雷蕾 （遼寧省沈陽(yáng)市動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心 110034）

血凝和血凝抑制實(shí)驗(yàn)淺談

雷蕾 （遼寧省沈陽(yáng)市動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心 110034）

血凝和血凝抑制實(shí)驗(yàn)在實(shí)際操作中被廣泛的使用，主要是因?yàn)檫M(jìn)行該實(shí)驗(yàn)時(shí)步驟流程簡(jiǎn)單，不需要長(zhǎng)時(shí)間的等待實(shí)驗(yàn)結(jié)果，最為重要的是實(shí)驗(yàn)結(jié)果在很大程度上具有代表性，能夠?yàn)槿藗兯邮?。通過(guò)實(shí)驗(yàn)既能起到保護(hù)動(dòng)物健康的作用，同時(shí)，又能為養(yǎng)殖戶提供禽類疾病的預(yù)防，文中結(jié)合實(shí)際經(jīng)驗(yàn)敘述該實(shí)驗(yàn)的方法及注意事項(xiàng)，具有非常重要的現(xiàn)實(shí)指導(dǎo)意義。

環(huán)境溫度；血凝；血凝抑制

1 血凝和血凝抑制實(shí)驗(yàn)理論和方法

何謂血凝和血凝抑制？前者主要是病毒與血液中的紅細(xì)胞發(fā)生的凝集。當(dāng)發(fā)生凝集現(xiàn)象時(shí)，在反應(yīng)中加入具有抑制作用的物質(zhì)來(lái)阻止凝集，這就是血凝抑制。通常這種物質(zhì)是具有特異性的血清。不管是兩種實(shí)驗(yàn)中的哪一種，其主要的檢測(cè)對(duì)象都是血清抗體。血凝實(shí)驗(yàn)的對(duì)象一般是選取一種或者是兩種以上的動(dòng)物，在具體的實(shí)際操作過(guò)程中所采用的是標(biāo)準(zhǔn)抗原同雞紅細(xì)胞。為了達(dá)到實(shí)驗(yàn)效果，將病毒或者是還有血凝素的病毒加入抗原同雞紅細(xì)胞中，二者之間就會(huì)發(fā)生凝集作用。

相較于血凝實(shí)驗(yàn)，要想達(dá)到抑制凝集反應(yīng)的效果，首先要做的是在含有病毒的懸液中加入一些抗體。為了保證實(shí)驗(yàn)效果，對(duì)這些抗體有一些客觀上的要求，一方面要具有特異性，另一方面是在實(shí)驗(yàn)量上的保證，要確保能夠達(dá)到抑制效果。否則，就會(huì)出現(xiàn)紅細(xì)胞繼續(xù)發(fā)生凝集反應(yīng)。

2 被檢樣品

2.1 采樣

（1）首先確定實(shí)驗(yàn)對(duì)象的范圍，然后采取一定的抽樣方法選取檢測(cè)樣本。在保證所采集的樣本能夠充分代表整個(gè)實(shí)驗(yàn)對(duì)象的前提下，通過(guò)隨機(jī)抽樣的方式按照不同的標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行樣本采集。對(duì)屬于同一批次的，按照3%的比例隨機(jī)抽樣。對(duì)樣本的采集數(shù)量也有一定的要求，必須不能少于30，如果低于這個(gè)樣本數(shù)量的話，那么實(shí)驗(yàn)檢測(cè)出來(lái)的結(jié)果是不具有代表性的。

（2）對(duì)所抽選的樣本進(jìn)行采樣后，要在第一時(shí)間內(nèi)送檢。如果出現(xiàn)特殊情況影響了送檢安排，就必須按照要求對(duì)采樣標(biāo)本進(jìn)行預(yù)處理，要嚴(yán)格掌控血清分離的時(shí)間。在實(shí)驗(yàn)中，要非常注意對(duì)時(shí)間的把握。如果分離的時(shí)間過(guò)長(zhǎng)的話，會(huì)降低抗體的效價(jià)。

2.2 被檢血清

在采集完樣本后，為了達(dá)到能夠自然析出血清的效果，我們?cè)趯?shí)驗(yàn)中要完成以下兩個(gè)步驟：一是將采血器向后回抽2～3ml，二是在前一步驟的基礎(chǔ)上留出空隙，將呈放血清的容器按照一定的角度進(jìn)行放置。在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中，要充分考慮到外部環(huán)境的溫度因素。如果實(shí)驗(yàn)是在夏天進(jìn)行的話，那么就可以將其放在室內(nèi)。如果是冬天，應(yīng)該將溫度控制在37℃，要在室內(nèi)進(jìn)行析出。如果樣本中出現(xiàn)了血清不易分離的現(xiàn)象，或者是成膠凍狀的話，那么說(shuō)明所采集的血清抗體含量不均勻，這將會(huì)給實(shí)驗(yàn)結(jié)果帶來(lái)非常大的誤差。在實(shí)驗(yàn)中，對(duì)已經(jīng)分離好的血清按照不同的情況進(jìn)行處理。如果能夠在短期內(nèi)檢測(cè)，如一周以內(nèi)，那么就將樣本血清放在4℃冰箱內(nèi)保存；如果要等待較長(zhǎng)的時(shí)間，那么就應(yīng)將樣本血清存放在-20～-80℃的冰箱內(nèi)，而且在對(duì)樣本運(yùn)輸?shù)倪^(guò)程中，要確保溫度的適宜，可以用冰塊來(lái)滿足樣本血清對(duì)溫度的需求。

3 反應(yīng)板

（1）在反應(yīng)板的選擇上，選用可以一次性使用的96孔V型板。實(shí)驗(yàn)過(guò)程中，首先要確保板的質(zhì)量合格，如果不合格，會(huì)嚴(yán)重造成實(shí)驗(yàn)結(jié)果偏差。還要充分保持反應(yīng)板及凹孔的干凈，除了干凈之外，還要保證板的平整度，實(shí)驗(yàn)過(guò)程中不能有任何的失誤。反應(yīng)板放置的角度也會(huì)影響到實(shí)驗(yàn)的結(jié)果，主要是因?yàn)榉胖媒嵌鹊牟煌瑫?huì)在一定程度上影響紅細(xì)胞的沉降速度，角度的過(guò)大或者是過(guò)小，會(huì)產(chǎn)生不同的結(jié)果。

如果實(shí)驗(yàn)中選取的不是一次性使用的反應(yīng)板，那么在重復(fù)使用反應(yīng)板的過(guò)程中，要做好反應(yīng)板的清潔工作，沒有清潔干凈的反應(yīng)板會(huì)造成實(shí)驗(yàn)結(jié)果的不可靠。如果呈放樣本血清的容器中有紅血球殘留的話，那么會(huì)給這兩種實(shí)驗(yàn)帶來(lái)不同的影響，對(duì)血凝實(shí)驗(yàn)，會(huì)造成效價(jià)偏低，而對(duì)抑制實(shí)驗(yàn)，會(huì)造成相反的結(jié)果。

（2）在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中，要保證反應(yīng)板在一定時(shí)間內(nèi)的靜止，不能出現(xiàn)晃動(dòng)。如果在實(shí)驗(yàn)中，我們對(duì)反應(yīng)板進(jìn)行過(guò)多地操作的話，不停地將其拿在手中進(jìn)行觀察的話，會(huì)嚴(yán)重的影響實(shí)驗(yàn)的凝集效果，這樣就會(huì)造成血凝實(shí)驗(yàn)效價(jià)偏低，而抑制實(shí)驗(yàn)結(jié)果偏高。因此，在進(jìn)行這兩種實(shí)驗(yàn)時(shí)，要有一定的耐心，給實(shí)驗(yàn)充足的反應(yīng)時(shí)間，不急于一時(shí)，只有這樣才能保證兩種實(shí)驗(yàn)的效果。

4 抗原效價(jià)的測(cè)定及配制

4.1 抗原的保存

一般在進(jìn)行這兩種實(shí)驗(yàn)時(shí)，所用的抗原是有兩種不同形態(tài)的，液體和干粉。但是不管是以哪種形態(tài)存在，都應(yīng)該將其設(shè)定在-20℃的溫度下進(jìn)行保存。在進(jìn)行抗原效價(jià)測(cè)定時(shí)，為了獲得更好的實(shí)驗(yàn)效果，可以將同樣的抗原進(jìn)行混合使用，而且進(jìn)行多次實(shí)驗(yàn)，通過(guò)多組實(shí)驗(yàn)結(jié)果的對(duì)比，進(jìn)行適當(dāng)?shù)钠骄?，以使得?shí)驗(yàn)結(jié)果更加有效可靠。

抗原的血凝價(jià)如果出現(xiàn)以下情況時(shí)，會(huì)使得效價(jià)降低。比如外部溫度變化頻繁。在實(shí)驗(yàn)中，如果出現(xiàn)已經(jīng)測(cè)定好血凝價(jià)的抗原有多余的情形，應(yīng)該將多余的抗原重新裝置，一般將其放置到經(jīng)過(guò)殺菌處理后的離心管中。裝置完以后，要在管上標(biāo)明相關(guān)基本信息，時(shí)間和效價(jià)，以便下次實(shí)驗(yàn)中繼續(xù)使用。在存放過(guò)程中，切忌反復(fù)凍融，如果抗原多次這樣操作的話，會(huì)使得血凝抑制滴度提高，一般血凝價(jià)相差的滴度與血凝抑制價(jià)相差的滴度相一致。

4.2 稀釋液

實(shí)驗(yàn)中所用的稀釋液在酸堿性上有非常具體明確的要求。應(yīng)采用酸堿值為7.2的PBS緩沖液。之所以會(huì)以這樣的標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行選取，主要是為了讓紅細(xì)胞能夠更加容易的發(fā)生自凝。如果采用酸堿值過(guò)高的稀釋液的話，那么會(huì)造成凝集的紅細(xì)胞洗脫加快，使得凝集價(jià)檢測(cè)偏低，凝集抑制價(jià)偏高。實(shí)驗(yàn)的每一步操作都是為了提高實(shí)驗(yàn)結(jié)果的可靠性。在PBS液的配制上，盡量做到什么時(shí)候用什么時(shí)候進(jìn)行調(diào)制。在時(shí)間方面，要嚴(yán)格掌控稀釋液的配制時(shí)間。長(zhǎng)時(shí)間暴露在周圍環(huán)境中，會(huì)使得稀釋液受到污染，這樣會(huì)滋生細(xì)菌，給實(shí)驗(yàn)結(jié)果造成偏差。

5 溫度對(duì)實(shí)驗(yàn)值的影響

在整個(gè)實(shí)驗(yàn)過(guò)程中，環(huán)境溫度起到了一個(gè)至關(guān)重要的作用。在一定的溫度范圍內(nèi)，血凝和血凝抑制的滴度會(huì)隨著溫度的提高相應(yīng)的作出提高反映。如果室溫出現(xiàn)在低于4℃時(shí)，紅細(xì)胞會(huì)發(fā)生自凝。同時(shí)，外部環(huán)境的溫度會(huì)影響到實(shí)驗(yàn)的反應(yīng)速度。如果溫度過(guò)高，使得反應(yīng)在短時(shí)間內(nèi)就完成，不容易被觀察記錄。實(shí)驗(yàn)證明，在37℃時(shí)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果出現(xiàn)的最快，隨著溫度的升高，會(huì)出現(xiàn)反應(yīng)物解離和紅細(xì)胞溶血現(xiàn)象。反應(yīng)過(guò)程盡量在恒溫箱中進(jìn)行，要求恒溫箱溫度能精確保持設(shè)定溫度。

正常實(shí)驗(yàn)在20～25℃的條件下進(jìn)行。在實(shí)驗(yàn)開始30min后，對(duì)實(shí)驗(yàn)中產(chǎn)生的現(xiàn)象進(jìn)行觀察記錄，然后，每隔一段時(shí)間記錄一次，在不斷的觀察記錄對(duì)比過(guò)程中，直到出現(xiàn)最佳觀察結(jié)果為止。

6 體會(huì)

在整個(gè)實(shí)驗(yàn)過(guò)程中，除了外部環(huán)境溫度會(huì)對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果產(chǎn)生影響，還有其他非常細(xì)節(jié)的因素也會(huì)左右實(shí)驗(yàn)結(jié)果。每個(gè)影響因素的存在既是獨(dú)立又是交織在一起的。所以，在實(shí)驗(yàn)中，我們一定要嚴(yán)格遵守實(shí)驗(yàn)操作規(guī)則，盡可能的排除人為因素對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的影響。我們可以通過(guò)多組實(shí)驗(yàn)的重復(fù)操作，來(lái)減少實(shí)驗(yàn)中出現(xiàn)的偏差；同時(shí)，在進(jìn)行實(shí)驗(yàn)時(shí)，我們的實(shí)驗(yàn)人員要有過(guò)硬的專業(yè)技術(shù)和實(shí)踐經(jīng)驗(yàn)，只有做好每一步，才能保證實(shí)驗(yàn)結(jié)果的可靠，為實(shí)踐提供現(xiàn)實(shí)指導(dǎo)。