楊光勇 郭海濤 劉茜明 何光志 田維毅 蔡 琨 王 平 梁建東 王文佳 韓 潔

重組人可溶性白細(xì)胞介素-4受體蛋白抑制大鼠哮喘研究

楊光勇 郭海濤 劉茜明 何光志 田維毅 蔡 琨 王 平 梁建東 王文佳 韓 潔

目的探討重組可溶性白細(xì)胞介素-4受體（IL-4R）對大鼠哮喘模型的影響。方法根據(jù)GenBank公布的Homo sapiens（human）IL-4R基因序列（XM_005255309），合成srhIL-4R基因片段，將合成基因片段插入pET-28a（+）構(gòu)建重組表達(dá)載體pET-28a(+)-srhIL-4R，酶切鑒定后，將載體轉(zhuǎn)入表達(dá)菌株BL21（DE3）進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)重組蛋白srhIL-4R，并用SDS-PAGE和Western-blotting方法分析重組蛋白。提取重組蛋白干預(yù)哮喘模型大鼠，取肺組織進(jìn)行病理切片觀察。結(jié)果重組載體pET-28a（+）-srhIL-4R酶切獲得長度為500bp～750bp的目的片段，表達(dá)載體pET-28a（+）-srhIL-4R轉(zhuǎn)入表達(dá)菌BL21（DE3）后經(jīng)IPTG誘導(dǎo)表達(dá)出的重組蛋白經(jīng)SDS-PAGE和Westernblotting方法可見重組蛋白分子量約為25kDa；重組人可溶性IL-4R蛋白干預(yù)哮喘大鼠可見肺組織炎細(xì)胞數(shù)量較模型組明顯減少。結(jié)論srhIL-4R防治哮喘具有一定作用。

大鼠；哮喘模型；重組人可溶性白細(xì)胞介素-4受體；重組蛋白

白細(xì)胞介素-4（interleukin-4，IL-4）是參與哮喘發(fā)病的重要細(xì)胞因子，白細(xì)胞介素-4α鏈（IL-4Rα）的胞外結(jié)構(gòu)域可溶性白細(xì)胞介素-4受體（soluble interleukin-4 receptor，sIL-4R）與白細(xì)胞介素-4（IL-4）具有高度特異結(jié)合能力，使得sIL-4R可以作為IL-4拮抗劑[1]。本研究由上海吉爾吉斯生物工程有限公司合成片段轉(zhuǎn)入pET-28a（+）構(gòu)建表達(dá)載體轉(zhuǎn)化表達(dá)菌株BL21（DE3）表達(dá)進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)重組人可溶性白細(xì)胞介素4受體（recombinant soluble human interleukin-4 receptor，srhIL-4R），提取srhIL-4R蛋白干預(yù)哮喘大鼠模型，旨在為下一步進(jìn)行srhIL-4R治療哮喘研究提供前期工作基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材 料 SPF級SD大鼠購自重慶騰鑫比爾實驗動物銷售有限公司；實驗動物合格證號：SCXK（渝）2012-0005；飼養(yǎng)條件：室溫清潔屏障環(huán)境。滅活百日咳桿菌原液，購自北京天壇生物制品股份有限公司；氫氧化鋁[AL（OH）3]、卵清蛋白（ovalbumin，OVA），購自北京索萊寶生物科技有限公司；超聲霧化器，購自美久陽公司；DNA Marker DL2000、大腸桿菌DH5α，均購自上海生工；限制性內(nèi)切酶（Nde I和Xho I），MBI公司產(chǎn)品；原核表達(dá)載體pET-28a（+），invitrogen產(chǎn)品；QIAquick膠DNA回收試劑盒，QIAGEN公司產(chǎn)品；一抗鼠抗srhIL-4R血清，由本實驗室制備保存；羊抗鼠辣根過氧化物酶偶聯(lián)IgG，購自南京聯(lián)科。

1.2 方 法

1.2.1 重組人可溶性白細(xì)胞介素-4受體（soluble human interleukin-4 receptor，srhIL-4R）基因擴(kuò)增與克隆 根據(jù)人可溶性白細(xì)胞介素4受體基因在Gen-Bank中公布的序列（XM_005255309），由上海吉爾吉斯生物工程有限公司合成srhIL-4R重組基因片段。合成序列采用PCR進(jìn)行擴(kuò)增，依據(jù)參照文獻(xiàn)[2]擴(kuò)增srhIL-4R基因引物，略有改動，srhIL-4R-Forward：5’-CGCCATATGCATGAAGGTCTTGCAGGAGC-3’（下劃線表示Nde I酶切位點），srhIL-4R-Reverse：5’-CTCGAGCGGGTGCTGCTCGAAGGGCTC-3’（下劃線表示Xho I酶切位點）。采取膠回收試劑盒回收目的片段，再連接pMD18-T克隆載體后轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞，并將DH5α鋪于氨芐青霉素的固體LB培養(yǎng)基（含50mg/L）中，37℃培養(yǎng)12～16h。

1.2.2 構(gòu)建重組載體pET-28a（+）-srhIL-4R 挑單個大腸桿菌DH5α菌落提取質(zhì)粒DNA，用Nde I和Xho I進(jìn)行雙酶切并純化回收srhIL-4R重組基因片段和pET-28a（+）載體，并進(jìn)行膠回收目的片段，在16℃進(jìn)行連接成重組載體pET-28a（+）-srhIL-4R，將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化感受態(tài)DH5α，涂在含有卡拉霉素的LB固體培養(yǎng)基（含50mg/L）平板中37℃培養(yǎng)18h。挑取單個菌落采用Nde I和Xho I進(jìn)行雙酶切鑒定，將酶切為陽性菌落送生物公司測序。

1.2.3 表達(dá)重組蛋白srhIL-4R將測序正確的菌落進(jìn)行抽提質(zhì)粒pET-28a（+）-srhIL-4R 轉(zhuǎn)化E.coli BL21（DE3）涂于LB含50mg/L卡拉霉素固體培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)，挑取PCR鑒定為陽性的菌落到20mL 含50mg/L卡拉霉素，1mmol/L IPTG的液體LB培養(yǎng)液中進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)重組人可溶性白細(xì)胞介素-4受體(srhIL-4R)。

1.2.4 十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDSPAGE） 從37℃培養(yǎng)2～3h的菌液中取出1mL離心取菌體，加入180μL細(xì)菌裂解液（含PMSF1.8μL）重懸菌體，置于冰上30min，10 000×g，4℃離心15min，取上清和沉淀物加入適量的蛋白上樣緩沖液煮沸5min，分別進(jìn)行SDS-PAGE并進(jìn)行考馬斯亮藍(lán)染色。

1.2.5 蛋白質(zhì)印跡（Western-blotting） 確定srhIL-4R在菌體表達(dá)的最佳條件后再進(jìn)行大量表達(dá)，提取表達(dá)產(chǎn)物并采用Ni柱純化表達(dá)蛋白進(jìn)行SDSPAGE，割取目的蛋白膠條進(jìn)行半干式轉(zhuǎn)印，取出硝酸纖維素膜條進(jìn)行Western-blotting分析。采用0.01 mol/L PBS（pH=7.2）洗膜；加入包被液進(jìn)行孵育，洗膜后加入一抗（鼠抗IL-4R血清，1：500稀釋）進(jìn)行孵育，洗膜后，加入二抗羊抗鼠辣根過氧化物酶偶聯(lián)IgG（1：8000 PBS稀釋）進(jìn)行反應(yīng)，洗膜后加入顯色液（TMB Substrate）進(jìn)行避光顯色，直到出現(xiàn)清晰條帶后加蒸餾水中終止顯色反應(yīng)。

1.2.6 srhIL-4R干預(yù)哮喘模型大鼠 依據(jù)參考文獻(xiàn)[3]，將60只SD大鼠隨機(jī)為空白對照組、模型組、布地奈德西藥組和重組蛋白srhIL-4R組，各15只。模型組、西藥組和srhIL-4R組實驗大鼠采用在腹部皮下三處注射10%OVA（含OVA 100mg、AL（OH）3100mg）與滅活的百日咳桿菌（5×109個/mL）的混合液1mL進(jìn)行致敏1周，空白對照組在腹部皮下三處注射生理鹽水1mL。共致敏2次，每次間隔1周，第2次致敏1周后進(jìn)行激發(fā)。分別把模型組、布地奈德西藥組和SrhIL-4R組的實驗大鼠放入封閉的箱中，濃度為5%OVA用超聲霧化器進(jìn)行激發(fā)30min，持續(xù)10天；空白對照組用生理鹽水進(jìn)行霧化處理。

依據(jù)參考文獻(xiàn)[4]，每次霧化激發(fā)前30min，對西藥組大鼠腹腔注射0.5mL布地奈德稀釋液，srhIL-4R組大鼠用0.5mL的IL-4R重組蛋白（1g/L）稀釋液，空白對照和模型組大鼠分別注射0.5mL的生理鹽水。最后一次激發(fā)4h后處死大鼠，取肺進(jìn)行組織切片病理學(xué)觀察。

2 結(jié) 果

2.1 PCR擴(kuò)增與克隆 合成srhIL-4R基因片段用引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，經(jīng)1.2%瓊脂糖電泳得到在500bp～750bp之間的條帶，與預(yù)期擴(kuò)增片段長度相似，見圖1（封二）。

2.2 酶切鑒定 pET-28a（+）-srhIL-4R載體經(jīng)Nde I和Xho I雙酶切鑒定得到500bp～750bp的目的片段，結(jié)果表明srhIL-4R基因片段已插入pET-28a（+）載體，見圖2（封二）。選擇雙酶切鑒定為陽性菌落送生物公司測序，其測序結(jié)果與GenBank中公布的sIL-4R序列（XM_005255309）同源性達(dá)100%，提示srhIL-4R成功插入表達(dá)載體。

2.3 SDS-PAGE和Western-blotting分析 上清和沉淀物分別進(jìn)行SDS-PAGE分析，結(jié)果顯示目的蛋白主要以包涵體形式存在，純化后進(jìn)行SDS-PAGE發(fā)現(xiàn)表達(dá)蛋白大小接近25kDa，而含空載體的細(xì)菌沉淀物經(jīng)誘導(dǎo)后無條帶出現(xiàn)。割取目的膠條進(jìn)行Western-blotting分析，發(fā)現(xiàn)含pET-28a（+）-srhIL-4R菌表達(dá)產(chǎn)物在大小接近25kDa出現(xiàn)條帶，而空載體pET-28a（+）菌表達(dá)產(chǎn)物在大小接近25kDa沒有出現(xiàn)條帶，見圖3（封二）。

2.4 IL-4R干預(yù)過敏性哮喘大鼠的病理觀察 模型組大鼠出現(xiàn)呼吸加深加快，點頭張口呼吸、毛色黯淡無光、反應(yīng)遲鈍、出現(xiàn)抓臉現(xiàn)象，聽診有哮鳴音；而正常組、srhIL-4R組和布地奈德西藥組大鼠則正常。肺組織病理切片顯示，正常組SD大鼠未見炎細(xì)胞浸潤，肺泡大小正常見，見圖4（封二）；模型組可見嗜酸性粒細(xì)胞、漿細(xì)胞和單核細(xì)胞等炎性細(xì)胞浸潤，見圖5（封二）；與模型組比較，srhIL-4R組和布地奈德西藥組肺組織嗜酸性粒細(xì)胞、漿細(xì)胞和單核細(xì)胞等炎細(xì)胞數(shù)量明顯減少，見圖6～7（封二）。

3 討論

重組蛋白是利用基因重組技術(shù)，重新排列目的基因，構(gòu)建重組表達(dá)載體利用原核或真核表達(dá)系統(tǒng)以表達(dá)出來的具有目的基因特異性作用的蛋白，在生命科學(xué)領(lǐng)域有著極其重要的價值。IL-4是引起哮喘的關(guān)鍵細(xì)胞因子之一，sIL-4R是其拮抗劑，可以緩解或抑制哮喘的發(fā)生發(fā)展[5-6]，因此srhIL-4R重組蛋白表達(dá)的成功與否是本研究順利進(jìn)行的關(guān)鍵。本研究委托上海吉爾吉斯生物工程有限公司合成srhIL-4R基因片段轉(zhuǎn)入pET-28a（+）表達(dá)載體轉(zhuǎn)化表達(dá)菌株BL21（DE3）表達(dá)進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)。

肺組織中嗜酸性粒細(xì)胞、漿細(xì)胞和單核細(xì)胞等炎性細(xì)胞的大量浸潤是哮喘發(fā)生時的特異性病理改變，且病理觀察簡單直觀，故以此作為大鼠哮喘模型成功與否及藥物布地奈德治療和srhIL-4R重組蛋白干預(yù)哮喘模型的參考指標(biāo)。

編碼可溶性白細(xì)胞介素-4受體蛋白基因（IL-4Rα）在哮喘的發(fā)病中有著不可忽視的作用[5]。當(dāng)IL-4Rα鏈第 576位谷氨酰胺被精氨酸所代替（Q576R），而Q576R基因多態(tài)性能夠選擇性增強(qiáng)IL-4Rα鏈信號作用，從而加重哮喘癥狀[4]。已經(jīng)證實人類IL-4Rα單克隆抗體在治療重癥哮喘方面體現(xiàn)出了一定的效果[7]。重組蛋白較之單克隆抗體具有更強(qiáng)的治療作用及更少的副作用，且穩(wěn)定性更強(qiáng)。

本研究結(jié)果顯示，srhIL-4R組大鼠嗜酸性粒細(xì)胞等細(xì)胞數(shù)量較模型組明顯減少，進(jìn)一步證實，本次實驗成功表達(dá)的活性srhIL-4R重組蛋白在預(yù)防和治療哮喘中具有一定作用，為哮喘患者的臨床免疫靶向治療提供一定的前期工作基礎(chǔ)，具有較大的參考價值。

［1］Zavorotinskaya T，Tomkinson A，Murphy JE.Treatment of experimental asthma by long-term gene therapy directed against IL-4 and IL-13［J］.Mol Ther，2003，7（2）：155-162.

［2］張勇，王渭池，李元.人可溶性白介素-4受體（sIL-4R）在大腸桿菌中的表達(dá)和純化［J］.中國生物化學(xué)與分子生物學(xué)報，2004，20（6）：778-784.

［3］龔萍.大鼠哮喘模型的改良與評價［D］.中南大學(xué)，2010.

［4］Taehdjian R，Mathias C，Alkhatib S，et al.Pathogenicity of a disease associated human IL-4 receptor allele in experimental asthma［J］.J Exp Med，2009，206（10）：2191-2204.

［5］楊光勇，郭海濤，何光志.白細(xì)胞介素-4及其受體的研究現(xiàn)狀［J］.浙江中西醫(yī)結(jié)合雜志，2014，9（24）：843-845.

［6］張婉瑩，姜曉峰，梁紅艷，等.支氣管哮喘的細(xì)胞因子治療進(jìn)展［J］.國際免疫學(xué)雜志，2012，35（1）：64-66.

［7］Nishikubo K，Murata Y，Tamaki S，et al.A single administration of interleukin-4 antagonistic mutant DNA inhibits allergic airway inflammation in a mouse model of asthma［J］. Gene Ther，2003，10（26）：2119-2125.

（收稿：2015-11-07 修回：2015-12-23）

Recombinant Soluble Human Interleukin-4 Receptor Protein Inhibiting Rat Asthma Model

YANG Guangy-ong,GUO Haitao,LIU Ximing,HE Guangzhi,TIAN Weiyi,CAI Kun,WANG Ping,LIANG Jiandong,WANG Wenjia,HAN Jie. Department of BasicMedical Sciences,Guiyang Collegeof Traditional ChineseMedicine, Guiyang(550002),China

ObjectiveTo investigate the effect of recombinant soluble human interleukin-4 receptor（srhIL-4R）in the asthma model.MethodsThe Homo sapiens（human）interleukin-4 receptor gene was synthesized according to the sequence of the GenBank（XM_005255309）,the synthesis of gene fragment was cloned into pET-28a（+）vector to construct the recombinant expression vector pET-28a（+）-srhIL-4R.The expression plasmid was induced into E.coli BL21（DE3）and expression strain was selected,the recombinant was analyzed by SDS-PAGE and Western-blotting.Rat using an ovalbumin（OVA）-induced model of allergic asthma was conducted with the recombinant soluble human interleukin-4 receptor proteins,and lung tissue from model of allergic asthma was taken for pathology observation.Results500bp-750bp target fragment was obtained by restricted enzyme,SDS-PAGE and western-blotting analysis results of the recombinant protein was about 25 kDa.Compared with model group,allergic asthma intervention decreased significantly in inflammatory cells.ConclusionSrhIL-4R has a certain effect in the prevention and treatment of asthma.

rat;asthma model;recombinant soluble human interleukin-4 receptor;recombinant proteins

2011年貴州省社會發(fā)展科技攻關(guān)項目[No.黔科合SY字（2011）3020]；2014年度貴陽中醫(yī)學(xué)院“2011協(xié)同創(chuàng)新中心”和貴州省委組織部高層次人才科研條件特助經(jīng)費項目（No.TZJF-2011年28號）

貴陽中醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院（貴陽 550002）

何光志，E-mail：heguangzhi7711@sina.com；Tel：13809430436