg/kg，保加利亞乳桿菌、植物乳桿菌、干酪乳桿菌、嗜酸乳桿菌和鼠李糖乳桿菌降解亞硝酸鹽的能力較強(qiáng)，亞硝峰消失，整個發(fā)酵過程中亞硝酸鹽含量低于10 mg/kg，隨著發(fā)酵時間的延長，亞硝酸鹽的含量逐漸降低，最終低于0.2 mg/kg.

圖7　7株益生菌發(fā)酵過程中的亞硝酸鹽含量變化

3結(jié)論

本論文選用10株益生菌對其耐膽鹽、降膽固醇和降甘油三酯的益生特性進(jìn)行了比較研究，然后選用蔬菜培養(yǎng)基研究了發(fā)酵過程中10株益生菌的活菌數(shù)變化，篩選出增菌效果明顯的7株益生菌，研究了它們在發(fā)酵過程中蔬菜培養(yǎng)基的總酸、SOD酶和亞硝酸鹽含量變化.結(jié)果表明：10株益生菌都具有一定的益生功能，在膽鹽濃度為0.3%時，LC、LP和LGG的菌種存活率均大于30%；LC對膽固醇的降解能力顯著高于其他菌株，達(dá)到45.60μg/mL；LR對甘油三酯的降解能力顯著高于其他菌株，達(dá)到1.66 mg/mL；LB、LP、LC、LCP、LA、LGG和LR的活菌數(shù)都達(dá)到108cfu/mL；接入不同益生菌發(fā)酵24 h時酸度在0.4%～0.8%之間，LCP和LA在發(fā)酵過程中產(chǎn)生SOD酶，活力最終達(dá)到189.09 U/mL，添加LB、LP、LC、LA和LGG亞硝峰消失，發(fā)酵48 h后，亞硝酸鹽的含量低于0.2 mg/kg，本實(shí)驗(yàn)為益生菌益生特性的機(jī)理研究奠定了一定的理論基礎(chǔ).

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【責(zé)任編輯：陳佳】

Comparative study on probiotic properties of 10 strains probiotics

LV Jia-li, YAN Ya-mei, WANG Xiao-peng, LI Wen-juan, DU Bing

(School of Food and Biological Engineering, Shaanxi University of Science & Technology, Xi′an 710021, China)

Abstract:10 strains of selected probiotics are studied with their probiotic properties such as bile salt tolerance, degradation of cholesterol and triglyceride.Then the viable number of probiotics are detected when they are fermented in vegetable cultivation.On the basis of this,7 strains of probiotics which have significant growth-promoting effect are pick up and used for investigating the change of total acid,SOD enzyme and nitrite content.The result shows that the survival rate of LC,LP and LGG are more than 30%,when bile salt concentration was 0.3%,the degrading ability of cholesterol in LB,LC,LGG,LP,LCP,and EF bacteria are 45.63%,48.13%,30.63%,23.16%,20.63% and 16.88%,the degradation ability of triglyceride for 5 strains probiotics containing LB,LC,LR,Bb-12 and EF are followed by 23.06%,16.72%,44.6%,31.08%,22.9%;the viable counts of St,Bb-12 and EF is less than 107cfu/mL,on the contrary,the viable number of other 7 strains reach to 108cfu/mL;the total acid content of 7 strains bacteria are between 0.4% and 0.8% after fermenting for 24 hours;LCP and LA produce SOD enzyme in the fermentation process,the activity of SOD enzyme finally achieves 189.09 U/mL,the nitrite peak will disappear when adding LB,LP,LC,LA and LGG,the nitrite content is lower than 0.2 mg/kg after 48 hours.

Key words:probiotics; probiotic properties; vegetables; SOD enzyme

中圖分類號：TS201.3

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

文章編號：1000-5811(2016)01-0118-05

作者簡介:呂嘉櫪(1964-)，女，陜西三原人，教授，研究方向：應(yīng)用微生物學(xué)

基金項(xiàng)目：陜西省科技廳科技統(tǒng)籌創(chuàng)新工程計(jì)劃項(xiàng)目(2011KTCQ03-08)

收稿日期:*2015-11-28