200092 上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬新華醫(yī)院呼吸內(nèi)科

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·綜述·

間充質(zhì)干細胞治療呼吸系統(tǒng)疾病的研究進展

顧問郭雪君徐衛(wèi)國

200092 上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬新華醫(yī)院呼吸內(nèi)科

【關(guān)鍵詞】間充質(zhì)干細胞；治療；呼吸系統(tǒng)疾??；分子機制

在呼吸系統(tǒng)疾病中，支氣管哮喘、慢性阻塞性肺疾病、急性呼吸窘迫綜合征和特發(fā)性肺纖維化等，通常均以炎癥細胞浸潤、細胞因子釋放、上皮細胞受損以及氣道重塑和肺組織纖維化等為特征。雖然在急性期，肺組織具有一定自我修復(fù)能力，但隨著病程的反復(fù)遷延，相當(dāng)一部分患者最終都會發(fā)生氣道重構(gòu)、肺組織結(jié)構(gòu)破壞或纖維化，導(dǎo)致肺功能損害。

常規(guī)的藥物治療對氣道和肺上皮細胞破壞性修復(fù)和肺纖維化逆轉(zhuǎn)并無顯著作用。目前發(fā)現(xiàn)間充質(zhì)干細胞(mesenchymal stem cell, MSC)具有抗炎、改善肺氣腫，抗細胞凋亡，具有一定的上皮修復(fù)作用。MSC的潛在治療作用正在不斷地被探索和發(fā)現(xiàn)，而干細胞臨床安全性和有效性試驗也正在進行中。因此，本文就MSC在呼吸系統(tǒng)疾病中的作用及可能的機制作一綜述，為干細胞臨床治療提供依據(jù)。

一、干細胞的特征

干細胞是一類具有較強分化功能的細胞，可以分化成內(nèi)皮細胞、上皮細胞、脂肪細胞和軟骨細胞等各種類型的細胞[1]。干細胞按分化潛能分為全能干細胞、多能干細胞和單能干細胞，按發(fā)育階段分為胚胎干細胞和成體干細胞。成體干細胞來源廣泛，存在于骨髓、肝、脾、肺、神經(jīng)、表皮、肌肉、腎臟、臍血、脂肪等多種組織和器官的間質(zhì)。骨髓是成體干細胞的一個主要來源，骨髓中主要含有兩類細胞，造血干細胞(hematopoietic stem cells, HSC)和 MSC。

MSC是研究得最為廣泛的一類干細胞，但其生物學(xué)功能尚不完全明確。目前已知的生物學(xué)特性包括：①自我更新：間充質(zhì)干細胞具有高度增殖和自我更新的能力; ②多向分化潛能：骨髓來源的間充質(zhì)干細胞是一類具有貼壁功能的，形態(tài)呈長梭形的，成纖維細胞樣集落生長的一類細胞，間充質(zhì)干細胞具有多向分化潛能，可以分化成脂肪細胞、骨細胞、心肌細胞、神經(jīng)元和星形膠質(zhì)細胞[2]，其分化與局部微環(huán)境密切相關(guān); ③低免疫原性：MSC有特殊的細胞表型。它表達表面抗原CD105，CD73和CD90，缺乏造血細胞的表面抗原CD45，CD34，CD14，CD11b，CD79，CD19和HLA-DR，低表達Ⅰ類人白細胞抗原(human leukocyte antigen, HLA)分子，不表達Ⅱ類HLA分子，因此這使得T 細胞活化的第二信號喪失，不能誘導(dǎo)同種異體免疫反應(yīng)?？梢奙SC具有低免疫原性，逃避宿主攻擊，具有一定的免疫調(diào)節(jié)的作用，為臨床安全應(yīng)用干細胞治療提供可能[3]。

由于MSC的自我更新和多向分化功能，使其具備了組織修復(fù)和細胞再生的能力。而MSC的低免疫原性，使其逃避了免疫反應(yīng)，是發(fā)揮治療作用的重要基礎(chǔ)。MSC在疾病中的治療作用，涉及心、腦、肝、骨骼等全身各個重要臟器，在動物實驗階段已取得一定成果[4-5]。肺組織具有結(jié)構(gòu)特殊性，毛細血管床豐富，高容量、低阻力，MSC輸入后易在肺內(nèi)發(fā)生滯留，因此也為MSC治療呼吸系統(tǒng)疾病提供有利條件[6]。在呼吸系統(tǒng)疾病中，MSC的治療作用已經(jīng)在急性肺損傷、哮喘、慢性阻塞性肺疾病、肺癌、肺炎和特發(fā)性肺纖維化的疾病動物模型中得到了證明。臨床安全性及有效性實驗也正在進行中。

二、干細胞治療的分子機制

1. 細胞分化: 干細胞具有較強的分化能力，可以分化成特定的細胞系，呈現(xiàn)特定細胞表型。以往研究認(rèn)為，細胞分化是干細胞發(fā)揮治療作用的主要途徑。干細胞的分化途徑有內(nèi)源性分化和外源性分化兩條途徑：①內(nèi)源性干細胞分化：自體MSC在組織原位或者通過血液循環(huán)到達靶器官進行分化、發(fā)揮修復(fù)作用。在肺組織原位的肺上皮基底干細胞，可以分化成上皮細胞替代衰老和損傷的細胞進行修復(fù)[7-8]；②外源性干細胞分化：外源輸入的MSC可以遷移到肺組織，在損傷部位聚集，分化成特定的細胞[9]。MSC可以分化成肺上皮細胞，革蘭氏陰性桿菌細胞壁成分脂多糖LPS可以誘導(dǎo)MSC在肺內(nèi)富集，在損傷部位轉(zhuǎn)化成上皮細胞或者內(nèi)皮細胞[10-11]。MSC也可以是血管的前體細胞型，對肺組織的微血管重構(gòu)及抗氧化應(yīng)激都有一定作用[12]。

2. 旁分泌: 干細胞分化有一定時限性，因此不能完全解釋干細胞在體內(nèi)的持續(xù)治療作用。隨著研究的進一步深入，更多的研究結(jié)果表明干細胞可以通過旁分泌機制發(fā)揮作用，并且在急性呼吸窘迫綜合征、肺炎、哮喘和慢性阻塞性肺病等疾病模型中都得到驗證。

旁分泌是指細胞分泌調(diào)節(jié)因子，彌散至細胞間隙或組織液，對鄰近的靶細胞進行調(diào)節(jié)的一種作用方式。研究發(fā)現(xiàn)，MSC通過旁分泌發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)作用。MSC在局部分泌血管內(nèi)皮生長因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)，起到肺組織修復(fù)和血管重建的作用[13]；MSC分泌Bcl-2蛋白，發(fā)揮抗凋亡作用[14]；MSC分泌INF-γ、IL-10、HGF等細胞因子，發(fā)揮抗炎的作用[15]；MSC分泌纖維黏連蛋白(fibronectin)、骨膜蛋白(peristin)等，影響肺泡上皮細胞和氣道上皮細胞的遷移，發(fā)揮修復(fù)作用[16]。在這些研究中，發(fā)揮治療作用的是MSC分泌的一系列細胞因子。因此，使用MSC培養(yǎng)液同樣可起到組織修復(fù)和血管重建的作用[17]。由此可見，MSC對近旁組織修復(fù)的重要機制是旁分泌作用。

3. 載體作用: MSC具有低免疫原性，可以逃避宿主攻擊，因而逐漸開始被作為一種載體，攜帶其他目基因或介質(zhì)進行輸注治療。將攜帶角化生長因子(keratinocyte growth factor, KGF)基因的質(zhì)粒轉(zhuǎn)入MSC后進行體內(nèi)輸注，可以明顯抑制肺部炎癥，改善微循環(huán)。MSC作為載體發(fā)揮的作用，優(yōu)于慢病毒載體等其他載體的作用[18]。而MSC的免疫逃避和對腫瘤組織的趨向性，更是發(fā)揮抗腫瘤作用必不可少的[19-20]。

根據(jù)出錯因子—未發(fā)現(xiàn)報警或征兆，對出錯因子按照認(rèn)知特點(感知錯誤、認(rèn)知失效、疏忽、記憶失誤、知覺混淆)進行分析，將其歸類到認(rèn)知層中的疏忽層，由設(shè)計人員針對該層以及警報界面的特點提出了7個評價因素(元素色彩的適宜性a、字符的規(guī)范性b、圖標(biāo)意義的明確性c、縮寫詞使用的合理性d、標(biāo)簽使用的適宜性e、顯示方式的適當(dāng)性f、邊框箭頭的適當(dāng)性g)，從而建立了基于出錯因子的交互界面的評價模型，如圖3所示。

4. 細胞間相互作用: 早期也有學(xué)者提出干細胞治療的機制是通過細胞間相互作用。早在2002年，Nature上有數(shù)篇文章發(fā)表，認(rèn)為干細胞發(fā)揮修復(fù)作用是由于與宿主細胞發(fā)生基因融合，而并非是由于干細胞本身的分化所致。Wang等[21- 22]分別在肝臟細胞的修復(fù)研究中得到了相似的研究結(jié)果。Ferrand等[23]研究發(fā)現(xiàn)干細胞被賦予胃腸上皮細胞的特性是由于發(fā)生了基因融合。Silk等[24]發(fā)現(xiàn)造血干細胞可以與腸上皮細胞發(fā)生融合，解釋了在非造血干細胞檢測到干細胞基因表型的原因?？梢娂毎l(fā)生基因融合，使得干細胞表現(xiàn)出特定細胞的形態(tài)特征和基因表型，也可能是干細胞治療的分子機制之一，但隨后的很多年，沒有相類似的機制研究的報道。

近年來，干細胞直接作用于靶細胞的機制研究，仍是一大熱點。MSC作為一種抗原提呈細胞，通過細胞與細胞間的縫隙連接，將線粒體等細胞器轉(zhuǎn)移至靶細胞發(fā)揮調(diào)節(jié)作用[25-26]。將多能干細胞(induced pluripotent stem cells, IPS)誘導(dǎo)的MSC細胞的線粒體轉(zhuǎn)移至煙熏受損的氣道上皮細胞，可以明顯修復(fù)細胞[27]。

MSC增加調(diào)節(jié)性T細胞(regulatory T cells, Tregs)的比例，升高體內(nèi)Th1型細胞、降低Th2型細胞的比例，抑制氣道炎癥[28]。MSC直接作用于巨噬細胞，促進巨噬細胞分泌細胞因子IL-10，或通過調(diào)節(jié)巨噬細胞促進其他效應(yīng)細胞產(chǎn)生IL-10，發(fā)揮抗炎作用[29]。MSC可以激活單核巨噬細胞系統(tǒng)，這在急性心肌梗死的心肌細胞修復(fù)中已有發(fā)現(xiàn)[30]。所以細胞間相互作用，可能是干細胞治療的一種直接的、高效的作用機制。

三、干細胞治療在呼吸系統(tǒng)疾病中的應(yīng)用

1. 急性肺損傷: 急性肺損傷(acute lung injury, ALI)是一類累及肺泡上皮細胞和毛細血管內(nèi)皮細胞的疾病，血管通透異常增加，肺泡腔蛋白沉積，反復(fù)炎癥及肺纖維化發(fā)生。MSC肺內(nèi)輸入可以減輕博來霉素所致的肺部炎癥和膠原沉積，減輕肺纖維化[31]。在急性肺損傷大鼠模型中，分別使用經(jīng)氣道注射和尾靜脈注射兩種方法輸入MSC后都可以減輕肺部炎癥，改善肺功能，可能的機制是通過旁分泌KGF實現(xiàn)的[32-34]。Martinez-Gonzalez等[35]研究發(fā)現(xiàn)，MSC過表達IL-33的拮抗劑白介素-1受體樣1(IL-1 recpeptor-like-1)可以減輕肺部炎癥，減少蛋白外滲，減少中性粒細胞和炎癥因子TNF-α，IL-6和巨噬細胞炎癥蛋白-2(macrophage inflammation protein 2, MIP-2)的產(chǎn)生。

2. 支氣管哮喘: MSC對哮喘(asthma)的治療作用，主要是通過免疫調(diào)節(jié)和抗炎來實現(xiàn)的。哮喘動物模型中的實驗結(jié)果表明，MSC肺內(nèi)注入可以通過調(diào)節(jié)Th1細胞、Th2細胞和Tregs細胞的比例來減輕哮喘的氣道炎癥。MSC可產(chǎn)生TGF-β以及富集Tregs，減少Th2型細胞因子的產(chǎn)生[36]；MSC可產(chǎn)生IFN-γ減輕Th2型氣道炎癥反應(yīng)[28, 37]；在CD4+T細胞分化過程中，MSC可以抑制Th1和Th17細胞的產(chǎn)生，增加CD4+CD25+FOXP3+調(diào)節(jié)性T細胞的比例[38-39]。

上述這些研究都側(cè)重于哮喘的氣道炎癥和免疫調(diào)節(jié)方面，而另一些研究也涉及了對哮喘的氣道高反應(yīng)以及肺功能的改善情況。在中性粒細胞哮喘動物模型中研究發(fā)現(xiàn)，MSC通過抑制Th17信號通路降低氣道高反應(yīng)性[40]。在Mathias等[29]的研究中，MSC可以抑制氣道炎癥和氣道高反應(yīng)性，主要通過直接作用于巨噬細胞促其分泌IL-10。但在巨噬細胞去除后，MSC的治療作用幾乎消失，表明巨噬細胞可能是干細胞治療哮喘的效應(yīng)細胞之一。

3. 慢性阻塞性肺疾病: 慢性阻塞性肺疾病(chronic obstructive pulmonary disease, COPD)是呼吸系統(tǒng)疾病中高致死并且嚴(yán)重影響人類生存質(zhì)量的一大疾病。由于目前仍缺乏有效的治療方法，干細胞治療COPD也逐漸成為一大熱點。MSC治療在COPD疾病動物模型中已經(jīng)獲得了明確的有效性。MSC的作用主要集中在幾個方面：①MSC可以減輕氣道炎癥，抑制炎癥因子IL-1β，TNF-α和IL-8等分泌，減輕炎癥所致的氧化應(yīng)激，抗凋亡[14-15]；②MSC可以促進生長因子，如KGF、干細胞生長因子(hepatocyte growth factor, HGF)和上皮生長因子(epidermal growth factor，EGF)等分泌，促進組織修復(fù)作用，增加肺灌注[13, 15, 41]；③MSC可改善肺血管重構(gòu)，改善肺功能。Chow等[12]研究發(fā)現(xiàn)，MSC通過Wnt/beta-catenin信號通路改變肺血管重構(gòu)，改善肺功能。在大部分COPD動物模型中驗證，MSC具有抗炎、抗氧化應(yīng)激、改變肺血管重構(gòu)、修復(fù)肺組織和改善肺功能等多方面的作用。以往研究認(rèn)為MSC治療COPD主要是通過旁分泌發(fā)揮作用，但是近年來也有研究認(rèn)為MSC直接作用于效應(yīng)細胞，即肺泡巨噬細胞發(fā)揮作用。Gu等[42]研究發(fā)現(xiàn)，MSC通過MAPK信號通路抑制肺泡巨噬細胞的COX-2分泌，發(fā)揮抗炎改善肺氣腫的作用。

4. 肺癌: 干細胞具有特殊的免疫耐受和免疫逃避功能，因此也被逐漸應(yīng)用于腫瘤治療中。早年，MSC就被發(fā)現(xiàn)可以在腫瘤組織周圍定位，但具體的機制和作用并不明確。隨后的研究發(fā)現(xiàn)，MSC表面有趨化因子受體，而腫瘤細胞釋放趨化因子，使MSC在腫瘤組織周圍聚集[43]。最新的研究發(fā)現(xiàn)了這類趨化因子，即巨噬細胞遷移抑制因子(macrophage migration inhibitory factor, MIF)和趨化因子CXCR4[44]。MSC特殊的腫瘤組織定位作用，是發(fā)揮其他功能的基礎(chǔ)。首先，它可以作為一種載體發(fā)揮抗腫瘤作用。高表達細胞因子IL-12的干細胞經(jīng)小鼠體內(nèi)輸注后，可以增加腫瘤特異性的T細胞反應(yīng)和抗腫瘤作用[45]。另外，MSC可以捕獲免疫細胞，使細胞停留在G0/G1期，抑制細胞分裂，減少了T細胞毒反應(yīng)和B細胞免疫反應(yīng)，激活調(diào)節(jié)性T細胞[46]。MSC還有直接的抗腫瘤作用。在肺癌轉(zhuǎn)移和乳腺癌轉(zhuǎn)移的患者中，經(jīng)靜脈或者腫瘤局部注射MSC，可以減緩腫瘤生長和轉(zhuǎn)移[47]。但是由于MSC極其復(fù)雜的免疫調(diào)節(jié)機制，所以同時也是一把雙刃劍。將腫瘤細胞生長停留在G0/G1期，反而增加了細胞的增殖儲備，減少在體內(nèi)的凋亡。MSC分泌的一些趨化因子、生長因子等也可能增加了腫瘤細胞的增殖和轉(zhuǎn)移[48]。MSC培養(yǎng)液可促進SGC-7901和HGC-27細胞系發(fā)生細胞增殖和淋巴管生成，促進腫瘤生長和轉(zhuǎn)移[49]。而MSC自身是否會分化為腫瘤細胞也是個懸而未決的問題。因此，MSC治療肺部腫瘤的有效性還有待進一步研究。

5. 其他: MSC對其他一些呼吸系統(tǒng)疾病也有治療作用。特發(fā)性肺纖維化(idiopathic pulmonary fibrosis, IPF)是一種不明原因的肺間質(zhì)纖維化性疾病，以彌漫性肺纖維化性肺泡炎為表現(xiàn)。IPF患者的MSC高表達間質(zhì)細胞來源因子-1(stromal cell-derived factor-1, SDF-1)和趨化因子受體CXCR4，這可能和MSC遷移到損傷部位修復(fù)有關(guān)[50]。Bitencourt等[51]的研究證實MSC具有抗炎、減少中性粒細胞浸潤、緩解膠原沉積和肺纖維化、修復(fù)上皮的作用。

MSC治療對細菌性肺炎(pneumonia)與膿毒敗血癥(sepsis)也有一定作用。研究表明MSC的抗菌蛋白lipocalin2表達增加因而具有抗菌活性，改善小鼠的肺炎，并增加生存率。給敗血癥小鼠靜脈注射人MSC，血單個核細胞和巨噬細胞的吞噬活性增強，生存率增加。同一模型的另一項研究表明，經(jīng)氣道注射的人MSC治療的小鼠，其細菌清除以及生存明顯延長，MSC治療組的肺泡灌洗液抗菌活性也明顯優(yōu)于對照組，可能的機制是MSC可以分泌抗革蘭氏陰性菌的抗菌肽段hCAP-18/LL-37。表明MSC有抗菌作用，并且可能和它分泌一些細胞因子、蛋白等有關(guān)。

支氣管肺發(fā)育不良(bronchopulmonary dysplasia, BPD)是一類肺泡發(fā)育不良所致的低氧損傷性疾病。給BPD小鼠肺內(nèi)輸入MSC可以修復(fù)肺間質(zhì)和血管損傷，主要是由于MSC激活了內(nèi)源的上皮干細胞從而發(fā)生分化。另一項研究給BPD大鼠注射人臍血(umbilical cord blood, UCB)分離的干細胞，肺結(jié)構(gòu)和肺功能有一定程度修復(fù)，推測是干細胞通過旁分泌作用發(fā)揮修復(fù)作用。

四、干細胞治療的臨床前期試驗

干細胞在呼吸系統(tǒng)疾病動物模型中的治療已取得了一定的進展，干細胞治療COPD的臨床試驗也正在如火如荼地開展中，COPD是目前關(guān)注的焦點。首次實施的干細胞治療COPD的臨床安全性試驗在巴西開展。該實驗入選COPD Ⅳ期的患者，進行全骨髓MSC輸注，隨訪一年。結(jié)果未發(fā)現(xiàn)有明顯副反應(yīng)，患者疾病處于穩(wěn)定的狀態(tài)，生存質(zhì)量有明顯提高。隨后，MSC治療COPD的臨床安全性和可行性實驗相繼展開。Weiss等[52]報道了在中到重度COPD患者中使用MSC治療的隨機對照實驗。實驗涉及了六個中心并且廣泛采集了入組的62例COPD患者的心肺生理等基本情況，實驗終點包括安全性評估，肺功能檢測，生存質(zhì)量問卷，6min步行時間和炎癥指標(biāo)評估。實驗結(jié)果表明MSC肺內(nèi)輸注治療安全可行，無輸注反應(yīng)及引起死亡等嚴(yán)重副反應(yīng)。但是患者的肺功能、COPD急性發(fā)病等不良事件并無統(tǒng)計學(xué)意義。但是，MSC治療的COPD患者的血C反應(yīng)蛋白(C-reactive protein, CRP)卻有明顯下降。其他一些試驗，例如在俄羅斯開展的臨床隨機對照試驗(NCT01849159)，分別在隨訪6個月、12個月和24個月評估肺CT檢測、肺功能和CO彌散率指標(biāo)，但目前該實驗尚在進行中。

此外，其他一些疾病的臨床試驗也在進行中。關(guān)于干細胞治療IPF的安全性和可行性的研究，正在美國進行。對25例IPF患者進行為期60周的干細胞輸入治療，評價常規(guī)生化檢測，肺功能，死亡率，住院率等各項指標(biāo) (NCT02013700)。在西班牙的一項多中心非盲非隨機的臨床Ⅰ期實驗，入選18例患者隨訪一年，主要研究干細胞治療的副反應(yīng)和療效 (NCT01919827)。對急性呼吸窘迫綜合征的干細胞治療，已經(jīng)有兩項研究正在開展臨床安全性實驗。在美國舊金山，進行同種異體MSC靜脈輸注的安全性檢測(NCT01775774)，隨訪一年。另一項是在中國進行的隨機對照雙盲安慰劑對照臨床Ⅰ期實驗，使用脂肪來源的干細胞進行治療(NCT01902082)，在接受規(guī)定劑量治療7d后檢測血漿細胞因子IL-6，IL-8，TNF-α，表面蛋白D(surfactant protein, SP-D)等。這些臨床試驗正在進行中或結(jié)束不久，尚無文獻報道結(jié)果，但是干細胞治療將會更多地應(yīng)用于臨床研究。

綜上所述，間充質(zhì)干細胞治療呼吸系統(tǒng)疾病經(jīng)歷了十余年的動物實驗階段，如今已經(jīng)開始步入臨床前期試驗階段。治療的疾病也已經(jīng)從最初的急性肺損傷，發(fā)展到現(xiàn)在的慢性阻塞性肺疾病和肺部腫瘤等。慢性阻塞性肺病作為威脅人類生命的重要疾病，正在接受全新的細胞治療。

干細胞作為一種易獲得、便于培養(yǎng)、使用方便并且到目前并無明顯毒副作用的治療手段，在呼吸系統(tǒng)疾病中具有重要的治療作用以及廣泛的應(yīng)用前景。隨著臨床試驗的開展和作用機制研究的不斷深入，將為呼吸系統(tǒng)疾病治療增加更多有效的手段。

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(本文編輯：王亞南)

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(收稿日期：2015-03-06)

中圖法分類號：R563

文獻標(biāo)識碼：A

通訊作者：徐衛(wèi)國，Email: xuweiguoxinhua@126.com

基金項目：國家自然科學(xué)基金資助(81270101)

DOI：10.3877/cma.j.issn.1674-6902.2016.01.023

上海市科委基金資助(12431900700)