顏晨 陳云新 滕智平 沈丹華 李勁濤 曾毅

100052中國疾病預(yù)防控制中心病毒病預(yù)防控制所傳染病預(yù)防控制國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室（顏晨、曾毅）；100124北京工業(yè)大學(xué)生命科學(xué)與生物工程學(xué)院環(huán)境與病毒腫瘤學(xué)北京市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室（滕智平、李勁濤）；100044北京大學(xué)人民醫(yī)院病理科（陳云新、沈丹華）

乳腺癌患者中HPV和MMTV的基因檢測(cè)

顏晨 陳云新 滕智平 沈丹華 李勁濤 曾毅

100052中國疾病預(yù)防控制中心病毒病預(yù)防控制所傳染病預(yù)防控制國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室（顏晨、曾毅）；100124北京工業(yè)大學(xué)生命科學(xué)與生物工程學(xué)院環(huán)境與病毒腫瘤學(xué)北京市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室（滕智平、李勁濤）；100044北京大學(xué)人民醫(yī)院病理科（陳云新、沈丹華）

目的 在乳腺癌中檢測(cè)人乳頭瘤病毒和小鼠乳腺腫瘤病毒的存在，期望能為乳腺癌的基因治療提供可能的靶點(diǎn)。方法 取76例乳腺癌石蠟組織，應(yīng)用PCR和巢式PCR方法檢測(cè)組織中HPV L1、HPV16E6、HPV16E7、HPV18E6和HPV18E7，MMTV的env基因序列，并進(jìn)行了測(cè)序分析。結(jié)果 在76份樣本中，HPV L1陽性7例（9.21%），且測(cè)序后均為HPV18基因型；HPV16 E6和HPV16E7無陽性；HPV18 E6陽性5例（6.58%）；HPV18 E7陽性7例（9.21%）；MMTV的env基因陽性23例（30.26%）。結(jié)論 HPV18型相關(guān)基因與MMTV的env基因在乳腺癌中有存在，結(jié)果提示乳腺癌與HPV的相關(guān)性不是很高，但乳腺癌和MMTV或許有一定的相關(guān)性，也為乳腺癌的基因治療提供了可能的靶點(diǎn)。

【主題詞】 乳頭狀瘤病毒，人；乳房瘤病毒，鼠；乳腺腫瘤；聚合酶鏈反應(yīng)

Fund programs：Nationa1 Key Techno1ogy R&D Program（2006BA119B03）；Nationa1 High Techno1ogy Research Program of China（863 Program）（2012AA02A404）

乳腺癌是女性癌癥中危害最大的癌癥類型之一，但在50% ～80%的乳腺癌患者中找不到年齡、家族遺傳史等常見原因，有研究表明乳腺癌與病毒感染相關(guān)，其中就包括小鼠乳腺腫瘤病毒和人乳頭瘤病毒，其中人乳頭瘤病毒已經(jīng)證實(shí)和肛門生殖器癌、上呼吸消化道癌和皮膚癌的發(fā)生有著密切的關(guān)系［1］；而小鼠乳腺腫瘤病毒的人類同源病毒即一種與小鼠乳腺腫瘤病毒具有一致性的逆轉(zhuǎn)錄病毒與人類乳腺癌相關(guān)［2］。

本研究分別在76例乳腺癌石蠟組織標(biāo)本中檢測(cè)了 HPV L1、HPV16E6、HPV16E7、HPV18E6、HPV18E7以及MMTV的env基因序列，希望能進(jìn)一步尋找乳腺癌與HPV和MMTV的相關(guān)性，為乳腺癌的基因治療提供新的治療靶點(diǎn)。

1 對(duì)象與方法

1.1臨床材料 76例乳腺癌石蠟包埋樣本取自北大人民醫(yī)院病理科，其中35例乳腺浸潤性導(dǎo)管癌Ⅰ級(jí)、25例Ⅱ級(jí)、14例Ⅲ級(jí)，1例導(dǎo)管內(nèi)乳頭狀癌，1例乳腺浸潤性小葉癌。該研究由中國疾病預(yù)防控制中心病毒病預(yù)防控制所倫理委員會(huì)審查通過，所有患者均已簽署知情同意書。

1.2試劑 Premix Ex Taq，Proteinase K，均購自寶生物工程大連有限公司；HPV16 E6、HPV16 E7、HPV18E6、HPV18E7、HPV L1、MMTV nest PCR 7對(duì)引物均為美國Invitrogen公司合成；酚氯仿異戊醇混合液購自北京擎科新業(yè)生物技術(shù)有限公司；HPV18全基因質(zhì)粒，HPV16全基因質(zhì)粒與CM1細(xì)胞系為本實(shí)驗(yàn)室保存。

1.3方法

1.3.1石蠟切片基因組DNA的提?。簯?yīng)用水浴脫蠟法［3］提取石蠟切片組織中的DNA，具體步驟為：吸取60℃溫?zé)酺ES（10 mmo1/L Tris-Hc1，1 mmo1/L EDTA，0.5%SDS）滴至玻璃片樣品區(qū)，用槍頭輕輕刮下組織收集于1.5 m1EP管中，補(bǔ)加TES至1 m1震蕩混勻，60℃水浴30 min，8000 r/min離心10 min棄上清，重復(fù)2遍，加入500 μ1 TET（100 mmo1/L Tris-Hc1，1 mmo1/L EDTA，1%TrisonX-100，500 μg/ m1 Proteinase K）震蕩混勻，60℃水浴1 h至無沉淀，加入500 μ1酚氯仿異戊醇混合液混勻 20 min，13 000 r/min離心10 min，取上層清澈液體，此步驟重復(fù)2遍，加入1/10體積預(yù)冷NaAc（3 mo1/L）輕輕混勻，加入2倍體積無水乙醇緩慢搖動(dòng)可見絲狀DNA，4℃沉淀過夜，4℃12 000 r/min離心15 min，取沉淀加1m1無水乙醇4℃12 000 r/min離心15 min，清洗DNA，室溫風(fēng)干，加入40 μ1雙蒸水溶解DNA，用蛋白核酸測(cè)定儀檢測(cè) DNA濃度，-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2PCR鑒定：分別設(shè)計(jì)合成HPV L1通用引物（上游：TTTGTTACTGTGGTAGATACTAC，下游：GAA AAATAAACTGTAAATCATATTC）、HPV16E6（上游：GCAAGCAACAGTTACTGCGA，下游：CAACAAGAC ATACATCGACC）、HPV16E7（上游：TGCATGGAGAT ACACCTACATTG，下游：CCCATTAACAGGTCTTCC AAAGT）、HPV18E6（上游：CACTTCACTGCAAGACA TAGA，下 游：GTTGTGAAATCGTCGTTTTTCA）、HPV18E7（上游：ACATTTACCAGCCCGACGA，下游：ACACACAAAGGACAGGGTGTT）和MMTV巢式PCR內(nèi)引物（上游：CCTTCCCTCGCCTAGTGTAGAT，下游：CTCTATCATTGGGATCCTTAGGAGAA）外引物（上 游：CCTTGGGTTACTTTGGGATTTCT，下 游：AACACAGGCAGATGTAGGAATCAT）分別進(jìn)行PCR和巢式PCR鑒定。

PCR反應(yīng)體系為Premix Ex Taq 25 μ1，模板2 μ1，上下游引物各0.5 μ1，雙蒸水22.5 μ1；其中L1、HPV18E6、HPV18E7、HPV16E6、HPV16E7和MMTV內(nèi)引物反應(yīng)條件均為：94℃ 5 min，94℃ 30 s、54℃ 1 min、72℃1 min（40個(gè)循環(huán)）、72℃5 min；MMTV外引物第二輪反應(yīng)條件為：94℃5 min，94℃30 s、56℃1 min、72℃1 min（40個(gè)循環(huán)），72℃5 min。

以HPV18全基因質(zhì)粒為HPV基因擴(kuò)增的陽性對(duì)照，以CM1細(xì)胞系DNA為MMTV的env基因擴(kuò)增的陽性對(duì)照，以雙蒸水為陰性對(duì)照。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行1.5%瓊脂糖凝膠電泳，凝膠成像儀觀察結(jié)果并照相。

1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用SPSS軟件對(duì)各項(xiàng)結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。

2 結(jié)果

2.1本組病例年齡分布特點(diǎn) 76例樣本平均年齡為54.81歲，最大87歲，最小25歲。HPV與MMTV病例數(shù)分散的存在于各個(gè)年齡段，未顯示出年齡分布趨勢(shì)。

2.2乳腺癌病例樣本中PCR檢測(cè)結(jié)果

2.2.1HPV基因PCR檢測(cè)結(jié)果：76例乳腺癌樣本進(jìn)行HPV基因PCR擴(kuò)增鑒定，結(jié)果顯示HPV基因陽性11例（14.47%），L1陽性7例，其中3例HPV18 E6和HPV18 E7檢測(cè)也為陽性，剩余4例切膠回收測(cè)序顯示其序列也屬于 HPV18基因型；HPV18 E6陽性5例，HPV18 E7陽性7例。分析可見在浸潤性導(dǎo)管癌Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ級(jí)中L1陽性率分別為4%、12%、28.57%，HPV18 E7陽性率分別為8%、4%、28.57%；HPV18 E6陽性率為0、8%、21.43%，可見HPV陽性集中于浸潤性導(dǎo)管癌中，并且隨著癌癥的加重L1、HPV18 E6和HPV18 E7的陽性率隨之上升。

2.2.2MMTV巢式PCR檢測(cè)結(jié)果：巢式PCR結(jié)果顯示乳腺癌MMTV env基因陽性23例（30.26%），其中乳腺浸潤性導(dǎo)管癌Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ級(jí)中的陽性率分別為20%、40%、50%?？梢娫诮櫺詫?dǎo)管癌中，隨著癌癥級(jí)數(shù)的增加，MMTV陽性率隨之上升。

2.3HPV與MMTV陽性率與其他各國陽性率的比較

2.3.1乳腺癌中HPV陽性率各國對(duì)比：從以前報(bào)道中搜集了多國關(guān)于HPV在乳腺癌中的檢測(cè)情況，分別發(fā)現(xiàn)敘利亞［4］HPV陽性病率61.06%，主要亞型包括HPV18（0.88%）、HPV16（2.65%）、HPV33 （55.75%）、HPV35（37.17%）；墨西哥［5］無HPV陽性病例；而在墨西哥［6］另一次研究中HPV18陽性病例達(dá)到了50%；澳大利亞［7］HPV18陽性病例為48%；伊朗［8］HPV18陽性率6.9%，HPV16陽性率6.9%；而在瑞士［9］和中國西北［10］無 HPV陽性發(fā)現(xiàn)；在中國［11］另一次研究中 HPV18陽性率為1.61%、HPV16陽性率為4.84%。

分析顯示此次結(jié)果和中國另一次研究以及伊朗研究的差異不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，此次結(jié)果與中國西北、瑞士，澳大利亞、墨西哥以及敘利亞的差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。這一對(duì)比顯示關(guān)于HPV在乳腺癌中的存在并未表現(xiàn)出地域差異性。

3 討論

在本研究中76例乳腺癌患者平均年齡54.81歲，最大87歲，最小25歲，HPV與MMTV病例數(shù)分散的存在于各個(gè)年齡段，未顯示出年齡分布趨勢(shì)。

HPV的L1基因是編碼主要衣殼蛋白的晚期基因，E6、E7基因?yàn)镠PV的主要致癌基因、而HPV16、HPV18是主要致癌基因型。本研究選取HPV L1、HPV16E6、HPV16E7、HPV18E6和HPV18E7基因作為目標(biāo)基因，在乳腺癌樣本中進(jìn)行檢測(cè)，HPV基因陽性11例（14.47%）且均為HPV18基因型，L1陽性7例也均屬于HPV18基因型，其中3例HPV18 E6和HPV18 E7檢測(cè)也均為陽性，說明在這3例乳腺癌樣本中病毒已經(jīng)進(jìn)入組裝階段；而在6例乳腺癌樣本中只能檢測(cè)到HPV8E6或 E7，這提示了HPVE6、E7基因或許已進(jìn)宿主DNA，處于潛伏感染階段。本研究還分析在乳腺浸潤性導(dǎo)管癌中，隨著癌癥的加重L1、HPV18 E6和HPV18 E7的陽性率隨之上升。這提示了或許HPV的感染和乳腺癌的發(fā)生發(fā)展相關(guān)。收集多國檢測(cè)結(jié)果對(duì)比顯示關(guān)于HPV在乳腺癌中的存在并未表現(xiàn)出地域差異性，并且多國多次關(guān)于HPV與乳腺癌檢測(cè)結(jié)果均不相同，這種文獻(xiàn)矛盾出現(xiàn)的原因主要包括：乳腺癌樣本中HPV的低病毒載量、各個(gè)研究所選用的引物各有不同、PCR檢測(cè)中假陽性的存在等。所以關(guān)于乳腺癌和HPV關(guān)系的確定還需要更多、更大量、更統(tǒng)一的研究分析。

本研究在76例乳腺癌樣本中檢測(cè)了MMTV的env基因序列，其中鑒定陽性 23例，陽性率為30.26%，其中乳腺浸潤性導(dǎo)管癌Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ級(jí)中的陽性率分別為20%、40%、50%，顯示隨著癌癥級(jí)數(shù)的增加，MMTV陽性率隨之上升。

本研究主要針對(duì)乳腺癌樣本中，HPV與MMTV人類同源基因的存在與否進(jìn)行了檢測(cè)，對(duì)MMTV人類同源基因在乳腺癌中的存在做出了一定的證實(shí)，為乳腺癌的基因治療提供了新的靶點(diǎn)，但在本研究中，因?yàn)闃悠窋?shù)量與檢測(cè)靶點(diǎn)的有限性，尚需進(jìn)一步的研究。

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Detection of HPV and MMTV in breast cancer cases

Yan Chen，Chen Yunxin，Teng Zhiping，ShenDanhua，Li Jintao，Zeng Yi National Institute for Viral Disease Control and Prevention，State Key Laboratory for Infectious Disease Control and Prevention，Chinese Center for Disease Control and Prevention，Beijing 100050 China（Yan C，Zeng Y）；College of Life Science and Bioengineering，Beijing University of Technology，Beijing 100124，China（Teng ZP，Li JT）；Beiking University People′s Hospital，Beijing 100044，China（Chen YX，Shen DH）

Zeng Yi，Email：zengy@public.bta.net.cn

Objective To ana1yse the presence of human papi11omavirus and mouse mammary tumor virus in breast cancer，and expected to provide a possib1e target for gene therapy of breast cancer. Methods PCR and nested PCR assay were used to detect the HPV L1，HPV16E6，HPV16E7，HPV18E6，HPV18E7 and the eneve1op gene of MMTV，whi1e sequence ana1ysis was performed in 76 paraffin embedded tissues of breast cancer.Results The percentage of HPV L1，HPV18 E6，HPV18 E7 and the eneve1op gene of MMTV was repective1y 9.21%，6.58%，9.21%and 30.26%，whi1e no HPV16 E6 and HPV16E7 was found in 76 paraffin embedded tissues of breast cancer.Conclusions HPV18 and the eneve1op gene of MMTV was existed in breast cancer，there was 1ow connection between HPV and breast cancer，but there may be some corre1ation between MMTV and breast cancer.This research offers a possib1e target for gene therapy of breast cancer.

Papi11omavirus，human；Mammary tumor virus，mouse；Breast neop1asms；Po1ymerase chain reaction

國家科技支撐計(jì)劃項(xiàng)目（2006BAI19B03）；國家“863”計(jì)劃課題（2012AA02A404）

曾毅，Emai1：zengy@pub1ic.bta.net.cn

10.3760/cma.j.issn.02546450.2016.02.018

2015-07-27）