張明軍++葉學(xué)球

摘要：目的：研究跑臺(tái)運(yùn)動(dòng)對(duì)Fetuin-A誘導(dǎo)的胰島素抵抗鼠肝臟MAPK和骨骼肌Akt磷酸化的影響，探索運(yùn)動(dòng)緩解Fetuin-A誘導(dǎo)的胰島素抵抗的肝臟和骨骼肌機(jī)制。方法：牛fetuin-A注射建立胰島素抵抗鼠模型。設(shè)一次性運(yùn)動(dòng)組（FOE）、8周運(yùn)動(dòng)組（FAE）、安靜對(duì)照組（FC）和正常安靜對(duì)照組（C）。免疫印記法、RT-PCR法檢測(cè)骨骼肌、肝臟和血液的相關(guān)指標(biāo)。結(jié)果：（1）與C組相比，各組實(shí)驗(yàn)鼠血清Fetuin-A、HOMA-IR和肝臟PEPCK表達(dá)均顯著增加（P<0.01），肝臟MAPK磷酸化、GK表達(dá)和肝糖原均顯著減少（P<0.01）；骨骼肌Akt磷酸化、GLUT4表達(dá)和葡萄糖攝取率均顯著減少（P <0.01）。（2）與FC組相比，F(xiàn)AE組肝臟MAPK磷酸化、GK表達(dá)和肝糖原含量均顯著增加（P<0.01），PEPCK表達(dá)顯著降低（P<0.01）；FOE組和FAE組骨骼肌Akt磷酸化、GLUT4表達(dá)和葡萄糖攝取率均顯著增加（P<0.01）。結(jié)論：運(yùn)動(dòng)能夠顯著改善Fe—tuin-A誘導(dǎo)的胰島素抵抗，機(jī)制涉及運(yùn)動(dòng)后肝臟MAPK磷酸化和骨骼肌Akt磷酸化增加，從而減少肝臟向血液過量釋放葡萄糖，并增加骨骼肌葡萄糖攝取。

關(guān)鍵詞：運(yùn)動(dòng)；Fetuin-A；胰島素抵抗；促分裂素原活化蛋白激酶；絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶

中圖分類號(hào)：G804 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

文章編號(hào)：1008-2808（2015）06-0024-07

來源于肝臟的Fetuin-A是胰島素刺激的胰島素受體酪氨酸激酶的天然抑制劑，通過抑制骨骼肌胰島素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，影響葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)，誘導(dǎo)胰島素抵抗。隨后的臨床流行病學(xué)研究發(fā)現(xiàn)了胰島素抵抗、糖尿病與高循環(huán)水平Fetuin-A之間的聯(lián)系證據(jù)，對(duì)數(shù)千名患者的流行病學(xué)調(diào)查研究顯示，F(xiàn)e-tuin -A的基因型及循環(huán)水平與身體的形態(tài)學(xué)特征（胖瘦以及腹部肥胖）關(guān)系密切。在肝臟中，F(xiàn)etuin-A調(diào)節(jié)肝細(xì)胞促分裂素原活化蛋白激酶（MAPK）的磷酸化，影響肝糖原合成和肝糖異生功能，妨礙餐后葡萄糖清除，調(diào)節(jié)肝臟向血液的葡萄糖釋放，導(dǎo)致血糖穩(wěn)態(tài)異常，參與糖尿病、胰島素抵抗產(chǎn)生和轉(zhuǎn)歸的病理過程。

與藥物治療以及熱量攝人控制的效果相似，運(yùn)動(dòng)也能夠降低成人和兒童的血清Fetuin-A水平，并伴隨胰島素抵抗的緩解。鑒于前期研究已經(jīng)證實(shí)：Fetuin-A誘導(dǎo)的胰島素抵抗機(jī)制分別涉及骨骼肌胰島素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和肝臟葡萄糖代謝功能異常，而運(yùn)動(dòng)能夠降低Fetuin-A誘導(dǎo)的胰島素抵抗，推測(cè)運(yùn)動(dòng)可能影響了異常的骨骼肌胰島素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和肝糖代謝過程。因此，本研究擬制備Fetuin-A誘導(dǎo)的胰島素抵抗模型，觀察一次和8周有氧運(yùn)動(dòng)后肝臟MAPK磷酸化、肝糖合成調(diào)節(jié)酶葡萄糖激酶（GK）、肝糖異生催化酶磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶（PEPCK）表達(dá)和肝糖原含量；骨骼肌胰島素信號(hào)通路中的絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶（Akt）磷酸化和葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白4（GLUT4）表達(dá)；嘗試分別在肝臟和骨骼肌層面揭示運(yùn)動(dòng)改善Fetuin-A誘導(dǎo)的胰島素抵抗機(jī)制。

1 實(shí)驗(yàn)材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

多克隆抗phospho-p44/42MAPK抗體、多克隆抗phospho-Akt抗體、Fetuin-A ELISA試劑盒、胰島素放射免疫試劑盒、牛Fetuin-A（純度95%）和其它試劑均購白廈門慧嘉生物公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 實(shí)驗(yàn)鼠模型的制備和運(yùn)動(dòng)分組 8周齡SPF級(jí)雄性KM小鼠，平均體重42.8±3.9g，許可證：SCXK（粵）2013-0020，廣州中醫(yī)藥大學(xué)大學(xué)城實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。Fetuin-A誘導(dǎo)的胰島素抵抗鼠的制備方法參考Hennige AM[9]等的研究，實(shí)驗(yàn)鼠上午10：00腹腔注射95%牛Fetuin-A，每公斤體重注射0.75mg。胰島素抵抗指數(shù)（HOMA-IR）=空腹胰島素（IU/L）×空腹血糖（mmol/L）/22.5，用于檢驗(yàn)是否產(chǎn)生胰島素抵抗。對(duì)照組注射生理鹽水，注射8h后檢測(cè)并計(jì)算尾靜脈血HOMA-IR。Fetuin-A誘導(dǎo)的胰島素抵抗鼠模型制備成功（Fetuin-A注射組HOMA-IR：24.1±3.0；對(duì)照組HOMA-IR：12.5+2.2，p<0.01）.

Fetuin-A誘導(dǎo)的胰島素抵抗鼠隨機(jī)分組：安靜對(duì)照組（Fetuin-A control group，F(xiàn)C）、一次性運(yùn)動(dòng)組（Fetuin-A one time exercise group， FOE）、8周有氧運(yùn)動(dòng)組（Fetuin-A aerobic exercise group，F(xiàn)AE），另設(shè)未予Fetuin-A處理的正常安靜對(duì)照組（Control group，C），每組10只。鼠有氧運(yùn)動(dòng)處方參考Thomas DP等的研究，適應(yīng)性訓(xùn)練3天后，實(shí)驗(yàn)鼠每天下午3：00跑臺(tái)運(yùn)動(dòng)60min，5天/周，以70%-75%最大攝氧量強(qiáng)度作為有氧運(yùn)動(dòng)強(qiáng)度的參照，此強(qiáng)度對(duì)應(yīng)的跑臺(tái)速度為15m/min，F(xiàn)AE組持續(xù)訓(xùn)練8周，F(xiàn)OE組在第8周末取材前進(jìn)行一次相同運(yùn)動(dòng)處方內(nèi)容的訓(xùn)練。FAE組、FOE組和FC組每天Fetuin-A腹腔注射一次，持續(xù)8周，維持胰島素抵抗病理狀態(tài)。4只小鼠因?yàn)楦鞣N原因未能全程完成運(yùn)動(dòng)干預(yù)，最終納入統(tǒng)計(jì)的各組實(shí)驗(yàn)鼠數(shù)量均為6只。

1.2.2 血清Fetuin-A、HOMA-IR和肝糖原含量檢測(cè) FAE組實(shí)驗(yàn)鼠最后一次運(yùn)動(dòng)后休息過夜，取材前各組實(shí)驗(yàn)鼠禁食12h，第二日下午4：00 FOE組運(yùn)動(dòng)后立即與FAE組實(shí)驗(yàn)鼠均腹腔注射10%水合氯醛，心臟取血，處死后取肝臟組織和腓腸肌組織備用。血清Fetuin-A檢測(cè)采用酶聯(lián)免疫法，空腹胰島素檢測(cè)采用放射免疫法，空腹血糖檢測(cè)采用酶法。肝糖原含量測(cè)定采用蒽酮顯色法，以每100g肝組織中所含糖原量為實(shí)際肝糖原含量。

1.2.3 肝臟MAPK磷酸化、骨骼肌Akt磷酸化檢測(cè) 免疫印記法檢測(cè)肝臟MAPK和骨骼肌Akt磷酸化。骨骼肌予胰島素（lOnmol/L）和D-葡萄糖（25mmol/l）孵育20min預(yù)處理。分別提取肝臟和骨骼肌待測(cè)細(xì)胞的總蛋白，lOOug細(xì)胞裂解上清溶解物SDS-PAGE蛋白分離、轉(zhuǎn)膜3h，分別加抗phospho - p44/42MAPK和抗phospho-Akt抗體（工作濃度均為1：800），洗膜，加辣根過氧化物酶標(biāo)記的Ⅱ抗；曝光，洗滌后DAB顯色，光密度定量分析采用LeicaQ圖像分析儀。