孫艷美　趙良中　李　強(qiáng)　鐘　越　李　妍

(吉林醫(yī)藥學(xué)院檢驗(yàn)學(xué)院，吉林　吉林　132013)

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青蒿琥酯對(duì)白血病細(xì)胞增殖和凋亡的影響

孫艷美趙良中李強(qiáng)鐘越李妍

(吉林醫(yī)藥學(xué)院檢驗(yàn)學(xué)院，吉林吉林132013)

摘要〔〕目的研究青蒿琥酯對(duì)髓系白血病細(xì)胞株K562的增殖抑制和凋亡作用，分析其抗腫瘤機(jī)制。方法體外培養(yǎng)K562細(xì)胞，應(yīng)用不同濃度的青蒿琥酯處理細(xì)胞，臺(tái)盼藍(lán)染色分析細(xì)胞活力，WST-1還原法檢測細(xì)胞增殖，流式細(xì)胞術(shù)分析細(xì)胞凋亡和周期，采用免疫印跡技術(shù)分析Bax和Bcl-2表達(dá)。結(jié)果K562細(xì)胞活力隨著藥物濃度的增加而下降，而FTY720對(duì)細(xì)胞增殖的抑制作用隨藥物濃度增加而增加。藥物作用72 h，K562細(xì)胞的IC50值為95 μmol/L；與對(duì)照組比較，50 μmol/L和100 μmol/L青蒿琥酯處理48 h導(dǎo)致S期細(xì)胞減少，G2M期細(xì)胞增加；當(dāng)濃度達(dá)到200 μmol/L后，G2M期細(xì)胞減少，但死亡細(xì)胞增加到39.65%。雙染和流式細(xì)胞術(shù)分析發(fā)現(xiàn)，100 μmol/L青蒿琥酯作用24 h后，早期凋亡細(xì)胞百分率增加；與對(duì)照組比較，青蒿琥酯導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)Bax表達(dá)增加。結(jié)論青蒿琥酯可通過誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡和抑制細(xì)胞增殖而發(fā)揮抗腫瘤作用，其線粒體途徑可能參與細(xì)胞凋亡過程。

關(guān)鍵詞〔〕青蒿琥酯；白血??；凋亡

第一作者：孫艷美(1978-)，女，講師，碩士，主要從事中草藥免疫作用研究。

青蒿素(artemisinin)是中草藥黃花蒿中的抗瘧成分，青蒿琥酯(artesunate)為其酯化學(xué)修飾的水溶性衍生物〔1〕，對(duì)體外培養(yǎng)的肝癌細(xì)胞、乳腺癌細(xì)胞和肺癌細(xì)胞均有不同程度的抑制作用〔2〕。青蒿琥酯抗腫瘤機(jī)制涉及誘導(dǎo)活性氧(ROS)產(chǎn)生及ROS依賴的DNA損傷、抑制血管生成、誘導(dǎo)凋亡和細(xì)胞周期阻滯〔3〕，但對(duì)白血病細(xì)胞增殖和凋亡研究較少。本實(shí)驗(yàn)將探索青蒿琥酯對(duì)白血病K562細(xì)胞活力、增殖、周期和凋亡的影響。

1材料與方法

1.1材料RPMI1640培養(yǎng)液(北京邁晨科技有限公司)；青蒿琥酯、臺(tái)盼藍(lán)(百靈威生物科技有限公司)；WST-1、PI(碧云天生物科技有限公司)；Annexin-V-FITC/PI雙染凋亡試劑盒(購自美國eBiocience公司)。

1.2方法

1.2.1細(xì)胞培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)前1 w，自液氮中復(fù)蘇K562細(xì)胞，在含有10%血清的1640培養(yǎng)液中培養(yǎng)，每周傳代3次，取對(duì)數(shù)生長期的細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)。

1.2.2細(xì)胞活力檢測接種K562細(xì)胞于6孔細(xì)胞培養(yǎng)板，實(shí)驗(yàn)組加入青蒿琥酯至終濃度分別為12.5,25,50,100,200和400 μmol/L，繼續(xù)培養(yǎng)至24 h。吹打混勻細(xì)胞，取細(xì)胞懸液50 μl，加入等量0.4%的臺(tái)盼藍(lán)染液，染色2 min后，加入血細(xì)胞計(jì)數(shù)板，計(jì)數(shù)四角大方格細(xì)胞總數(shù)和藍(lán)色細(xì)胞數(shù)。細(xì)胞活力(%)=活細(xì)胞數(shù)/細(xì)胞總數(shù)×100%。

1.2.3細(xì)胞凋亡檢測收集不同濃度青蒿琥酯處理24 h的K562細(xì)胞，每組取1×106個(gè)細(xì)胞，雙染凋亡緩沖液洗滌1次，200 μl緩沖液懸起細(xì)胞，加入5 μl的Annexin-V FITC，室溫避光孵育30 min。緩沖液洗滌2次，400 μl的緩沖液重懸細(xì)胞，加入5 μl PI染液后用流式細(xì)胞儀檢測分析。

1.2.4細(xì)胞增殖檢測接種細(xì)胞于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板，分別加青蒿琥酯至0，12.5，25，50，100，200和400 μmol/L，培養(yǎng)至68 h；對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組每孔加入WST-1溶液20 μl，空白組加入20 μl PBS，繼續(xù)培養(yǎng)至72 h。用多功能酶聯(lián)檢測分析儀檢測450 nm各孔吸光度值(A450)，取3次實(shí)驗(yàn)的均值代表最終濃度。按公式計(jì)算細(xì)胞增殖抑制率(IR)。IR(%)=〔1-(實(shí)驗(yàn)組A450-空白組A450)/(對(duì)照組A450-空白組A450)〕×100%。

1.2.5細(xì)胞周期分析收集不同濃度青蒿琥酯處理至48 h的K562細(xì)胞，PBS洗滌2次后用80%甲醇溶液固定細(xì)胞，置于-20℃保存。檢測前，離心棄上清，PBS洗滌細(xì)胞，用400 μl的PI染色液重懸細(xì)胞，室溫染色30 min后流式細(xì)胞術(shù)分析。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)分析計(jì)量資料組間比較行t檢驗(yàn)。

2結(jié)果

2.1不同濃度青蒿琥酯對(duì)K562細(xì)胞活力的影響隨著青蒿琥酯(0，12.5,25,50,100,200和400 μmol/L)藥物濃度的增加，細(xì)胞活力下降，依次為(98.9±2.3)%，(94.0±6.5)%(94.4±4.5)%，(88.2±5.2)%，(75.4±6.4)%，(67.0±4.8)%，(37.9±6.2)%。

2.2青蒿琥酯對(duì)K562細(xì)胞凋亡的影響100 μmol/L青蒿琥酯作用24 h后，早期凋亡(2.48±0.9)%、晚期凋亡(9.96±1.5)%和壞死細(xì)胞(3.25±0.5)%均比對(duì)照組(1.46±0.7)%、(2.79±0.6)%、(1.68±0.4)%增加。

2.3青蒿琥酯對(duì)K562細(xì)胞Bcl-2家族分子表達(dá)的影響100 μmol/L青蒿琥酯作用24 h后，細(xì)胞內(nèi)Bax表達(dá)增加，Bcl-2表達(dá)無明顯變化。見圖1。

圖1　青蒿琥酯對(duì)Bax和Bcl-2表達(dá)的影響

2.4青蒿琥酯對(duì)K562細(xì)胞周期的影響與對(duì)照組比較，50 μmol/L青蒿琥酯導(dǎo)致K562細(xì)胞S期細(xì)胞百分率減少，而G2M期細(xì)胞百分率略增加；當(dāng)濃度達(dá)到100 μmol/L和200 μmol/L后，細(xì)胞發(fā)生明顯凋亡，G2M期細(xì)胞增加；較高濃度的青蒿琥酯(200 μmol/L)處理后，細(xì)胞凋亡可達(dá)39.65%，同時(shí)發(fā)現(xiàn)S和G2M期細(xì)胞均減少。見表1。

青蒿琥酯(μmol/L)SubG1G0G1SG2M01.56±0.2951.82±1.6625.83±0.9020.78±1.985011.19±0.911)44.31±1.281)22.84±1.731)21.66±2.3310013.34±1.271)41.77±2.051)21.09±1.551)23.80±2.421)20037.75±1.881)30.99±2.551)10.92±1.041)21.39±3.48

與0 μmol/L組比較：1)P<0.05

2.5不同濃度青蒿琥酯對(duì)K562細(xì)胞增殖的影響隨著藥物濃度增加，細(xì)胞增殖受到明顯抑制，加入12.5、25、50、100、200、400 μmol/L青蒿琥酯后，細(xì)胞增殖抑制率分別為(6.90±3.3)%，(17.8±5.5)%，(38.4±5.8)%，(52.8±6.1)%，(64.0±5.8)%，(69.9±7.2)%。50%增殖抑制濃度(IC50值)約為95.0 μmol/L。

3討論

本研究發(fā)現(xiàn)，青蒿琥酯處理細(xì)胞24 h，低濃度組(≤50 μmol/L)對(duì)細(xì)胞活力無明顯影響，但隨著濃度增加，細(xì)胞活力明顯下降。PI和Annexin-V雙染分析證實(shí)100 μmol/L青蒿琥酯誘導(dǎo)24 h，細(xì)胞以發(fā)生早期凋亡為主。

正常生長細(xì)胞若凋亡減少、分化能力異?；蛟鲋尺^于旺盛，往往導(dǎo)致細(xì)胞轉(zhuǎn)化和癌變〔4〕。分析藥物對(duì)腫瘤細(xì)胞是否具有誘導(dǎo)凋亡或促進(jìn)分化作用，是篩選抗腫瘤藥物的重要觀察指標(biāo)。有研究報(bào)道，青蒿琥脂可導(dǎo)致肺腺癌細(xì)胞內(nèi)ROS增加，并誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡〔5〕。線粒體是細(xì)胞內(nèi)氧化呼吸，產(chǎn)生能量的細(xì)胞器。雖然代謝過程中線粒體產(chǎn)生ROS，但過量的ROS將導(dǎo)致線粒體膜內(nèi)外電位差下降，線粒體功能損傷〔6〕。Bcl-2家族成員在調(diào)控凋亡中發(fā)揮重要作用，分為抗凋亡和促凋亡兩類，前者包括Bcl-2、Bcl-XL，后者有Bid,Bax,Bad和Bim等〔7〕?？沟蛲龊痛俚蛲龇肿釉诰€粒體膜的分布，尤其是Bax與Bcl-2的比例和分布是調(diào)節(jié)線粒體膜通透性和穩(wěn)定性的關(guān)鍵因素〔8，9〕。ROS與Bcl-2家族成員間具有復(fù)雜的關(guān)系，例如，ROS耦聯(lián)的轉(zhuǎn)錄因子可促進(jìn)抗凋亡分子Bax和Bim的表達(dá)。本研究結(jié)果顯示，青蒿琥酯可導(dǎo)致細(xì)胞周期變化和誘導(dǎo)凋亡而發(fā)揮抗腫瘤效應(yīng),通過線粒體途徑誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。本研究闡明了青蒿琥酯抗腫瘤的機(jī)制，對(duì)開發(fā)利用其新用途提供了理論依據(jù)。

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〔2015-01-17修回〕

(編輯徐杰)

The effects of cell proliferation and apoptosis induced by Artesunate on leukemia cell

SUN Yan-Mei, ZHAO Liang-Zhong, LI Qiang,etal.

Academy of Laboratory，Jilin Medical University，Jilin 132013，Jilin，China

【Abstract】ObjectiveTo study the effect of artesunate on inhibition of proliferation and apoptosis of myeloid leukemia cell line K562, and analyze its mechanism of antitumor.MethodsIn vitro, K562 cells were cultivated and applicated by different concentrations of artesunate. The cell vitality was analyzed by trypan blue staining. Proliferation was analyzed by WST-1 reduction method.Apoptosis and cycle of cells were analyzed by flow cytometry, Bax and Bcl-2 expressions were tested by Western blotting.ResultsK562 cell vitality decreased with the increase of drug concentration, and inhibition of cell proliferation was increased with the increase of FTY720 drug concentration. After 72 h of drug effect, K562 IC50 was 95 μmol/L.Compared with those of control group, 50 and 100 μmol/L artesunate for 48 h caused a decline of K562 cells in the S phase, and slightly increased in the G2M phase. Artesunate (200 μmol/L) induced reduction of K562 cells obviously in G2M phase,and the death rate was 39.65%. At 24 h, early apoptotic cells rate was increased in the concentration of 100 μmol/L artesunate by double staining analysis and flow cytometry. Compared with that of control group, Bax expression was higher by artesunate.ConclusionsArtesunate plays a role on anti-tumor by inducing cell apoptosis and inhibiting cell proliferation. The mitochondrial pathway may be involved in the process of cell apoptosis.

【Key words】Artesunate；Leukemia； Apoptosis

通訊作者：李妍(1972-)，女，教授，博士，碩士生導(dǎo)師，主要從事基礎(chǔ)免疫學(xué)研究。

基金項(xiàng)目：國家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(82102953)；吉林省科技廳重大科技攻關(guān)項(xiàng)目(20140203012YY)；吉林省科技廳中青年科技創(chuàng)新領(lǐng)軍人才及團(tuán)隊(duì)項(xiàng)目(20130521018JH)；吉林省衛(wèi)生廳項(xiàng)目(2012Z076)

中圖分類號(hào)〔〕R285.6〔

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼〕A〔

文章編號(hào)〕1005-9202(2015)23-6647-02；doi：10.3969/j.issn.1005-9202.2015.23.003