曾武城　曹　毅★　楊曉紅　陶茂燦　羅宏賓

甘草次酸和EGF對HaCaT細(xì)胞miR-21/ PDCD4表達(dá)的調(diào)控研究

曾武城曹毅★楊曉紅陶茂燦羅宏賓

目的 探討甘草次酸和表皮生長因子（EGF）對角質(zhì)細(xì)胞（HaCaT）miR-21/PDCD4表達(dá)的調(diào)控作用。方法 PCR法檢測空白組、25ng/mlEGF組、25μm甘草次酸組、25ng/mlEGF聯(lián)合25μm甘草次酸組對HaCaT細(xì)胞miR-21、PDCD4mRNA表達(dá)的影響。結(jié)果 25μm甘草次酸明顯抑制HaCaT細(xì)胞miR-21的表達(dá)水平，促進HaCaT細(xì)胞PDCD4mRNA的表達(dá)；25μm甘草次酸抑制25ng/mlEGF對HaCaT細(xì)胞miR-21的促表達(dá)作用，25μm甘草次酸抑制25ng/mlEGF對HaCaT細(xì)胞PDCD4mRNA的下調(diào)作用。結(jié)論 甘草次酸抑制HaCaT細(xì)胞miR-21的表達(dá)、上調(diào)PDCD4mRNA的表達(dá)，同時可抑制EGF對HaCaT細(xì)胞miR-21的促表達(dá)作用和對PDCD4mRNA的下調(diào)作用。

甘草次酸 表皮生長因子 miR-21/PDCD4 銀屑病

近年來基因表達(dá)和蛋白翻譯過程中的調(diào)節(jié)分子miRNA，逐漸被發(fā)現(xiàn)在銀屑病的發(fā)病機制中發(fā)揮重要作用［1］。目前基本可以明確在銀屑病的皮損及外周血中miR-21表達(dá)升高，但對其功能的研究還處在初級階段。前期實驗研究發(fā)現(xiàn)甘草次酸可以濃度依賴性地抑制角質(zhì)細(xì)胞（HaCaT）增殖，并下調(diào)表皮生長因子（EGF）對HaCaT細(xì)胞的促增殖作用［2］。在此項研究中，作者將對甘草次酸和EGF作用下HaCaT細(xì)胞miR-21及其靶蛋白PDCD4表達(dá)的改變進行觀察，進一步闡明甘草次酸抑制HaCaT細(xì)胞增殖的可能機制，為甘草次酸在銀屑病中的應(yīng)用奠定部分實驗基礎(chǔ)。

1　材料與方法

1.1主要試劑及儀器 高糖細(xì)胞培養(yǎng)基（DMEM）、胎牛血清、0.25% 胰酶/EDTA（美國Invitrogen公司），甘草次酸（上海同田生物公司），EGF（上海同田生物公司 ），逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、擴增試劑盒［寶生物工程（大連）有限公司］，核糖核酸提取試劑盒Trizol（lnvitrogen公司），ABI-7900HT高通道熒光定量PCR儀（美國）。1.2 細(xì)胞培養(yǎng) 角質(zhì)形成細(xì)胞株HaCaT細(xì)胞為凍存細(xì)胞，使用高糖DMEM培養(yǎng)基［內(nèi)含10%（V/V）胎牛血清、100U/ml青霉素、100μg/ml鏈霉素］，培養(yǎng)條件為5%CO2、37℃恒溫培養(yǎng)箱，飽和濕度95%。

1.3Real time PCR法檢測EGF、甘草次酸對HaCaT細(xì)胞miR-21/PDCD4表達(dá)情況的影響 （1）細(xì)胞處理：取對數(shù)生長期HaCaT細(xì)胞用胰酶/EDTA消化后重懸于含10% 胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基，放置于孵箱中24h后，細(xì)胞長滿板底70%～80%，移出培養(yǎng)基，用PBS沖洗2次后進行分組處理，空白組：加入3ml無血清DMEM。EGF組：加入含EGF （25 ng/ ml） 的無血清DMEM 3ml。甘草次酸組：加入含甘草次酸 （25μm） 的無血清DMEM 3ml。甘草次酸聯(lián)合EGF組：加含EGF （25ng/ml）及甘草次酸 （25μm）的無血清DMEM 3ml。繼續(xù)孵育24h后，提取細(xì)胞總RNA。（2）總RNA的提?。悍椒▍⒄諏毶锕こ蹋ù筮B）有限公司RNAiso Plus（Total RNA提取試劑）說明書，所有操作均用無酶無菌的相關(guān)耗材，注意嚴(yán)格無酶操作，提取處理24h后各組細(xì)胞總RNA，提完后溶于DEPC水中至50μl，測各組RNA濃度后分裝，-70℃保存待用。（3）miR-21、PDCD4 cDNA的制備：miR-21cDNA嚴(yán)格按照說明書，反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系包括：2×miRNA Reaction Buffer Mix （for Real Time）* 1 10μl； miRNA PrimeScript RT Enzyme Mix 2μl；0.1% BSA 2μl；總RNA及無RNA酶水共6μl，總反應(yīng)體系20μl，逆轉(zhuǎn)錄條件：37℃ 60min，85℃ 5s。PDCD4 cDNA用High Capacity cDNA Reverse Transcription Kit試劑盒，反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系包括：10×RT Buffer 2μl；25×dNTP Mix（100mM） 0.8μl；10×RT Random Primers 2.0μl；MultiScribe Reuerse Transcriptase 1.0μl；總RNA及無RNA酶水共14.2μl，總反應(yīng)體系為20μl，逆轉(zhuǎn)錄條件：25℃ 10min，37℃ 120min，85℃5min；進行miR-21、PDCD4反轉(zhuǎn)錄體系配置時應(yīng)額外增加10%的點樣量以補償后續(xù)過程中可能的消耗；反轉(zhuǎn)錄時，所有操作均用無酶無菌的相關(guān)耗材，注意嚴(yán)格無酶操作，所有操作在冰上完成；逆轉(zhuǎn)錄完成后立即放冰上冷卻，然后繼續(xù)進行相應(yīng)PCR擴增操作或-20度保存。（4）Real-time PCR擴增引物設(shè)計與合成：miR-21、5s特異性擴增引物由生物工程（大連）有限公司設(shè)計合成。PDCD4、Actin引物自行設(shè)計并由上海生物有限公司合成，PDCD4 上游引物：5'-GGGAAGGTTGCTGGATAGG，下游引物：5'-GTTCTCCTGGTCATCATCATAGTT，Actin上游引物：5'-TAAGTAGGCGCACAGTAGGTCTGA，下游引物：5'-AAAGTGCAAAGAACACGGCTAAG。Real-time PCR在ABI 7900 HT高通道熒光定量PCR儀上進行，每個樣本重復(fù)3次。反應(yīng)條件：①預(yù)變性 95℃ 10s。②PCR反應(yīng)，95℃ 5s，60℃ 20s，重復(fù)40次。③熔解。1.4 熒光定量RT-PCR結(jié)果分析 結(jié)合擴增曲線及熔解曲線分析，排除不合適的擴增樣本，將符合要求的miR-21、PDCD4熒光定量RT-PCR原始數(shù)據(jù)（采用系統(tǒng)自動分析獲取Ct值）取3次重復(fù)的平均值，用SPSS統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)處理。

1.5統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS17.0統(tǒng)計軟件。計量資料以（x±s）表示，采用t檢驗，計數(shù)資料采用χ2檢驗。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2　結(jié)果

2.1甘草次酸能抑制HaCaT細(xì)胞miR-21的表達(dá)，并可抑制EGF對HaCaT細(xì)胞miR-21的促表達(dá)作用 使用Real time PCR法檢測25 ng/mlEGF組、25 μm甘草次酸組、25 ng/ml EGF聯(lián)合 25 μm甘草次酸組對HaCaT細(xì)胞miR-21表達(dá)影響，25 ng/mlEGF組、25 μm甘草次酸組及25 ng/mlEGF聯(lián)合25 μm甘草次酸組miR-21表達(dá)分別為空白對照組的（2.28±0.11）、（0.24±0.05）、（0.68±0.08）倍（P＜0.01），且組間相比差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），與空白對照組比較，發(fā)現(xiàn)25 μm甘草次酸組能明顯抑制HaCaT細(xì)胞miR-21的表達(dá)，25 ng/mlEGF組能明顯促進HaCaT細(xì)胞miR-21的表達(dá)，同時25 μm甘草次酸能抑制25 ng/ mlEGF對HaCaT細(xì)胞miR-21的促表達(dá)作用（P＜0.01）。2.2 甘草次酸能促進HaCaT細(xì)胞PDCD4 mRNA的表達(dá)，同時能抑制EGF對HaCaT細(xì)胞PDCD4mRNA的抑制作用 使用Real time PCR法檢測25 ng/mlEGF組、25μm甘草次酸組、25 ng/ml EGF聯(lián)合 25 μm甘草次酸組對HaCaT細(xì)胞PDCD4mRNA的表達(dá)影響，25 ng/ mlEGF組、25 μm甘草次酸組及25 ng/mlEGF聯(lián)合25 μm甘草次酸組PDCD4mRNA表達(dá)分別為空白對照組的（0.32±0.09）、（2.76±0.12）、（0.56±0.07）倍（P＜0.01），且組間比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），與空白對照組比較，25 μm甘草次酸組能明顯促進HaCaT細(xì)胞PDCD4 mRNA的表達(dá)，25 ng/mlEGF組能明顯抑制HaCaT細(xì)胞PDCD4mRNA的表達(dá)，同時25μm甘草次酸能抑制25ng/mlEGF對HaCaT細(xì)胞PDCD4mRNA的抑制作用（P＜0.01）。

3　討論

miRNA是一類非編碼的單鏈小分子RNA，約20～24 核苷酸長度，可特異性的識別靶mRNA 的3’非翻譯區(qū)（3’UTR）并與之結(jié)合，引起靶mRNA的降解或翻譯抑制，從而對靶基因進行轉(zhuǎn)錄后表達(dá)調(diào)控，進而調(diào)節(jié)較多重要的細(xì)胞活動［3］。miR-21是唯一在所有已檢測的惡性腫瘤中均表達(dá)上調(diào)的miRNA，包括乳腺癌、結(jié)直腸癌、肺癌、胰腺癌等腫瘤中［4］。有研究表明，PTEN、PDCD4、Maspin、TPMI以及TIMP-3等均可能受到miR-21的靶向調(diào)節(jié)，參與細(xì)胞生長、侵襲和轉(zhuǎn)移等表型的特征性調(diào)控［5］。目前基本可以明確在銀屑病的皮損及外周血中miR-21表達(dá)升高，但對其功能的研究還處在初級階段。Ahmed等［6］發(fā)現(xiàn)BMP4可以通過抑制角質(zhì)形成細(xì)胞中miR-21的表達(dá)促進PTEN、PDCD4、等靶蛋白的表達(dá)，發(fā)揮對HaCaT細(xì)胞增殖和遷移的抑制作用，提示在皮膚角質(zhì)形成細(xì)胞中miR-21是BMP信號系統(tǒng)的重要下游因子，miR-21在維持角質(zhì)形成細(xì)胞的增殖和遷移過程中發(fā)揮重要作用。

甘草次酸作為甘草甜素的主要活性代謝產(chǎn)物，具有抗炎、鎮(zhèn)痛、抗過敏、抗人類免疫缺陷病毒、抗腫瘤、抗突變、提高機體免疫力等作用，受到了國內(nèi)外醫(yī)藥學(xué)界的重視。近年來以甘草甜素作為主要成分的美能制劑作為銀屑病的輔助治療藥物已經(jīng)得到廣泛應(yīng)用。甘草甜素本身也具有生物活性，但均較甘草次酸弱，是甘草次酸的前體藥物，甘草甜素被認(rèn)為具有糖皮質(zhì)激素樣的生物學(xué)作用，而無糖皮質(zhì)激素的副作用。作者認(rèn)為甘草次酸作為甘草甜素的主要活性代謝產(chǎn)物，將來可能可以作為有效而且安全的制劑應(yīng)用于銀屑病治療，因此必須要有相關(guān)的實驗支持。前期實驗證明，甘草次酸在1～100μm/L范圍內(nèi)濃度依賴性抑制HaCaT細(xì)胞增殖，同時通過抑制HaCaT細(xì)胞增殖下調(diào)EGF對HaCaT細(xì)胞的促增殖作用［2］，在此項研究中，作者以甘草次酸對HaCaT細(xì)胞miR-21/ PDCD4信號通路的調(diào)控為著點，對甘草次酸抗銀屑病角質(zhì)形成細(xì)胞增殖機制進行深入研究。本實驗結(jié)果顯示與空白對照組比較，25μm甘草次酸可有效抑制HaCaT細(xì)胞miR-21的表達(dá)水平，同時上調(diào)PDCD4mRNA的表達(dá)；還可下調(diào)25ng/ml EGF對HaCaT細(xì)胞miR-21的促表達(dá)作用和對PDCD4mRNA的抑制作用，結(jié)果提示甘草次酸與EGF可以對miR-21/PDCD4信號通路發(fā)揮一定的調(diào)控作用，miR-21/PDCD4在甘草次酸抑制EGF對HaCaT細(xì)胞的促增殖作用中可能發(fā)揮重要作用，結(jié)果為甘草次酸在銀屑病治療中的開發(fā)應(yīng)用提供實驗基礎(chǔ)。

1 Bostjancic E， Glavac D. Importance of micro RNAs in skin morphogenesis and diseases. Acta Dermatovenerol Alp Panonica Adriat，2008， 17（3）：95～102.

2 解凡，曹毅，劉改榮，等.甘草次酸抑制表皮細(xì)胞生長因子對HaCaT細(xì)胞促增殖作用的機制研究.中華皮膚科雜志，2013，46（4）：278～281.

3 Kluiver J，Gibcus JH， Hettinga C， et al.Rapid Generation of MicroRNA Sponges for MicroRNA Inhibition.PLoS One，2012，7（1）：e29275.

4 Pan X， Wang ZX， Wang R. MicroRNA-21： a novel therapeutic target in human cancer. Cancer Biol Ther，2011，10（12）：1224～1232.

5 Sheedy FJ，Palsson-McDermott E， Hennessy EJ，et al.Negative regulation of TLR4 via targeting of the proinflammatory tumor suppressor PDCD4 by the microRNA miR-21.Nature Immunology，2010，11（2）：141～147.

6 Ahmed MI，Mardaryev AN，Lewis CJ，et al.MicroRNA-21 is an important downstream component of BMP signalling in epidermal keratinocytes. J Cell Sci，2011，124（Pt 20）：3399～3404.

Objective To explore the effects of glycyrrhetinic acid and EGF on the expression of miR-21/PDCD4 in HaCaT cells. Methods PCR was used to detect in the blank group、25ng/ml EGF group、25μM glycyrrhetinic acid group、25 ng/ml EGF and 25μM glycyrrhetinic acid group on the effects of the expression of miR-21、PDCD4 mRNA in HaCaT cells. Results 25μM glycyrrhetinic acid significantly inhibited the expression level of miR-21 on HaCaT cell and promoted the expression of PDCD4 mRNA in HaCaT cell； 25μM glycyrrhetinic acid significantly inhibited the effect of 25ng/ml EGF on stimulating expression of miR-21 in HaCaT cell，and inhibiting the expression of PDCD4 mRNA in HaCaT cells. Conclusions Glycyrrhetinic acid inhibits the expression of miR-21 and stimulates the expression of PDCD4mRNA in HaCaT cells，and glycyrrhetinic acid inhibits the effect of EGF on stimulating the expression of miR-21 and down-regulates the expression of PDCD4 mRNA in HaCaT cells.

Glycyrrhetinic acid EGF miR-21/PDCD4 Psoriasis

310007 杭州市中醫(yī)院（曾武城）

310006 浙江中醫(yī)藥大學(xué)附屬第一醫(yī)院（曹毅 楊曉紅陶茂燦 羅宏賓）