李遵瑞 （山東省臨沂市蘭山區(qū)畜牧獸醫(yī)局半程畜牧獸醫(yī)站 276036）

孵化后期死雞胚沙門氏桿菌的分離與鑒定

李遵瑞 （山東省臨沂市蘭山區(qū)畜牧獸醫(yī)局半程畜牧獸醫(yī)站 276036）

為確診某肉雞孵化場死亡雞胚的致病原因，對孵化后期死亡的20枚雞胚進行流行病學調(diào)查、細菌分離培養(yǎng)，通過生化試驗、運動性試驗、動物致病性試驗等鑒定方法對病原進行鑒定，并對分離菌進行藥物敏感性試驗；20枚死亡雞胚中有8枚帶菌，帶菌率40%，其中3株為沙門氏菌，沙門氏菌帶菌率為15%。分離菌對頭孢噻呋鈉和左旋氧氟沙星、四環(huán)素高敏，對鹽酸黃連素、丁胺卡那霉素、氧氟沙星、青霉素、硫酸慶大霉素中敏，對阿奇霉素、磷霉素鈣、恩諾沙星、鏈霉素產(chǎn)生了耐藥性。

肉雞；孵化場；死胚；沙門氏菌；分離鑒定

1 試驗材料與儀器

1.1 試驗材料

1.1.1 病料來源

臨沂大通孵化場孵化后期死亡雞胚20枚。

1.1.2 培養(yǎng)基及試劑

普通肉湯培養(yǎng)基、普通營養(yǎng)瓊脂 （購自青島高科園海博技術(shù)有限公司）、半固體動力培養(yǎng)基、伊紅美藍瓊脂、麥康凱瓊脂、胰蛋白胨大豆瓊脂 （購自北京陸橋技術(shù)有限責任公司）、SS瓊脂 （購自北京中海生物科技有限公司）、葡萄糖、乳糖、麥芽糖、甘露醇、蔗糖等細菌生化常規(guī)微量鑒定管（購自浙江省軍區(qū)后勤部衛(wèi)生防疫檢驗所），快速革蘭氏染色液試劑盒 （購自濟南百博生物技術(shù)股份有限公司）。

1.1.3 藥敏試驗紙片

藥敏試紙片 （杭州天和微生物試劑有限公司）。

1.1.4 試驗動物

10日齡雞胚10枚，2日齡雛雞10只，小鼠10只，均由臨沂大學動物預防醫(yī)學實驗室提供。

1.2 試驗儀器

SW-WJ-LCU潔凈工作臺、油鏡、立式壓力蒸汽滅菌器、生化培養(yǎng)箱、孵化出雛機、電子天平、可調(diào)萬用電爐等。

2 試驗方法

2.1 病原菌分離鑒定

2.1.1 各種培養(yǎng)基的制備

2.1.1.1 普通營養(yǎng)瓊脂

稱取普通營養(yǎng)瓊脂粉33.0g加入1L蒸餾水中，加熱煮沸到完全溶解后用立式壓力蒸汽滅菌器設(shè)定為121℃高壓滅菌20min，冷卻至46℃左右時制成斜面?zhèn)溆谩?/p>

2.1.1.2 伊紅美藍瓊脂 （EMB）

稱取EMB37.5g加入1L蒸餾水中，加熱煮沸至完全溶解后用立式壓力蒸汽滅菌器設(shè)定為121℃高壓滅菌20min，冷卻至55℃左右傾注平板備用[1]。

2.1.1.3 麥康凱瓊脂

稱取麥康凱瓊脂粉54.0g，加入1L蒸餾水中，加熱煮沸完全溶解后，用立式壓力蒸汽滅菌器設(shè)定121℃高壓滅菌20min。

2.1.1.4 SS瓊脂

稱取SS瓊脂粉60.0g加入1L蒸餾水中，加熱煮沸完全溶解，用立式壓力蒸汽滅菌器設(shè)定121℃高壓滅菌20min。冷卻至55℃傾注滅菌平板備用。

2.1.1.5 半固體動力培養(yǎng)基

稱取22.0g加入1L蒸餾水中，加熱煮沸至完全溶解，用立式壓力蒸汽滅菌器設(shè)定121℃高壓滅菌20min，備用。

2.1.1.6 胰蛋白胨大豆瓊脂 （TSA）

稱取TSA38.0g加入1L蒸餾水中，加熱煮沸至完全溶解，用立式壓力蒸汽滅菌器設(shè)定121℃高壓滅菌20min，備用。

2.1.1.7 普通肉湯培養(yǎng)基

稱取30.0g，加熱溶解加入1000ml蒸餾水中，并不停攪拌，煮沸1min，分裝三角燒瓶，滅菌鍋121℃高壓滅菌20min，備用。

2.1.2 涂片及染色

將可疑菌落進行革蘭氏染色[2]，鏡檢。首先用酒精燈滅菌的接種環(huán)挑取菌落均勻涂布于潔凈玻片上，自然干燥后火焰固定，以微燙手背的溫度為標準。待冷卻后加結(jié)晶紫溶液進行初染1min，之后水洗，甩干。再加革蘭氏碘溶液進行媒染1min，之后水洗，甩干。用95%酒精脫色20～30s，之后水洗，甩干。最后用沙黃溶液復染30s之后水洗，用濾紙把水分吸干，鏡檢觀察染色的形態(tài)與特征。

2.1.3 分離培養(yǎng)與觀察

在超凈工作臺上，以常規(guī)無菌操作用接種環(huán)挑取雞胚組織，分別接種于普通瓊脂培養(yǎng)基、伊紅美藍培養(yǎng)基、麥康凱培養(yǎng)基、SS培養(yǎng)基。于37℃下培養(yǎng)24h后，挑取不同形態(tài)特征的菌落進行培養(yǎng)，做進一步鑒定。

2.1.4 運動性觀察

用滅菌的接種針取培養(yǎng)物垂直穿刺接種于半固體培養(yǎng)基中央，放培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h后觀察。

2.1.5 生化試驗

用滅菌的接種針將前面所分離出的細菌分別接種葡萄糖、乳糖、麥芽糖、甘露醇、蔗糖等的糖發(fā)酵管及MR、VP、枸櫞酸鹽、氧化酶、硝酸鹽還原、檸檬酸鹽、尿素等生化試驗管。然后放入生化培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h后觀察結(jié)果。

2.2 動物致病性試驗

2.2.1 雞胚接種

將分離出的細菌接種于普通營養(yǎng)肉湯中，在37℃下培養(yǎng)24h，之后取提供的10日齡雞胚，其中5個用于接種試驗，另外5個作為對照試驗。試驗組雞胚尿囊腔注射接種2ml，另一個雞胚注射等量的生理鹽水作對照試驗[3]。

接種方法：①用照蛋器找到氣室，用記號筆標記出氣室邊緣，酒精棉消毒雞胚表面后，用大針頭打孔；②以2ml/枚的量垂直注入尿囊腔；③注射完后，用蠟封住打的孔。然后放入孵化箱內(nèi)繼續(xù)孵化，并觀察記錄雞胚的死亡情況。

2.2.2 雛雞接種

將分離出的細菌接種于普通營養(yǎng)肉湯中，在37℃下培養(yǎng)24h，取實驗室提供的10只雛雞，其中5只作為試驗組，另外5只作為對照組。然后以2ml/只的量注射到試驗雛雞的腹腔中。注射完后，拔出針頭，用棉球按壓，防止外溢造成污染。

2.2.3 小鼠接種

將分離出的細菌接種于普通營養(yǎng)肉湯中，在37℃下培養(yǎng)24h，取實驗室提供的10只小鼠，其中5只用于接種試驗，另外5只用于對照試驗。對試驗組小鼠腹腔注射2ml，對照組注射等量的生理鹽水。然后給小鼠充足的飲水、飼料，在同一環(huán)境下喂養(yǎng)，進行觀察和記錄。

2.3 藥敏試驗

將接種環(huán)置于酒精燈火焰上方進行滅菌，待接種環(huán)冷卻后挑取分離培養(yǎng)的細菌涂在營養(yǎng)培養(yǎng)基上，稍干后，將鑷子火焰高溫消毒后，夾起各種抗生素藥敏紙片貼于培養(yǎng)基表面，注意要完全接觸。藥敏制片要均勻的分布于培養(yǎng)基中，防止抑菌圈重疊，各藥敏制片的中心距離要大于24mm。記錄藥敏制片的名稱和位置，在15min后，將培養(yǎng)基放入培養(yǎng)箱中，37℃培養(yǎng)24h后，進行觀察并測定抑菌圈的直徑。然后根據(jù)抑菌圈直徑的大小來判斷該菌對各種藥物的敏感性。

判定標準：沒有抑菌圈為不敏感，抑菌圈直徑10mm以下則為低度敏感；直徑在10～15mm范圍內(nèi)為中度敏感；抑菌圈的直徑在15mm以上為高度敏感[4]。

3 試驗結(jié)果及分析

3.1 涂片染色結(jié)果

將涂片染色后的細菌進行鏡檢，視野中發(fā)現(xiàn)有大量紅色、革蘭氏陰性、短粗、兩端鈍圓的小桿狀菌，呈單個、成對或成叢分布，無芽胞，無莢膜。

3.2 分離培養(yǎng)結(jié)果

該菌在SS瓊脂平板培養(yǎng)基上生長為無色半透明菌落，一部分菌落中間有黑色；在麥康凱培養(yǎng)基上觀察菌落為無色透明濕潤、圓形凸起、周邊不整齊；在普通瓊脂平板上菌落為圓形隆起、無色半透明、光滑。該菌在肉湯中培養(yǎng)24h后觀察，混濁，放置后有沉淀，震蕩試管，有絮狀物升起。其培養(yǎng)特性與沙門氏菌相同。

從被檢死亡雞胚的卵黃囊細菌檢出情況為：20枚雞胚中有10枚分離出細菌，帶菌率為50%，其中沙門氏菌有3株，帶菌率6.67%。

3.3 運動性觀察結(jié)果

人工培養(yǎng)后用滅菌的接種針取單一菌落垂直接種于半固體培養(yǎng)基，將其放入生化培養(yǎng)箱中37℃培養(yǎng)24h后，觀察半固體培養(yǎng)基呈云霧狀。

3.4 生化試驗結(jié)果

在生化培養(yǎng)基中接種營養(yǎng)培養(yǎng)基上的沙門氏菌，將細菌生化常規(guī)微量鑒定管倒置放入生化培養(yǎng)箱，37℃培養(yǎng)24h后。觀察結(jié)果枸櫞酸鹽試驗為陽性，VP試驗為陰性，尿素分解試驗為陰性。硝酸鹽還原試驗陽性。分解葡萄糖、甘露醇產(chǎn)酸產(chǎn)氣，分解麥芽糖、山梨醇產(chǎn)酸不產(chǎn)氣，不分解蔗糖、半乳糖。根據(jù)以上結(jié)果，確定該致病菌生化試驗結(jié)果與沙門氏菌相同。

3.5 雞胚接種結(jié)果

經(jīng)尿囊腔接種的雞胚試驗組37h內(nèi)全部死亡，對照組均健活。剖檢死亡的雞胚發(fā)現(xiàn)其卵黃吸收不良，卵黃囊有炎癥，并且有黃綠色干酪樣物質(zhì)；肝臟充血淤血腫大；十二指腸內(nèi)有干酪樣物質(zhì)。

3.6 雛雞接種結(jié)果

腹腔接種5只試驗組雛雞表現(xiàn)為精神萎靡，食欲不振，臥地不起，病程長的有嚴重的脫水。剖檢后可以發(fā)現(xiàn)死亡雛雞肝腫大，表面有散在的出血點。消化道也有出血，呈點狀、帶狀，尤其是十二指腸，呈彌漫性出血。部分死亡雞只盲腸內(nèi)有灰白色的干酪物堵塞。在肝、脾、肺等處均能回收到該菌。對照組均健活。

3.7 小鼠接種結(jié)果

試驗組小鼠3日內(nèi)全部死亡對照組均健活。

3.8 藥敏試驗結(jié)果

根據(jù)判斷標準，分離菌對頭孢噻呋鈉和左旋氧氟沙星、四環(huán)素高敏，對鹽酸黃連素、丁胺卡那霉素、氧氟沙星、青霉素、硫酸慶大霉素中敏，對阿奇霉素、磷霉素鈣、恩諾沙星、鏈霉素產(chǎn)生了耐藥性。

4 討論

（1）通過流行病學調(diào)查、臨床癥狀、病理剖檢、病原的分離與鑒定及致病性試驗，確定死亡雞胚中病原為沙門氏菌。

（2）其中共20份死胚中，8份檢出了病原菌，帶菌率為40%。其中沙門氏菌3株，帶菌率15%。說明該孵化場孵化的雛雞沙門氏菌感染率較高，應(yīng)及早應(yīng)用抗菌藥物預防。

（3）沙門氏菌既可以水平傳播，也可垂直傳播。垂直傳播有兩種情況：一種是經(jīng)卵巢直接進入卵內(nèi)，另一種是經(jīng)過各種途徑污染蛋殼后進入卵內(nèi)。細菌通常在低溫時不能或很少通過蛋殼，但是隨著溫度的升高，則很容易通過蛋殼后而進入蛋內(nèi)。先在蛋黃內(nèi)增值，在孵化過程中便侵入胎兒體內(nèi)。該雞胚沙門氏菌的感染，也可能是同時由兩種傳播途徑造成的可能性，確診有待于進一步調(diào)查研究[5]。

（4）沙門氏菌復雜多樣，在公共衛(wèi)生學上普遍受到重視。因此，無論是種蛋還是商品蛋，都應(yīng)對其進行消毒滅菌處理，防止引起沙門氏菌病。在種蛋上孵前，要對種蛋進行消毒滅菌，防止種蛋在孵化過程中由于沙門氏菌的侵入而導致雞胚死亡。

[1]張正慶,羅薇,劉亞剛,等.禽源致病性沙門氏菌四環(huán)素耐藥性基因tetC的PCR擴增及序列分析[J].畜禽業(yè),2006,（24）:18-20.

[2]陳飛,成大榮,王麗芳,孫懷昌,張鑫宇,等.禽沙門氏菌毒力島標志基因研究與mgtC基因序列分析[J].江蘇農(nóng)業(yè)科學,2010（6）:12-13.

[3]仇莉,繆曉斌,賁巧云,韓書英,沈永華,等.江蘇東臺地區(qū)雞白痢沙門氏菌的耐藥性分析[J].獸醫(yī)導刊,2009（4）:23-25.

[4] 潘志明,焦新安,劉文博,高崧,倪振亞,張揚,劉學賢,張如寬,劉秀梵,等.雞白痢沙門氏菌耐藥性的監(jiān)測研究[J].畜牧獸醫(yī)學報,2002（4）:56-57.

[5]姚火春.獸醫(yī)微生物學實驗指導[M].第2版.北京：中國農(nóng)業(yè)出版社，2002.