胡軼虹， 白春艷， 周 艷綜述， 孫宏俠審校

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阿爾茨海默病的生物標志物研究進展

胡軼虹， 白春艷， 周 艷綜述， 孫宏俠審校

阿爾茨海默病(AD)是老年癡呆的最常見的類型，老年人在出現(xiàn)癥狀后3～9 y內(nèi)可導致死亡[1]。世界上超過350萬人患有AD，在超過85歲的老年人診斷AD的比例超過1/3[2]。在AD中檢測出許多分子病變：由有毒amyloid β(Aβ)聚集形成的細胞外淀粉樣斑塊和由過磷酸化tau蛋白形成的細胞內(nèi)的神經(jīng)元纖維纏結是典型的AD病變。

AD通常根據(jù)發(fā)病時間分為兩型[3]。早發(fā)性AD：在65歲前發(fā)病，是一種非常少見的(<1%)，常染色體顯性家族性疾病，是由APP及早老素基因突變引起，與γ-分泌酶復合物對Aβ的作用有關。晚發(fā)性AD：絕大多數(shù)的AD患者都是此類型，發(fā)病年齡晚(>65歲)，呈散發(fā)和不均勻性，由年老、遺傳和環(huán)境危險因素等引發(fā)。雖然晚發(fā)性AD病因是未知的，Aβ的清除下降可能是疾病發(fā)展的主要因素[4]。許多家族研究及遺傳學分析顯示載脂蛋白E(APOE)基因的ε4等位基因是晚發(fā)AD的主要危險因素[5]。

AD診斷學標志物的許多研究顯示：循環(huán)生物標志物包括Aβ肽(Aβ40和Aβ42)和tau / 磷酸化-tau可用于AD的診斷，APOE基因的多態(tài)等位基因的基因型分析也用作晚發(fā)性AD的預測性標志物。盡管關于AD的診斷標志物研究處于不斷進展中，在各個研究中存在大的可變性和不一致性，拖延了各種AD標志物作為診斷工具在臨床中使用[6]。另外，幾個研究表明，循環(huán)小分子核糖核酸(miRNAs)在AD患者的血清及腦脊液中有特異性的變化，提示miRNAs可用于AD的診斷，單獨或與其他AD生物標志物聯(lián)合使用[7]。本文將就AD相關的幾種生物學標志物作一綜述。

1 APP

Aβ斑，由細胞外Aβ蛋白在腦中沉積及聚集而成，是AD的主要神經(jīng)病理標志物。Aβ第一次于1984年由Glenner和Wong[8]從腦血管淀粉樣變和AD相關的淀粉樣蛋白斑塊的纖維中分離出來。APP由兩個獨立的蛋白水解途徑裂解。非淀粉樣蛋白途徑是由α-分泌酶控制，α-分泌酶裂解APP并釋放出APP的細胞外氨基端，形成分泌的淀粉樣前體蛋白-α(sAPPα)。其后，一個83殘基的C-端片段(C83)被γ-分泌酶消化，釋放細胞外p3和淀粉樣蛋白胞內(nèi)區(qū)域(AICD)。淀粉樣途徑結合了β-和γ-分泌酶的順序動作，在細胞內(nèi)位置如內(nèi)質(zhì)網(wǎng)或高爾基體形成了Aβ肽。β-分泌酶，也稱為β-位點淀粉樣前體蛋白裂解酶-1(BACE-1)，裂解APP，生成N-端sAPPβ和C-端C99肽。C99肽由γ-分泌酶裂解，形成Aβ，Aβ可錯誤折疊形成細胞外纖維，是AD腦中淀粉樣斑的主要成分。在人類Aβ的主要形式包括40個氨基酸(Aβ40)，但是Aβ的長的形式(Aβ42)，在C-端另外增加了兩個氨基酸，被發(fā)現(xiàn)與AD有關。

Goate等[9]于1991年首先報告了在AD家族中APP的錯義突變的分離，其后又報告了兩個突變，包括單一氨基酸在跨膜區(qū)及密碼子717的替換。如今，超過30種APP錯義突變已經(jīng)得到證實，大約有25種是致病的，在多數(shù)病例中導致常染色體顯性遺傳，早發(fā)性AD[10]。盡管APP基因突變通常是常染色體顯性，A673V突變導致AD卻是常染色體隱性的方式[11]。

2 早老素和γ-分泌酶復合物

Schellenberg等[12]于1992年發(fā)現(xiàn)的第一個遺傳連鎖的家族AD，位于14號染色體上。隨后，其他團隊通過遺傳連鎖的研究揭示染色體14 q24.3的圖譜位點(AD3)與AD進展型有極高的敏感性。他們分離出一個最小的共分離區(qū)域，包含AD3基因和一個新基因(S182)的轉錄，這個新基因的產(chǎn)物被認為包含多個跨膜域，就像一個完整的膜蛋白。這種蛋白質(zhì)包含5個不同錯義突變保守域，和早發(fā)性家族性AD高度相關。這個蛋白質(zhì)被命名為早老素1(PSEN1)，應用一個克隆定位方法證實PSEN1位于14 q24.3，PSEN2位于1 q31-q42。PSEN1是γ-分泌酶與呆蛋白、前咽缺陷1(Aph-1)和早老素增強子2(PEN-2)復合物的一個主要組成部分。PSEN1是一個多面體膜蛋白，它構成了γ-分泌酶復合物的催化核心。已經(jīng)報道的PSEN1突變超過180種，大多數(shù)是錯義突變引起氨基酸替換。PSEN1突變是早發(fā)性AD最常見的病因，占18%～50%的常染色體顯性遺傳早發(fā)性AD。PSEN1突變能引起伴有完全外顯率的非常嚴重形式的AD，發(fā)生在58歲左右，而不完全外顯率也曾經(jīng)報道過。許多研究已經(jīng)證實不同種族有不同的PSEN-1突變型。在一個不相關的加勒比裔家庭中報告了一個導致早發(fā)性AD的PSEN-1基礎突變[13]，表明A431E突變在墨西哥家庭導致早發(fā)性AD?；仡櫺躁犃醒芯?49例受試者[14]，他們是PSEN1 E280A攜帶者，已經(jīng)完成臨床隨訪，顯示出AD癡呆不同階段的臨床進展。研究顯示在35歲、38歲、44歲、49歲、59歲可以分別識別出無癥狀前-輕度認知障礙(pre-MCI)，有癥狀pre-MCI、MCI、癡呆、或者死亡。

早老素2(PSEN2)的識別是由于其與PSEN1高序列同源性，它的位置在連鎖分析定義的候選區(qū)域內(nèi)。PSEN2基因錯義突變導致早發(fā)性AD非常罕見，發(fā)病的年齡相比PSEN1要晚。PSEN2突變患者的發(fā)病年齡變化很大，外顯率在感染的家庭成員間也比PSEN1低。PSEN2在早發(fā)性AD的作用仍然是未知的，但最近的一項研究顯示突變PSEN2通過氧生物活化的細胞外信號調(diào)節(jié)激酶增加β-分泌酶活性[15]。

3 載脂蛋白E(APOE)

載脂蛋白E(APOE)是一種大腦中的神經(jīng)元通過載脂蛋白e受體轉運膽固醇的主要交通工具[16]。APOE也綁定到疏水性Aβ肽，這被認為是導致AD開始的不良事件，導致突觸功能障礙和神經(jīng)退行性變。APOE基因外顯子4的單核苷酸多態(tài)性，導致一種氨基酸從半胱氨酸到精氨酸或從精氨酸到半胱氨酸之間相互轉換，包括3個等位基因，E2、E3和E4[17]。攜帶E4等位基因的人群比攜帶更多常見E3等位基因的人群發(fā)生AD的風險高，而E2基因減少發(fā)生AD的風險。APOE亞型有區(qū)別地調(diào)節(jié)腦中Aβ聚合及清除。每個同種型的APOE蛋白質(zhì)結構得到確認，表明結構可以確定APOE同分異構體在AD中的功能。APOE亞型也通過在大腦調(diào)節(jié)脂質(zhì)運輸、葡萄糖代謝、神經(jīng)信號、神經(jīng)炎癥、線粒體功能等與AD相關。最近的一項薈萃分析研究確定的APOE E4等位基因與散發(fā)性晚發(fā)性AD相關，提示APOE E4等位基因會增加散發(fā)性晚發(fā)性AD風險，確定ε4等位基因為一個有用的工具來監(jiān)控癡呆患者和規(guī)劃醫(yī)療保健政策。因此，許多公司已經(jīng)開發(fā)出APOE基因分型試劑盒作AD預測診斷，而且這些試劑盒在不同的種族已經(jīng)進行了評估[18]。

4 Tau蛋白

Tau蛋白是微管穩(wěn)定蛋白，其在中樞神經(jīng)系統(tǒng)(CNS) 的神經(jīng)元中含量豐富，但在CNS星形膠質(zhì)細胞和少突膠質(zhì)細胞中也有非常低水平的表達[19]。分離的磷酸化tau使纖維沉積，成為AD的一個關鍵的病理特征。Tau蛋白異常過磷酸化和聚集而形成的神經(jīng)元纖維纏結的數(shù)量被認為是AD嚴重程度的病理學標志。過度磷酸化的tau蛋白是不溶性的，與微管缺乏親和力，自身結合成螺旋樣結構。異常tau分子的聚集具有細胞毒性[20]，損害認知功能。

已經(jīng)報告的染色體tau蛋白突變達30種[21]，17種被證實與額顳葉癡呆、帕金森病相關。而且，tau蛋白突變也被證實與AD相關。同時，在CSF中磷酸化的和總的tau水平升高與認知功能量表評分降低相關。CSF中高濃度的磷酸化-tau氨基酸(T181、T231)和總tau水平，形成了具有良好的精度的生物標志物，能夠預測AD早期輕度認知損害[22]。一些報告顯示Aβ與tau聚集有關。給突變tau轉基因老鼠的大腦注射Aβ42，在細胞中造成了5倍數(shù)量的神經(jīng)原纖維纏結[23]。此外，Aβ-誘導的培養(yǎng)神經(jīng)元的變性需要內(nèi)源性tau的存在。據(jù)報道Tau與氧化應激增加，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的蛋白質(zhì)折疊功能受損和蛋白酶體及自噬體介導的損傷蛋白清除不足有關。

5 AD7C-NTP

AD相關神經(jīng)絲蛋白(AD7C-NTP)是一種相對分子質(zhì)量為41000的跨膜磷蛋白，在神經(jīng)元胞體中表達，AD患者腦內(nèi)選擇性升高，其功能與神經(jīng)炎的發(fā)生及細胞死亡有關[24]。體外研究表明AD7C-NTP基因在轉染的人類神經(jīng)細胞中過度表達，導致其凋亡，同時伴有突觸的異常增生[25]，表明其與神經(jīng)變性病的發(fā)生和突觸丟失有關。研究表明，增高的AD7C-NTP可從早期的AD患者腦脊液及尿樣本中檢測到，而且腦脊液及尿液中AD7C-NTP 水平與癡呆的嚴重程度相關[26]。國內(nèi)賈建平團隊[27]研制出了尿神經(jīng)絲蛋白(AD7C-NTP)檢測試劑盒，已獲國家發(fā)明專利授權、國家醫(yī)療器械注冊證和臨床應用批件，并已投入臨床使用。但尿液檢測如何避免污染及其他干擾因素，仍是需要解決的問題。

6 miRNAs

小分子核糖核酸(miRNAs)是一族短的、單股的21-22核苷酸長度的非編碼RNAs，構成人類所有基因的1%。在過去的幾年中，miRNAs表達調(diào)節(jié)異常與AD相關的文獻不斷涌現(xiàn)。在AD患者組織樣本及細胞培養(yǎng)中，miRNAs模式的轉變已經(jīng)進行了深入的研究，而在AD循環(huán)中的miRNAs的研究信息很少。第一個關于miRNAs作為AD可能生物標志物的研究發(fā)表于2007年[28]，Schipper和他的團隊通過微陣列分析首次在AD外周血單核細胞發(fā)現(xiàn)miRNA表達增加。一個近期的血細胞研究通過新一代測序[29]，發(fā)現(xiàn)了12-miRNA信號，可顯著區(qū)分AD及對照組，準確率為93%、特異性95%、敏感性92%。在血漿和腦脊液中也進行了miRNA譜的研究。Kumar和他的團隊報告[30]，通過Nanostring技術，在血漿中發(fā)現(xiàn)和確認了一個獨一無二的循環(huán)的7-miRNA信息，可顯著區(qū)分AD患者及對照組，準確率為95%，而在腦脊液中通過qRT-PCR獲得的miRNA譜實驗證實在AD患者中has-miR-27a-3p表達減少[31]。Cogswell等[32]在腦脊液中通過qRT-PCR進行了miRNA分析，證實了一系列miRNAs，所謂的AD特異性miRNAs，腦脊液表達譜相似于AD患者腦的表達譜。

除了譜研究，許多研究致力于選擇特異miRNAs，作為可能的生物標志物的候選。例如Lukiw和他的同事們選擇分析相關炎癥信號的miRNA，發(fā)現(xiàn)阿爾茨海默病CSF和死后從尸檢的間腦組織提取的細胞外液中miR-146 a和miR-155豐富[33，34]。在CSF的另一項研究中，在AD患者中l(wèi)et-7b水平升高，let-7b是一個miRNA，能激活toll樣受體7，引起神經(jīng)退化[35]。其他關于血漿miRNA分析的工作，發(fā)現(xiàn)循環(huán)的miR-15a水平與淀粉樣斑水平相關，對AD的病理學診斷很重要[36]，而miR-29a/b、miR-181c、miR-9 在血漿中下調(diào)[37]。此外，研究發(fā)現(xiàn)絲氨酸十六烷酰轉移酶(SPT)通過miR-137、miR-181c、miR-9和miR-29a/b的翻譯后調(diào)節(jié)，直接調(diào)節(jié)Aβ水平，提示SPT及相應的miRNAs為AD的潛在的治療靶點[38]。

AD是最常見的神經(jīng)退行性疾病和引起老年癡呆的主要原因。早期診斷和治療AD是一個主要公共衛(wèi)生問題。雖然在理解AD的遺傳和分子基礎方面取得了一些進步，診斷AD仍然困難，常常需要死后尸檢的確認。AD的三大遺傳標記，包括APP、PSEN1、PSEN2，已知與Aβ42生成增加有關，最終發(fā)生神經(jīng)細胞死亡和癡呆。APOE已經(jīng)被公認是晚發(fā)性AD的主要遺傳標記，但診斷晚發(fā)性AD仍是困難的，因為其復雜的模式。磷酸化tau蛋白聚集也被認為是診斷AD的標志物，但增加的tau或磷酸化tau對AD的具體致病機制仍然是模糊的。尿液AD7C-NTP檢測是一簡便、經(jīng)濟的檢測方法，但避免污染及其他干擾因素，進一步提高檢測敏感度是關鍵。近年來，對AD-特異循環(huán)miRNAs作為診斷生物標記物的研究，表明循環(huán)miRNAs是下一代有前途的AD生物標志物，最終可能用于神經(jīng)變性疾病的鑒別。未來在這一領域的研究有望幫助早期診斷AD。

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1003-2754(2016)01-0090-03

R749.1+6

2015-11-14；

2015-12-28

(吉林省人民醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，吉林 長春 130021)

孫宏俠，E-mail：huyihong76@163.com