鄭　敏　謝琳娜　曾燕華　林德馨

(福建醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院生物化學(xué)與分子生物學(xué)系，福建　福州　350108)

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CD44、CD133及EpCAM與肝癌細(xì)胞成瘤性及耐藥性的相關(guān)性

鄭敏謝琳娜1曾燕華林德馨

(福建醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院生物化學(xué)與分子生物學(xué)系，福建福州350108)

摘要〔〕目的探討細(xì)胞表面標(biāo)志物組合與肝癌細(xì)胞的成瘤性及其對(duì)藥物抗性的相關(guān)性。方法利用目前廣泛用于肝癌干細(xì)胞鑒定與分離的三種細(xì)胞表面標(biāo)志物(CD44、CD133和EpCAM)對(duì)幾種肝癌細(xì)胞進(jìn)行表面標(biāo)志物表達(dá)分析，并通過腫瘤體外移植實(shí)驗(yàn)研究細(xì)胞成瘤性，用抗癌藥索拉非尼處理細(xì)胞，觀察不同類型細(xì)胞的耐藥性。結(jié)果Hep3B、SK-Hep-1和SNU182這三株細(xì)胞具有三種截然不同的細(xì)胞表面標(biāo)志物組合表達(dá)模式。CD44陽性與STAT3的激活和細(xì)胞對(duì)索拉非尼的抗性相關(guān)，而CD133/EpCAM雙陽性則與低成瘤性相關(guān)。結(jié)論該研究為肝癌干細(xì)胞的組合式分選鑒定的探索提供了新思路。

關(guān)鍵詞〔〕細(xì)胞表面標(biāo)志物；腫瘤干細(xì)胞；肝癌；索拉非尼

1福建生物工程職業(yè)技術(shù)學(xué)院健康產(chǎn)業(yè)研究院食品與生物工程系

第一作者：鄭敏(1982-)，男，講師，博士，主要從事腫瘤生物學(xué)研究。

肝癌是我國最常見的惡性腫瘤之一，五年生存率極低〔1〕。索拉非尼是美國FDA在2007年批準(zhǔn)的晚期肝癌的靶向治療藥物〔2,3〕。由于肝癌細(xì)胞的高耐藥性和轉(zhuǎn)移性，肝癌在術(shù)后仍有較高的復(fù)發(fā)率。目前，已有多種細(xì)胞表面標(biāo)志物被用于從肝癌細(xì)胞系甚至是人類肝癌樣本中鑒別和分離腫瘤干細(xì)胞〔4〕，其中CD133是最早被用于富集和分離肝癌干細(xì)胞的表面標(biāo)志物〔5〕。有研究〔6,7〕指出， CD133+/CD44+和EpCAM+/CD133+細(xì)胞群均比其他亞群的細(xì)胞具有更強(qiáng)的腫瘤干細(xì)胞特征。但是，在其他肝癌細(xì)胞中這3個(gè)細(xì)胞表面標(biāo)志物與腫瘤干細(xì)胞特征的相關(guān)性研究尚未見報(bào)道。本研究擬探討CD44、CD133和EpCAM的表達(dá)情況與肝癌細(xì)胞成瘤性及對(duì)索拉非尼耐藥性的關(guān)系。

1材料和方法

1.1實(shí)驗(yàn)材料DMEM(貨號(hào)SH30022.01B)購自賽默飛世爾公司。胎牛血清(貨號(hào)100-500)購自Gem Cell TM公司。E-cadherin抗體(貨號(hào)BD610181)購自BD公司。STAT3-Y705磷酸化抗體(貨號(hào)ab76315) 購自Abcam公司。gamma-tubulin抗體(貨號(hào)T6557)購自Sigma公司。β-akt-T308磷酸化抗體(貨號(hào)9275L)和Erk1/2-T202/Y204(貨號(hào)4370s)磷酸化抗體購自Cell Signaling公司。β-actin抗體(貨號(hào)sc-32251)購自Santa Cruz公司。PE耦聯(lián)的CD133抗體(貨號(hào)130-080-801)購自Miltenyi Biotec公司。Pacific Blue耦聯(lián)的EpCAM抗體(貨號(hào)324218)購自Biolegend公司。大鼠活化蛋白(APC)耦聯(lián)的CD44抗體(貨號(hào)17-0441-83)購自eBiosciences公司。SNU182，Hep3B和SK-Hep-1細(xì)胞系均由美國哈佛大學(xué)盧坤平教授饋贈(zèng)。細(xì)胞培養(yǎng)于含有10%血清的DMEM培養(yǎng)液中，放在含5%CO2的37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)〔8,9〕。

1.2細(xì)胞表面標(biāo)志物分析收集2×105個(gè)細(xì)胞，用相應(yīng)的抗體標(biāo)記后，流式細(xì)胞分析儀進(jìn)行分析〔10〕。在100 μl標(biāo)記體系中，EpCAM抗體加入5 μl，CD44抗體加入2 μl，CD133抗體加入4 μl。

1.3體外成瘤實(shí)驗(yàn)將5 000個(gè)細(xì)胞通過皮下注射到裸鼠背部兩側(cè)，每種細(xì)胞各進(jìn)行6次生物學(xué)重復(fù)。每3～4 d檢測腫瘤形成情況。腫瘤的體積以長×寬×高計(jì)算。

1.4基于Annexin-V/PI染色的細(xì)胞凋亡分析將飄起的細(xì)胞連同貼壁細(xì)胞一同收集。按照Roche公司的Annexin-V-FLUOS染色試劑盒(貨號(hào)11988549001)的說明對(duì)處理細(xì)胞進(jìn)行染色，并用流式細(xì)胞儀分析其凋亡情況。

1.5統(tǒng)計(jì)學(xué)方法應(yīng)用SPSS19.0軟件進(jìn)行分析。

2結(jié)果

圖1　CD133和EpCAM在Hep3B、SK-Hep-1和SNU182細(xì)胞的共表達(dá)分析

2.1CD44、CD133和EpCAM在肝癌細(xì)胞表面的表達(dá)流式細(xì)胞分析技術(shù)檢測結(jié)果顯示，Hep3B細(xì)胞CD133陽性98.7%、EpCAM陽性97.4%，CD44陽性0.8%；SK-Hep-1細(xì)胞中CD133陽性0.4%、EpCAM陽性6.3%，CD44陽性99.3%；在SNU182細(xì)胞中，CD44陽性率為99.0%，CD133和EpCAM的陽性率分別為68.2%、7.04%。

其中，超過95%以上的Hep3B和60%的SNU182都是EpCAM、CD133雙陽性。因?yàn)槌^95%的SNU182細(xì)胞是CD44陽性，所以這群CD133、EpCAM雙陽性的SNU182細(xì)胞同時(shí)也是CD44陽性細(xì)胞?；谏鲜鼋Y(jié)果，Hep3B、SK-Hep-1和SNU182分別代表著三種帶有不同表面標(biāo)志物表達(dá)方式的細(xì)胞。見圖1。

2.2CD133+/EpCAM+與低成瘤性相關(guān)腫瘤體外移植實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，在3個(gè)月內(nèi)，SK-Hep-1細(xì)胞可形成直徑約1 cm的腫瘤，而Hep3B和SNU182均未見腫瘤形成。 綜合各個(gè)細(xì)胞表面標(biāo)志物的表達(dá)情況，這一結(jié)果提示CD133、EpCAM雙陽性與低成瘤性有關(guān)。見圖2。

圖2　Hep3B、SK-Hep-1和SNU182細(xì)胞體外成瘤實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.3CD44+與STAT3激活和索拉非尼抗性相關(guān)在肝癌中，CD44-STAT3信號(hào)通路對(duì)于腫瘤細(xì)胞的抗凋亡十分重要〔11〕。對(duì)上述肝癌細(xì)胞內(nèi)的信號(hào)通路分析結(jié)果印證，STAT3的磷酸化修飾在CD44陽性細(xì)胞(SK-Hep-1和SNU182)中持續(xù)激活，而Erk和Akt的磷酸化則沒有顯著差異。見圖3。

圖3　Hep3B、SK-Hep-1和SNU182細(xì)胞中STAT3、Erk和Akt活性分析

用10 μmol/L的索拉非尼處理細(xì)胞，每隔12 h觀察細(xì)胞。結(jié)果顯示，大約60%的Hep3B細(xì)胞在處理72 h后飄起，而絕大多數(shù)的SK-Hep-1和SNU182細(xì)胞仍貼壁。通過基于Annexin-V和pI染色的細(xì)胞凋亡分析結(jié)果顯示，索拉非尼導(dǎo)致的細(xì)胞凋亡率在Hep3B中約為56%；在SK-Hep-1中約為11%，而在SNU182細(xì)胞中約為21%。由此可見，CD44陽性的SK-Hep-1和SNU182細(xì)胞較CD44陰性的Hep3B細(xì)胞對(duì)索拉非尼有著更加顯著的抗性。見圖4。

圖4　Hep3B、SK-Hep-1和SNU182對(duì)索拉非尼敏感性分析

3討論

腫瘤干細(xì)胞在肝癌的發(fā)生、發(fā)展和放化療抗性中發(fā)揮著十分重要的作用〔12〕。但是，肝癌干細(xì)胞的鑒定無論是在實(shí)驗(yàn)室還是臨床來說仍然是限制靶向肝癌干細(xì)胞的肝癌臨床治療的一個(gè)重要瓶頸。 到目前為止，包括CD13〔13〕、CD44〔9〕、CD90〔14〕、CD133〔9,15～17〕、EpCAM〔5〕和ALDH〔13〕在內(nèi)的多種表面標(biāo)志物都被用于肝癌干細(xì)胞的鑒定和分離。值得指出的是，目前仍然沒有公認(rèn)的肝癌干細(xì)胞表面標(biāo)志物，原因很可能與這些腫瘤表面標(biāo)志物的細(xì)胞特異性有關(guān)。以往，肝癌干細(xì)胞的表面標(biāo)志物是在一個(gè)特定的細(xì)胞系內(nèi)對(duì)不同亞群細(xì)胞的腫瘤干細(xì)胞特征進(jìn)行比較后確立的，很少在不同細(xì)胞系之間進(jìn)行比較。 即便是在不同細(xì)胞系之間發(fā)現(xiàn)差異，通常也被簡單地認(rèn)為是由于細(xì)胞系之間不同遺傳背景的差異所導(dǎo)致。因而，在不同細(xì)胞系間進(jìn)行細(xì)胞表面標(biāo)志物與肝癌干細(xì)胞特征的相關(guān)性研究往往被人們所忽略。

本研究發(fā)現(xiàn)CD44、CD133和EpCAM在不同細(xì)胞系中有著截然不同的組合表達(dá)方式。結(jié)果提示在肝癌這種異質(zhì)性程度高的癌癥中，CD44、CD133和EpCAM或者是他們中的2個(gè)或3個(gè)表面標(biāo)志物的組合并不足以用來普遍地指示肝癌干細(xì)胞的所有特征。若將表面標(biāo)志物進(jìn)行拆分，結(jié)果提示CD44+與STAT3的活性和細(xì)胞對(duì)索拉非尼抗性呈正相關(guān)，而CD133+/EpCAM+則與肝癌細(xì)胞的成瘤性呈負(fù)相關(guān)。這項(xiàng)研究結(jié)果受限于細(xì)胞系種類的數(shù)量，因而在更大范圍的肝癌細(xì)胞系中對(duì)細(xì)胞表面標(biāo)志物與肝癌干細(xì)胞特征的相關(guān)性研究是十分必要的。 這些結(jié)果將有助于對(duì)已有的以及新發(fā)現(xiàn)的細(xì)胞表面標(biāo)志物進(jìn)行普遍性評(píng)估，以此判定其是否可以作為肝癌干細(xì)胞的表面標(biāo)志物，為靶向肝癌干細(xì)胞的臨床治療提供切實(shí)可行的潛在靶點(diǎn)。

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〔2014-10-27修回〕

(編輯袁左鳴)

Correlation of CD44,CD133 and EpCAM with tumorigenicity and sorafenib resistance of liver cancer cells

ZHENG Min,XIE Lin-Na,ZENG Yan-Hua,etal.

Department of Biochemistry and Molecular Biology,School of Basic Medical Sciences,Fujian Medical University,Fuzhou 350108,Fujian,China

【Abstract】ObjectiveTo study the correlation of cell surface markers with tumorigenicity and sorafenib resistance in liver cancer cells.MethodsThe expressions of three wildly used surface markders (CD44,CD133 and EpCAM) were tested,xenograft based tumorigenicity and sorafenib sensitivity in several liver cancer cell lines were analyzed.ResultsHep3B,SK-Hep-1 and SNU182 cells were correlated with totally different surface-expression phenotypes. CD44+highly were correlated with STAT3 activation and sorafenib resistance,while CD133+/EpCAM+was associated with low cellular tumorigenicity.ConclusionsThis study might help define cell surface markers combinational pattern for identifying liver cancer stem cells.

【Key words】Surface markers；Cancer stem cells；Liver cancer；Sorafenib

基金項(xiàng)目：國家自然科學(xué)基金青年科學(xué)基金項(xiàng)目(31100995)；福建省中青年教師教育科研項(xiàng)目(JA14410)；福建省高校杰出青年科研人才項(xiàng)目(JA14129)

中圖分類號(hào)〔〕R735〔

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼〕A〔

文章編號(hào)〕1005-9202(2015)23--；doi：10.3969/j.issn.1005-9202.2015.23.011