陳雪峰， 焦文冬， 劉　寧， 馬文錦， 孫玉姣

(陜西科技大學(xué) 食品與生物工程學(xué)院， 陜西 西安　710021)

?

集胞藻6803基因組DNA提取方法的比較

陳雪峰， 焦文冬， 劉寧， 馬文錦， 孫玉姣

(陜西科技大學(xué) 食品與生物工程學(xué)院， 陜西 西安710021)

摘要：比較了PVP法、CTAB法和SDS法對(duì)集胞藻6803(Synechocystis sp.PCC6803)基因組DNA的提取效果，并采用紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)、瓊脂糖凝膠電泳及PCR擴(kuò)增檢測(cè)基因組DNA質(zhì)量.結(jié)果表明，三種方法均能提取到符合分子生物學(xué)要求的基因組DNA，其中SDS法提取的DNA綜合質(zhì)量最高.以提取的基因組DNA為模板，以sll0853引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，三種方法均能擴(kuò)增出目的條帶，其中CTAB法及SDS法的條帶更為清晰.

關(guān)鍵詞：集胞藻6803； 基因組DNA提取； PCR擴(kuò)增

0引言

集胞藻屬于藍(lán)藻門(mén)、藍(lán)藻綱、色球藻目、色球藻科集胞藻屬，是一種生活在淡水中的單細(xì)胞藍(lán)藻.其光合作用與高等植物類(lèi)似，即吸收光能轉(zhuǎn)化成CO2和水，生成有機(jī)化合物并釋放氧氣，也能利用葡萄糖等物質(zhì)進(jìn)行異養(yǎng)生長(zhǎng)[1].

近年來(lái)，隨著分子生物學(xué)技術(shù)的快速發(fā)展，集胞藻等一些研究較多的藍(lán)藻已成為分子生物學(xué)和基因工程研究中的重要模式生物，廣泛應(yīng)用于異形胞的發(fā)育、光合作用、固氮作用和外源基因的表達(dá)等方面的研究，并且越來(lái)越多的基因在藍(lán)藻中都得到了表達(dá)[2-5].集胞藻作為光合作用的模式生物，具有很高的光合效率.發(fā)狀念珠藻是一種具有很高營(yíng)養(yǎng)價(jià)值和經(jīng)濟(jì)價(jià)值的可食用絲狀藍(lán)藻，若將集胞藻的高光合作用系統(tǒng)轉(zhuǎn)入食用發(fā)狀念珠藻中并有效表達(dá)，得到具有高固碳功能的發(fā)狀念珠藻，對(duì)于發(fā)狀念珠藻人工培養(yǎng)、荒漠生態(tài)恢復(fù)、改善土壤性質(zhì)和沙漠治理發(fā)揮著積極作用.

簡(jiǎn)單、快速地分離提取高質(zhì)量的基因組DNA是進(jìn)行分子生物學(xué)研究的基礎(chǔ)，藻類(lèi)基因組DNA的提取方法多與植物基因組DNA提取方法相同，但不同的藻類(lèi)細(xì)胞中所含次生代謝產(chǎn)物的種類(lèi)、含量不同，適合的提取方法也不同.

董學(xué)衛(wèi)等[6]采用高鹽法、CTAB法、PVP法和石英砂法4種方法對(duì)聚球藻7002基因組DNA進(jìn)行提取并進(jìn)行PCR擴(kuò)增，結(jié)果表明4種方法均能提取到符合分子生物學(xué)要求的基因組DNA，其中PVP法質(zhì)量最高，石英砂法濃度最高，4種方法提取到的基因組DNA均能擴(kuò)增出理想條帶；邰麗華等[7]比較并摸索了超聲波和溶菌酶兩種不同破壁方法對(duì)螺旋藻基因組DNA的提取效果的影響，結(jié)果表明兩種破壁方法均可得到高質(zhì)量、高得率的螺旋藻基因組DNA，其中超聲波法破壁不易掌控，而適當(dāng)濃度的溶菌酶法可獲得較理想的結(jié)果；楊澤民等[8]對(duì)金藻基因組DNA的提取方法進(jìn)行了深入研究，結(jié)果表明，就球形棕囊藻而言，玻璃粉法是4種方法中最好的DNA提取方法，就綠色巴夫藻而言，從經(jīng)濟(jì)和方便考慮，以高鹽法為最好.由于集胞藻細(xì)胞壁外有一層由多糖所組成的透明膠質(zhì)，同時(shí)細(xì)胞內(nèi)也含有多種蛋白及色素[9]，高質(zhì)量的藻類(lèi)基因組DNA較難提取，目前有關(guān)藻類(lèi)基因組DNA的提取的文章報(bào)道較少，集胞藻基因組DNA的提取的文章還未見(jiàn)報(bào)道.

本實(shí)驗(yàn)選取PVP法、SDS法和CTAB法3種常規(guī)提取植物基因組DNA的方法[10]分別用于集胞藻6803基因組DNA的提取，并采用紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)、瓊脂糖凝膠電泳及PCR擴(kuò)增檢測(cè)基因組DNA質(zhì)量.通過(guò)檢測(cè)結(jié)果的比較，以期篩選出一種能夠得到高質(zhì)量、高產(chǎn)量的集胞藻6803基因組DNA的提取方法，為集胞藻分子生物學(xué)水平的進(jìn)一步研究提供理論基礎(chǔ)和技術(shù)支持.

1材料與方法

1.1　供試菌株、主要試劑及儀器

(1)供試菌株：集胞藻6803(Synechocystis sp.PCC6803)，購(gòu)自中科院典型培養(yǎng)物保藏委員會(huì)淡水藻種庫(kù)(FACHB).藻種采用BG-11培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度為25 ℃，光照強(qiáng)度為2 500 lx，光暗比為12 h∶12 h，培養(yǎng)時(shí)間為10 d.

(2)試劑：PCR所用試劑均購(gòu)自天根生化科技(北京)有限公司，引物購(gòu)自上海生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司.

(3)儀器：Eppendorf 5430小型高速離心機(jī)(艾本德中國(guó)有限公司)，CYCP-21DN型電泳儀(北京六一儀器廠(chǎng))，UV-1100紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)(上海美譜達(dá)有限公司)，MyCycler Thermal Cycler型PCR儀(北京伯樂(lè)生命科學(xué)發(fā)展有限公司)，F(xiàn)R-980A生物電泳成像分析系統(tǒng)(上海復(fù)日科技有限公司).

1.2　DNA提取方法

取冷凍干燥后的集胞藻藻粉，于液氮中冷凍研磨后稱(chēng)取0.1 g置于離心管中，分別采用以下3種方法提取DNA.提取的DNA均溶于100μL TE緩沖液中，并于-20 ℃保藏以備后續(xù)使用.

1.2.1SDS法

參考王景雪[11]的方法.先加入800μL預(yù)熱(65 ℃)的SDS提取液至裝有藻粉的離心管，65 ℃水浴30 min，不時(shí)顛倒混勻；再加入1/3體積KAC(5 M)混勻，冰浴20 min后離心20 min(10 000 r/min，4 ℃)；取上清液加入等體積預(yù)冷的氯仿∶異丙醇(24∶1)，顛倒混勻，離心5 min(12 000 r/min，4 ℃)；取上清液加入等體積預(yù)冷的異丙醇，顛倒混勻至見(jiàn)絲狀沉淀，-20℃靜置30 min沉淀DNA；離心10 min(12 000 r/min，25 ℃)后，用70%乙醇清洗沉淀兩次,自然干燥.

SDS法提取液：100 mM Tris-HCl(pH 8.0)，500 mM NaCl，50 mM EDTA(pH8.0)，20% SDS，10 mM β-巰基乙醇.

1.2.2PVP法

參考C.S.Kim[12]的方法.液氮冷凍研磨時(shí)加入適量β-巰基乙醇(1% V/V)，加入800μL PVP提取液至裝有藻粉的離心管，充分混勻并于室溫下溫育1 h，期間上下顛倒數(shù)次；再依次加入PVP(終濃度達(dá)到6%)及1/2倍體積NH3AC(7.5 M)并充分混勻，冰浴30 min后離心10 min(10 000 r/min，4 ℃)；取上清液加入等體積預(yù)冷的異丙醇，于-20 ℃下靜置30 min沉淀DNA；離心10 min(10 000 r/min，4 ℃)后去上清，沉淀自然干燥后重懸于500μL TE緩沖液中，加入2μL Rnase(1 mg/mL)并于37 ℃溫育15 min；然后加入等體積氯仿∶異戊醇(24∶1)輕搖至乳白色，離心5 min(10 000 r/min，4 ℃)后將上清液轉(zhuǎn)移至新離心管中，重復(fù)至無(wú)蛋白質(zhì)層出現(xiàn)；最后取上清液加入等體積預(yù)冷異丙醇，-20 ℃下靜置10 min后離心,用80%的乙醇清洗沉淀,自然干燥.

PVP法提取液：200 mM Tris-HCl(pH 8.0)，250 mM NaCl，25 mM EDTA(pH8.0)，0.5% SDS.

1.2.3CTAB法

參考楊澤民[8]的方法.先加入800μL CTAB提取液(65 ℃預(yù)熱)至裝有藻粉的離心管，充分混勻并于65 ℃水浴1 h，期間上下顛倒數(shù)次；冷卻至室溫后加入預(yù)冷的氯仿∶異丙醇(24∶1)，旋渦振蕩2 min，離心10 min(12 000 r/min，4 ℃)后保留上清液，重復(fù)至無(wú)蛋白質(zhì)層出現(xiàn)；然后取上清液加入1/3體積預(yù)冷的異丙醇，-20 ℃放置30 min后上下輕搖至出現(xiàn)白色絮狀沉淀，離心10 min(12 000 r/min，4 ℃)后保留沉淀，自然風(fēng)干，然后用75%的乙醇及5 M的醋酸鈉清洗1次，75%乙醇及無(wú)水乙醇各清洗1次后自然干燥.

CTAB 法提取液：100 mM Tris-HCl(pH 8.0)，1.4 M NaCl，10 mM EDTA(pH8.0)，2% CTAB，2%β-巰基乙醇.

1.3　DNA質(zhì)量檢測(cè)方法

1.3.1紫外分光光度檢測(cè)

取50μL用不同方法提取的DNA樣品補(bǔ)加去離子水至4 mL，用紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)分別測(cè)量在230 nm、260 nm、280 nm的吸光度.

1.3.2瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)

樣品DNA在0.8%瓊脂糖凝膠、0.5×TBE緩沖液、電壓4~5 V/cm，電泳30 min，0.5μg/mL EB溶液中染色20 min，凝膠成像系統(tǒng)觀(guān)察并拍照，分析DNA質(zhì)量.

1.3.3PCR擴(kuò)增檢測(cè)

為了進(jìn)一步說(shuō)明三種方法提取獲得的高質(zhì)量、高分子量的DNA，利用引物sll0853[1](上海生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司產(chǎn)品)對(duì)三種樣品DNA 模板進(jìn)行PCR 擴(kuò)增.PCR反應(yīng)體系(25μL)為：12.5μL 2×Taq PCR MasterMix，正反引物上下游各1.0μL，DNA模板1.5μL，補(bǔ)ddH2O至25μL；PCR 反應(yīng)條件為：94 ℃預(yù)變性2 min；94 ℃變性20 s；67.5 ℃復(fù)性25 s；72 ℃延伸30 s，20個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸2 min，4 ℃保溫.擴(kuò)增產(chǎn)物用1.0%瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測(cè)，并用凝膠成像系統(tǒng)拍照.

2結(jié)果與討論

2.1　紫外分光光度計(jì)檢測(cè)結(jié)果

核酸的嘌呤、嘧啶堿基環(huán)上的許多原子中都含有共軛雙鍵，在260 nm處對(duì)紫外光有較強(qiáng)的吸收[13].純凈DNA在260 nm處的吸收值與280 nm處吸收值的比值(OD 260/OD 280)約為1.80，小于1.80說(shuō)明提取的DNA中有蛋白質(zhì)污染，大于1.80則說(shuō)明提取的DNA中可能還有RNA[14]；并且OD 260與OD 230的比值應(yīng)大于2.00，小于等于2.00說(shuō)明可能殘存核甘酸、氨基酸、酚類(lèi)、有機(jī)溶劑、鹽等小分子雜質(zhì)[15].

提取的集胞藻基因組DNA在220~300 nm處的紫外吸收光譜表明：三種方法提取的集胞藻基因組DNA在260 nm附近均有吸收峰(如圖1所示).與SDS法及PVP法相比，CTAB法提取的DNA 260 nm/280 nm的值為1.820，260 nm/230 nm的值為2.097(如表1所示)，說(shuō)明CTAB法提取的DNA純度高，蛋白質(zhì)、酚類(lèi)及多糖類(lèi)雜質(zhì)除去更為完全，殘留的氯仿、乙醇等小分子成分最少.SDS法提取的DNA 260 nm/280 nm、260 nm/230 nm的值分別為2.125和2.097，說(shuō)明該方法提取的DNA還殘存RNA，但小分子雜質(zhì)去除的比較干凈；而PVP法提取DNA 260 nm/280 nm、260 nm/230 nm的值分別為1.701及2.199，說(shuō)明PVP法提取的DNA中不僅存在蛋白質(zhì)污染，還殘留了大量小分子的雜質(zhì).

圖1　三種方法提取的集胞藻6803基因組DNA在220~300 nm下的吸光度

樣品顏色OD260/OD280OD260/OD230DNA樣品濃度/(μg/mL)CTAB法a1.820±n2.097608PVP法b1.701±n1.075114SDS法b2.125±n2.199424

注：a為白色；b為淡黃色；n≤0.1

DNA 樣品的濃度= OD260×DNA 稀釋倍數(shù)×50(單位:μg /mL)[16].三種方法提取的DNA樣品的OD260值表明，不同方法提取的DNA 產(chǎn)量不同.其中CTAB法提取的DNA濃度最高(608μg/mL)，SDS法提取的DNA濃度較高(424μg/mL)，PVP法提取的DNA濃度最小(114μg/mL).

2.2　瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)結(jié)果

將提取的基因組DNA進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，以標(biāo)準(zhǔn)分子量DNA Hind Ⅲ為參照物進(jìn)行對(duì)照，基因組DNA均大于23 kb，表明獲得的是較大分子量的基因組DNA(如圖2所示)，完整性較好，無(wú)明顯的拖尾現(xiàn)象.

M為23 kb DNA Ladder；A為CTAB法；B為SDS法；C為PVP法.圖2　三種方法提取的集胞藻6803基因組DNA瓊脂糖凝膠電泳圖譜

2.3　PCR檢測(cè)結(jié)果

sll0853引物的PCR擴(kuò)增結(jié)果如圖3所示.從圖3可以看出，用三種方法提取的基因組DNA在500~750 bp處均能擴(kuò)增出與預(yù)期大小(561 bp)相符的條帶.

M為T(mén)rans 2k DNA Maker；A為PVP法；B為CTAB法；C為SDS法.圖3　sll0853引物的 PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物結(jié)果

3結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)從實(shí)用的角度出發(fā)，選擇了三種植物常用的基因組DNA提取方法(SDS法、CTAB法和PVP法)提取集胞藻基因組DNA，并對(duì)其質(zhì)量進(jìn)行了比較研究.綜合DNA提取和PCR擴(kuò)增結(jié)果，SDS法及CTAB法提取的DNA 質(zhì)量好，產(chǎn)量高，該結(jié)果與張偉等人的研究結(jié)果相一致[17-19].其中CTAB法對(duì)集胞藻提取的基因組DNA 的質(zhì)量和產(chǎn)量都略?xún)?yōu)于SDS法，這是由于CTAB提取緩沖液對(duì)細(xì)胞的裂解能力強(qiáng)于SDS提取緩沖液，并且CTAB與酚-氯仿結(jié)合使用效果較好，更適用于含細(xì)胞壁及含多糖、酚類(lèi)等多種次生代謝產(chǎn)物的細(xì)胞[9,20].但SDS法較CTAB法操作步驟簡(jiǎn)單、溫和，更適用于快速、大量的提取滿(mǎn)足PCR實(shí)驗(yàn)要求的DNA樣品，能夠?yàn)楹罄m(xù)進(jìn)行高通量篩選提供可靠的技術(shù)支持.PVP法雖然可以簡(jiǎn)單快速的提取到基因組DNA，但其質(zhì)量和產(chǎn)量均不太理想.由此可見(jiàn)，對(duì)于集胞藻，SDS法是這三種方法中最經(jīng)濟(jì)、高效、安全的基因組DNA 的提取方法.

參考文獻(xiàn)

[1] 劉欣.集胞藻PCC6803基因sll0853的初步研究[D].武漢：中南民族大學(xué),2012.

[2] 席超,王春梅,施定基.藍(lán)藻基因工程應(yīng)用研究進(jìn)展[J].中國(guó)生物工程雜志,2010,35(3):105-111.

[3] 方萍.集胞藻PCC6803中sll1466的基因工程研究[D].武漢：華中科技大學(xué),2009.

[4] Yukako Hihara,Ayako Kamei,Minoru Kanehisa,et al.DNA microarray analysis of cyanobacterial gene expression during acclimation to high light[J].The Plant Cell,2001,13(5):793-806.

[5] Takeshima Y,Takatsugu N,Sugiura M,et al.High-level express ion of human superoxide dismutase in the cyanobacterium anacystis nidulans 6301[J].Proceedings of the National Academy of Sciences,1994,91(21):9 685-9 689.

[6] 董學(xué)衛(wèi),李有志,何慶芳,等.聚球藻7002基因組DNA提取方法比較[J].北方園藝,2013(20):95-97.

[7] 邰麗華,于濤,張曉嶸,等.螺旋藻基因組DNA制備方法的摸索與比較[J].科學(xué)技術(shù)與工程,2007,7(22):5 755-5 758.

[8] 楊澤民,章群,謝數(shù)濤,等.金藻基因組DNA的提取與PCR擴(kuò)增[J].生物學(xué)雜志,2008,26(1):60-63.

[9] 王永紅.集胞藻6803封閉式光生物反應(yīng)器混合營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)及其生理學(xué)研究[D].上海：華東理工大學(xué),2000.

[10] 易慶平,羅正榮,張青林,等.植物總基因組DNA提取純化方法綜述[J].安徽農(nóng)業(yè)科學(xué),2007,35(25):7 789-7 791.

[11] 王景雪,孫毅,高武,等.一種簡(jiǎn)便實(shí)用的植物總DNA提取方法[J].山西大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版),2000,23(3):271-272.

[12] C.S.Kim,C.H.Lee,J.S.Shin,et al.A simple and rapid method for isolation of high quality genomic DNA from fruit trees and conifers using PVP[J].Nucleic Acids Research,1997,25(5):1 085-1 086.

[13] 彭秀玲,袁漢英,謝毅,等.基因工程實(shí)驗(yàn)技術(shù)[M].長(zhǎng)沙:湖南科學(xué)技術(shù)出版社,1997.

[14] 曹凱鳴.核酸化學(xué)導(dǎo)論[M].上海:復(fù)旦大學(xué)出版社,1991.

[15] 姜泊.分子生物學(xué)常用實(shí)驗(yàn)方法[M].北京:人民軍醫(yī)出版社,1996.

[16] 李憲臻.生物化學(xué)[M].武漢:華中科技大學(xué)出版社,2008.

[17] 張偉,謝甫綈,曹萍,等.大豆葉片DNA提取方法的比較研究[J].大豆科學(xué),2007,26(1):60-65.

[18] 尚嘯,王健,龔勝,等.三色堇葉片DNA不同提取方法比較[J].湖北農(nóng)業(yè)科學(xué),2014,53(20):4 999-5 002.

[19] R.A.Ribeiro,M.B.Lovato.Comparative analysis of different DNA extraction protocols in fresh and herbariun specimens of the genus dalbergia[J].Genetics and Molecular Reseach,2007,6(1):173-187.

[20] 王珍,方宣鈞.植物DNA分離[J].分子植物育種,2003,1(2):281-288.

【責(zé)任編輯：蔣亞儒】

Comparative analysis of different DNA extraction

protocols in Synechocystis 6803

CHEN Xue-feng， JIAO Wen-dong， LIU Ning， MA Wen-jin， SUN Yu-jiao

(School of Food and Biological Engineering, Shaanxi University of Science & Technology, Xi′an 710021, China)

Abstract:PVP method,CTAB method and SDS method were used in this paper to obtained good quality DNA extracted from Synechocystis sp.PCC6803.And the DNA quality was tested by the ultraviolet spectrophotometer,Agarose gel electrophoresis and PCR amplification.The results shows that genomic DNA conform to the requirements of molecular biology can be extracted by those three methods,and SDS method was better than the others in terms of the value and yields of genomic DNA extraction.The PCR amplification of the Synechocystis genomic DNA extracted in different ways were studied with primer sll0853.Both of CTAB and SDS method can amplificate more clear bands than the PVP method.

Key words:Synechocystis 6803; DNA extraction; PCR amplification

中圖分類(lèi)號(hào)：Q781

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

文章編號(hào)：1000-5811(2016)01-0123-05

作者簡(jiǎn)介:陳雪峰(1964-),男,陜西寶雞人,教授,博士生導(dǎo)師,研究方向:食品功能成分及生物技術(shù)

基金項(xiàng)目：國(guó)家自然科學(xué)基金青年項(xiàng)目(31401633); 陜西科技大學(xué)國(guó)家基金后補(bǔ)助項(xiàng)目(2014XHBZ-10)

收稿日期:*2015-10-16