韓知忖劉 冰周 輝

人參皂苷Rg1對神經(jīng)細胞衰老和衰老相關(guān)異染色質(zhì)聚集的影響

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目的探討人參皂苷Rg1預處理對三丁基過氧化氫（t-BHP）誘導的神經(jīng)細胞衰老及異染色質(zhì)聚集（SAHF）的影響。方法常規(guī)培養(yǎng)Neuro-2a細胞株，在造模藥物刺激前，給予不同劑量的人參皂苷Rg1，同時設(shè)置模型對照組、正常對照組。進行細胞活力檢測、衰老相關(guān)半乳糖苷酶染色、衰老相關(guān)異染色質(zhì)聚集檢測。結(jié)果人參皂苷Rg1預處理可改善t-BHP誘導的細胞活力降低，此改善呈劑量依賴性；人參皂苷Rg1預處理各組，SA-β-gal染色細胞陽性數(shù)呈劑量依賴性降低；人參皂苷Rg1預處理可預防t-BHP誘導的SAHF形成，呈顯著劑量依賴性。結(jié)論人參皂苷Rg1預處理可劑量依賴性地預防神經(jīng)細胞衰老，防止異染色質(zhì)聚集，有必要進一步研究。

Neuro-2a細胞；人參皂苷Rg1；細胞衰老；衰老相關(guān)異染色質(zhì)聚集

隨著老齡化不斷推進，以帕金森病和阿爾采默病為代表的衰老相關(guān)神經(jīng)變性疾病的發(fā)病率及致殘率逐年升高[1]。細胞衰老（cellular senescence）參與帕金森病、阿爾采默病等神經(jīng)退行性疾病的發(fā)生發(fā)展，并與氧化應激、端?？s短等因素有關(guān)[2]。本文采用三丁基過氧化氫（t-BHP）制備Neuro-2a細胞衰老模型，考察人參皂苷Rg1預處理對神經(jīng)細胞衰老及衰老相關(guān)異染色質(zhì)聚集的影響，為闡明人參皂苷Rg1抗衰老機制提供可靠的理論和實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗材料和試劑 Neuro-2a（N2a）細胞株(上海遠慕生物科技有限公司，批號YM-CS0050）；MEM基礎(chǔ)培養(yǎng)基（Hyclone公司，批號SH30022.01B）；FBS胎牛血清（GIBCO公司，批號16400-044）；雙抗（北京夏斯生物科技有限公司，批號SV30010）；t-BHP（阿拉丁，批號B106035-1L）；CCK8檢測試劑盒（Dojindo公司，批號 CK04）；SA-β-gal檢測試劑盒（Cell Signaling，批號9860）；H3K9me3抗體（Abcam，批號ab8898）；4%多聚甲醛（北京索萊寶科技有限公司，批號P1110）；PBS（北京索萊寶科技有限公司，批號SH30256）；正常羊血清封閉液（北京索萊寶科技有限公司，批號SL2-10）；新鮮配制的3%H2O2；Triton X-100（Sigma，批號T9284）；人參皂苷Rg1（上海遠慕生物科技有限公司，批號YM635B）；低速離心機（上海貝恩生物科技有限公司，批號TDZ4B-WS）；CO2培養(yǎng)箱（上海博訊，批號BC-J160S）；超凈工作臺（上海博訊，型號SW-CJ-2FD）；酶標儀（Thermo，型號MULTISKAN MK3）。

1.2 實驗方法

1.2.1 細胞培養(yǎng)與分組 參照文獻[3]方法，取N2a細胞，常規(guī)培養(yǎng)，分6組處理如下：空白對照組：僅傳代6代，不給予t-BHP處理；模型對照組：傳代6代后，以100μMt-BHP處理；人參皂苷Rg1預處理4組：分別以 5μMRg1+100μMt-BHP、10μMRg1+100μMt-BHP、20μMRg1+100μMt-BHP、40μMRg1+100μMt-BHP處理，各組以相應濃度的Rg1EMEM培養(yǎng)N2a細胞，傳代6代后用t-BHP處理4次，隔代作用1次，每次1h，末次作用后，換新鮮培養(yǎng)液培養(yǎng)24～48h后收獲細胞。

1.2.2 CCK-8檢測 參照文獻[4]方法，取各組細胞，以5×103/孔的密度鋪入96孔板內(nèi)，每孔加培養(yǎng)液至終體積100μL，作用24h、48h、72h后，每孔加入10μL CCK-8反應液，孵育1～4h，用酶標儀在450nm處測定吸光度。

1.2.3 SA-β-gal染色 參照文獻[5]方法，在六孔板中預先置入已鋪多聚賴氨酸的1.8cm×1.8cm玻璃蓋片，取各組細胞，按700/cm2的細胞密度接種，常規(guī)培養(yǎng)24h，次日取出蓋片，用4℃ PBS沖洗細胞2次，4℃ 2%甲醛0.2% 戊二醛固定5min，PBS沖洗細胞2次；用SA-β-gal反應液37℃孵育3～4h，然后用雙蒸水沖洗2次，后固定4min；沖洗，核固紅染色細胞核，脫水，透明，封固。光學顯微鏡下觀察、計數(shù)。

1.2.4 衰老相關(guān)異染色質(zhì)聚集（senescence-associated heterochromatic foci，SAHF）檢測 參照文獻[6]方法，在六孔板中預先置入已鋪多聚賴氨酸的1.8cm× 1.8cm玻璃蓋片，取各組細胞，按700/cm2的細胞密度接種，常規(guī)培養(yǎng)24h，次日取出蓋片，用4℃ PBS沖洗細胞2次，4℃ 4%甲醛固定15min，0.1%Triton X-100處理切片15min，使細胞固定且通透性增加，用PBS沖洗玻片，再用10%的胎牛血清封閉30min，然后滴加一抗（H3K9me3），常溫孵育1h，PBS沖洗，滴加熒光二抗，常溫孵育2～3h，PBS沖洗，加入DAPI染液復染，反應5min，PBS浸泡5min，清洗，晾干，加防淬滅樹膠，激光共聚焦顯微鏡下觀察H3K9me3在細胞核中的分布，以考察人參皂苷Rg1預處理對SAHF形成的影響。

2 實驗結(jié)果

2.1 細胞活力 CCK-8檢測結(jié)果顯示，人參皂苷Rg1預處理可改善t-BHP誘導的細胞活力降低，且此種改善呈劑量依賴性，見圖1（封四）。

2.2 SA-β-gal染色 人參皂苷Rg1預處理各組，SA-β-gal染色細胞陽性數(shù)呈劑量依賴性降低，見圖2（封四）。

2.3 SAHF形成 人參皂苷Rg1預處理可預防t-BHP誘導的SAHF形成，呈顯著劑量依賴性，其中尤以20μM、40μM效果最為顯著，見圖3（封四）。

3 討 論

SAHF是衰老細胞特有的異染色質(zhì)聚集現(xiàn)象，衰老細胞的核仁變大，DNA呈點狀聚集分布，是細胞衰老的一個新的生物學標志。p16/Rb途徑、組蛋白H2A變異體macroH2A、高遷移率蛋白A（HMGA proteins）、組蛋白甲基轉(zhuǎn)移酶SUV39（誘導H3 Lys9 （H3K9）三甲基化）、組蛋白去乙?；窰DAC1等均參與SAHF的形成[7-8]。

人參是我國傳統(tǒng)名貴中藥，有抗衰老、抗氧化、益智及保護神經(jīng)元免受毒性物質(zhì)損傷等作用。人參皂苷Rgl對神經(jīng)毒素誘導的帕金森病細胞及動物模型均有抗氧化作用。Rgl通過調(diào)節(jié)p16/Rb、p21、cyclin D等細胞周期調(diào)控因子表達等機制發(fā)揮其抗細胞衰老作用[9-11]。本研究結(jié)果提示，人參皂苷Rg1預處理可劑量依賴性地預防神經(jīng)細胞衰老，防止異染色質(zhì)聚集。

本文采用t-BHP制備N2a細胞衰老模型，考察人參皂苷Rg1預處理對神經(jīng)細胞衰老的保護作用，采用CCK-8評價Rg1對細胞活力的影響，采用SA-β-gal染色考察Rg1對細胞衰老的影響，并探討Rg1 對SAHF這一較為新穎的細胞衰老分子生物學標記的影響。CCK-8測試結(jié)果提示，人參皂苷Rg1預處理可劑量依賴性地改善t-BHP誘導的細胞活力下降；此外，隨著處理時間的延長，不同劑量組之間的改善效果差異加劇，如在24h、48h，20μM與40μM兩組吸光度值差異不明顯，但在72h時，兩者差異顯著。SA-β-gal染色結(jié)果提示，人參皂苷Rg1預處理可劑量依賴性降低陽性細胞數(shù)，表明人參皂苷Rg1可預防模型藥物誘導的細胞衰老，其中尤以40μM效果最為顯著。SAHF染色結(jié)果提示，人參皂苷Rg1預處理可預防t-BHP誘導的SAHF形成，且呈顯著劑量依賴性，其中尤以20μM、40μM效果最為顯著。以上研究結(jié)果表明，人參皂苷Rg1預處理可劑量依賴性地預防t-BHP誘導的細胞衰老與SHAF形成。鑒于SHAF為一較為新穎的細胞衰老干預靶標，有必要有針對性地深入探討其作用機制，為人參皂苷Rg1的臨床應用提供更多的科學依據(jù)。

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（收稿：2015-09-15 修回：2015-10-29）

Effects of Ginsenoside Rg1 on Senescent Nerve Cells and Senescence-Associated Heterochromatic Foci

HANZhicun1,LIU Bing2,ZHOU Hui3. 1 Department of Tuina,Tongde Hospital of Zhejiang Province,Hangzhou(310012), China;2 Laboratory of Basic Medicine,Zhejiang Province Academy of Traditional Chinese Medicine,Hangzhou (310007),China;3 Department of Orthopedics,Hangzhou Chinese Medical University,Hangzhou(310007),China

ObjectiveTo investigate whether ginsenoside Rg1 prevents oxidative-stress-induced cellular senescence and senescence-associated heterochromatic foci（SAHF）in Neuro-2a cells.MethodsSenescent Neuro-2a cells induced by tBHP（t-butylhydroperoxide）were treated in advance with ginsenoside Rg1.Healthy Neuro-2a cells and senescent Neuro-2a cells without ginsenoside Rg1 pretreatment serviced as controls.Senescence-associated β-galactosidase（SA-beta-gal）activity,cell viability and SAHF were examined.Results In a dose-dependent manner,ginsenoside Rg1 enhanced cell viability,decreased the number of SA-beta-gal positive cells,and decreased SAHF formation.ConclusionGinsenoside Rg1 protects Neuro-2a cells from tBHP-induced senescence and decreases SAHF.

Neuro-2a cells;ginsenoside Rg1;cellular senescence;senescence-associated heterochromatic foci

浙江省自然科學基金資助項目（No.Y2100169）

1浙江省立同德醫(yī)院針灸推拿科（杭州 310012）；2浙江省中醫(yī)藥研究院基礎(chǔ)實驗所（杭州 310007）；3杭州市中醫(yī)院骨傷科（杭州 310007）

劉冰，E-mail：gene112@163.com