杜若昕，郭欣燕(綜述)，張 偉，蘆希艷(審校)

(1.中國人民解放軍空軍軍醫(yī)大學(xué)藥學(xué)系生物制藥學(xué)教研室，陜西 西安 710032；2.中國人民解放軍空軍軍醫(yī)大學(xué)第二附屬醫(yī)院門診部，陜西 西安 710038)

肝細(xì)胞癌(hepatocellular carcinoma,HCC)是全球癌癥相關(guān)死亡的第二大原因，通常與病毒感染、過度飲酒或代謝綜合征導(dǎo)致的慢性肝炎密切相關(guān)。索拉非尼(Sorafenib)是被美國食品藥品局批準(zhǔn)的用于治療晚期HCC的一線藥物，其作為多靶點(diǎn)酪氨酸激酶抑制劑表現(xiàn)出抗腫瘤細(xì)胞增殖和抗血管生成的作用[1]。然而，僅約30%的HCC患者可從索拉非尼治療中獲益，且這部分患者通常在6個(gè)月內(nèi)就出現(xiàn)復(fù)發(fā)耐藥[2]。表觀遺傳學(xué)、細(xì)胞轉(zhuǎn)運(yùn)過程以及調(diào)節(jié)性細(xì)胞死亡均能介導(dǎo)HCC索拉非尼耐藥并發(fā)揮關(guān)鍵作用。本研究歸納總結(jié)了近年在索拉非尼耐藥研究方面取得的進(jìn)展，為探索克服耐藥性的新方法奠定了理論基礎(chǔ)。

1 表觀遺傳調(diào)控與HCC索拉非尼耐藥

表觀遺傳修飾可以在不改變DNA序列的情況下改變基因的表達(dá)狀態(tài)，并且有些修飾是可遺傳的。在某些情況下，表觀遺傳變化是動(dòng)態(tài)的，會(huì)對(duì)環(huán)境刺激作出反應(yīng)。表觀遺傳機(jī)制調(diào)節(jié)生物體內(nèi)發(fā)生的不同生理過程，包括細(xì)胞增殖和分化。因此，更深入地了解與HCC相關(guān)的表觀遺傳修飾可以為開發(fā)治療該疾病的創(chuàng)新方法奠定理論基礎(chǔ)。在此背景下，將描述不同類型的表觀遺傳機(jī)制及其與HCC索拉非尼耐藥的關(guān)系。

1.1甲基化 甲基化是指將甲基從活性甲基化合物(如 S-腺苷甲硫氨酸)催化轉(zhuǎn)移到其他化合物的過程，常見的例子包括RNA甲基化、組蛋白甲基化和DNA甲基化。異常甲基化導(dǎo)致基因表達(dá)發(fā)生改變，從而導(dǎo)致癌變。使用醫(yī)療芯片技術(shù)在經(jīng)過索拉非尼處理的HA22T/VGH細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)了1 230個(gè)存在甲基化差異的基因[3]。據(jù)報(bào)道，MORC家族CW型鋅指結(jié)構(gòu)蛋白2(microrchidia family CW-type zinc finger 2,MORC2)作為Hippo通路的調(diào)節(jié)因子對(duì)于維持HCC細(xì)胞在體外和裸鼠體內(nèi)的自我更新、索拉非尼耐藥性和致癌性至關(guān)重要[4]。生理?xiàng)l件下，神經(jīng)纖維素2(neurofibromin 2,NF2)和腎臟腦蛋白(kidney and brain protein,KIBRA)作為Hippo通路中的上游分子參與抑制細(xì)胞生長。病理?xiàng)l件下，MORC2在NF2和KIBRA的啟動(dòng)子處與DNA甲基轉(zhuǎn)移酶3A(DNA methyltransferase 3A,DNMT3A)結(jié)合形成復(fù)合物，導(dǎo)致兩者DNA超甲基化并伴隨轉(zhuǎn)錄抑制，從而解除Hippo通路對(duì)HCC細(xì)胞生長的抑制作用并增強(qiáng)HCC細(xì)胞索拉非尼耐藥性[4]。同時(shí)，長鏈非編碼RNA(long non-coding RNA,lncRNA) H19作為腫瘤研究領(lǐng)域的明星分子，其表達(dá)明顯受到表觀遺傳的控制，尤其是受到啟動(dòng)子甲基化的調(diào)節(jié)[5]。在所有六種建立的索拉非尼耐藥HCC細(xì)胞中，H19的表達(dá)均顯著下調(diào)。過表達(dá)H19可以顯著提高耐藥細(xì)胞對(duì)索拉非尼的敏感性，表明H19過表達(dá)可逆轉(zhuǎn)HCC索拉非尼耐藥。然而，也有研究發(fā)現(xiàn)，與索拉非尼敏感HCC組織相比，耐藥HCC中H19啟動(dòng)子甲基化程度顯著降低。雖然降低的啟動(dòng)子甲基化通常被認(rèn)為與升高的基因表達(dá)相關(guān)，但此項(xiàng)研究中大量數(shù)據(jù)表明啟動(dòng)子甲基化的減少與基因表達(dá)減少相關(guān)。因此，H19作為未來克服HCC索拉非尼耐藥性的潛在靶點(diǎn)，其表達(dá)與啟動(dòng)子甲基化之間的關(guān)系應(yīng)進(jìn)行進(jìn)一步的研究以闡明[5]?？傊?，這些證據(jù)表明索拉非尼可能會(huì)影響HCC中癌癥相關(guān)基因的甲基化水平，這對(duì)于追蹤索拉非尼耐藥性很有價(jià)值。

1.2基于非編碼RNA的機(jī)制 越來越多的證據(jù)表明，非編碼RNA(noncoding RNA,ncRNA)，包括lncRNA和微小RNA(microRNA,miRNA)，對(duì)于HCC中索拉非尼耐藥性的發(fā)展至關(guān)重要。lncRNA 小核仁RNA宿主基因3(small nucleolar RNA host gene 3,SNHG3)在高轉(zhuǎn)移性HCC細(xì)胞中的表達(dá)顯著高于低轉(zhuǎn)移性HCC細(xì)胞，并通過調(diào)節(jié)miR-128/CD151信號(hào)軸，誘導(dǎo)上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithelial-mesenchymal transition,EMT)進(jìn)而導(dǎo)致HCC索拉非尼耐藥。據(jù)報(bào)道，lncRNA 小核仁RNA宿主基因16(small nucleolar RNA host gene 16,SNHG16)在HepG2索拉非尼耐藥細(xì)胞中表達(dá)上調(diào)，并且體外和體內(nèi)實(shí)驗(yàn)都證實(shí)敲低SNHG16可增加HepG2索拉非尼耐藥細(xì)胞對(duì)索拉非尼的敏感性，進(jìn)一步的機(jī)制研究表明，在HepG2細(xì)胞中，SNHG16可能通過吸附HCC細(xì)胞內(nèi)miR-140-5p導(dǎo)致索拉非尼耐藥[6]。miR-591的過表達(dá)可抑制遠(yuǎn)端上游元件結(jié)合蛋白2(far upstream elemental binding protein 2,FBP2)所介導(dǎo)的PI3K/AKT/mTOR信號(hào)通路激活，從而抑制HCC細(xì)胞的耐藥性，包括索拉非尼耐藥性[7]。另外，miR-622過表達(dá)能夠特異性抑制鼠類肉瘤病毒癌基因(kirsten rat sarcoma viral oncogene,KRAS)基因表達(dá)，導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)Raf/ERK和PI3K/AKT通路受抑制并使索拉非尼耐藥細(xì)胞重新恢復(fù)對(duì)索拉非尼的敏感性[8]。這些研究提示，靶向ncRNAs可能代表一種克服HCC中索拉非尼耐藥性的一種治療方法。然而，許多ncRNAs在癌癥進(jìn)展中失調(diào)。因此需要進(jìn)一步的研究來確定ncRNA在腫瘤進(jìn)展中是驅(qū)動(dòng)因素還是中間媒介物。此外，目前的研究?jī)H關(guān)注lncRNAs作為miRNA的內(nèi)源性互補(bǔ)物在調(diào)節(jié)靶基因表達(dá)和介導(dǎo)HCC索拉非尼耐藥性的作用。以往的研究表明，lncRNAs還可通過更多的機(jī)制發(fā)揮作用，例如與蛋白質(zhì)結(jié)合來調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)翻譯、干擾編碼相鄰蛋白質(zhì)的基因表達(dá)、與蛋白質(zhì)形成復(fù)合物來調(diào)節(jié)基因轉(zhuǎn)錄等，這些都是需要進(jìn)一步探索的領(lǐng)域[9-10]。

2 細(xì)胞轉(zhuǎn)運(yùn)過程與HCC索拉非尼耐藥

索拉非尼耐藥同樣與ATP結(jié)合盒式(ATP binding cassette,ABC)轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白相關(guān)，后者通過將藥物從癌細(xì)胞中轉(zhuǎn)移出去以降低藥物的有效濃度，導(dǎo)致耐藥[11]。另一方面，外泌體是細(xì)胞間信息交互的載體和腫瘤微環(huán)境的調(diào)節(jié)劑。在正常細(xì)胞中，外泌體能夠通過運(yùn)輸轉(zhuǎn)移細(xì)胞內(nèi)的生物分子，但這種機(jī)制可能在癌細(xì)胞中被挾持利用[12-13]。因此，將回顧具體的細(xì)胞轉(zhuǎn)運(yùn)過程與HCC索拉非尼耐藥的機(jī)制。

2.1ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白 包括索拉非尼在內(nèi)的幾種多靶點(diǎn)酪氨酸激酶抑制劑(tyrosine kinase inhibitors,TKI)與ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白之間的關(guān)系已被證實(shí)[11]。細(xì)胞轉(zhuǎn)運(yùn)過程中，TKI藥物作為ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的底物從HCC細(xì)胞中轉(zhuǎn)移出去，以降低細(xì)胞內(nèi)藥物濃度并導(dǎo)致耐藥。其轉(zhuǎn)運(yùn)效率取決于特定的轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白表達(dá)、聯(lián)合治療的藥物類型、TKI對(duì)轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的親和力及其濃度。研究發(fā)現(xiàn)，CRYO(許多精油的天然倍半萜成分)在無毒劑量下可以抑制ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白功能，導(dǎo)致索拉非尼在HCC細(xì)胞中蓄積并提高HCC細(xì)胞對(duì)索拉非尼的敏感度[14]；同時(shí)CRYO能夠抑制索拉非尼的降解，促進(jìn)其在細(xì)胞內(nèi)積累，最終加強(qiáng)索拉非尼對(duì)癌細(xì)胞殺傷力。另一項(xiàng)研究報(bào)道了COP9信號(hào)復(fù)合體5(COP9 signalosome 5,CSN5)與HCC索拉非尼耐藥性的關(guān)系。下調(diào)細(xì)胞中CSN5表達(dá)，導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)幾種藥物外排蛋白的表達(dá)顯著下降，索拉非尼在細(xì)胞內(nèi)蓄積，最終逆轉(zhuǎn)索拉非尼耐藥。

2.2外泌體 外泌體是一種胞外囊泡(extracellular vesicles,EV)，負(fù)責(zé)細(xì)胞間信息交流，現(xiàn)今已成為治療靶點(diǎn)[15-16]。HCC細(xì)胞來源的外泌體將某些關(guān)鍵的miRNA、lncRNA和蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移至腫瘤微環(huán)境的受體細(xì)胞，主要包括上皮細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞和成纖維細(xì)胞，通過改變受體細(xì)胞生物學(xué)行為實(shí)現(xiàn)炎癥細(xì)胞浸潤、血管生成、獲得腫瘤相關(guān)細(xì)胞表型以及HCC細(xì)胞索拉非尼耐藥性[12-13]。其中，HCC細(xì)胞釋放攜帶miR-221-3p的外泌體(miR-221-3p-exo)并傳遞至人淋巴管內(nèi)皮細(xì)胞(human lymphatic endothelial cells,HLEC)，通過顯著降低血管/淋巴管抑制蛋白(vasohibin-1,VASH1)的表達(dá)激活ERK/AKT信號(hào)通路、促進(jìn)HCC中淋巴管生成以及介導(dǎo)索拉非尼耐藥。同時(shí)，HCC細(xì)胞釋放攜帶miR-142-3p的外泌體(miR-142-3p-exo)并傳遞至肝臟內(nèi)皮細(xì)胞，通過抑制內(nèi)皮細(xì)胞中TGFβR1的表達(dá)促進(jìn)血管生成并介導(dǎo)索拉非尼耐藥。由于外泌體可有效地實(shí)現(xiàn)胞間交流，因此可以將外泌體用作一種治療策略，比如在外泌體中裝載功能蛋白、ncRNA和化療藥物等治療劑。考慮到miR-122可以抑制HCC細(xì)胞的致瘤特性并逆轉(zhuǎn)索拉非尼耐藥性，使用載體裝載miR-122遞送可能代表一種有前景的HCC治療方法。miR-122轉(zhuǎn)染的脂肪組織間充質(zhì)干細(xì)胞(adipose tissue mesenchymal stem cells,AMSCs)已被證明可以有效地將miR-122包裝在其釋放的外泌體中。同時(shí)，體內(nèi)實(shí)驗(yàn)表明在腫瘤內(nèi)注射攜帶miR-122的外泌體(miR-122-exo)可通過顯著提高索拉非尼治療HCC的抗腫瘤性能逆轉(zhuǎn)耐藥性。

3 調(diào)節(jié)性細(xì)胞死亡(regulated cell death,RCD)與HCC索拉非尼耐藥

RCD用于描述當(dāng)其他適應(yīng)性反應(yīng)無法恢復(fù)細(xì)胞內(nèi)穩(wěn)態(tài)時(shí)，細(xì)胞通過相應(yīng)分子機(jī)制調(diào)節(jié)死亡。根據(jù)其分子機(jī)制的不同，RCD可分為不同的類別，包括細(xì)胞凋亡、自噬性細(xì)胞死亡、細(xì)胞壞死和鐵死亡等[17]。據(jù)報(bào)道，RCD，尤其是自噬和鐵死亡，與HCC的索拉非尼耐藥性有關(guān)。

3.1細(xì)胞自噬 自噬是真核生物細(xì)胞內(nèi)物質(zhì)周轉(zhuǎn)的重要過程，這是一種溶酶體降解途徑，用于分解細(xì)胞內(nèi)受損的蛋白質(zhì)和細(xì)胞器。自噬在癌細(xì)胞中發(fā)揮的作用是一把雙刃劍。正常情況以及在HCC發(fā)展的初期階段，細(xì)胞自噬是維持正常細(xì)胞基因組穩(wěn)定性的癌癥抑制因子；而在晚期HCC中，腫瘤細(xì)胞通過自噬募集能量，提高在缺氧和低營養(yǎng)環(huán)境下的存活能力。同時(shí)，自噬也被認(rèn)為是介導(dǎo)索拉非尼耐藥的重要因素，因?yàn)榭梢灾С諬CC細(xì)胞在治療中和代謝壓力下的存活，與細(xì)胞自噬相關(guān)的信號(hào)通路顯示，索拉非尼可通過非mTOR依賴和mTOR依賴兩種方式激活不同的信號(hào)通路實(shí)現(xiàn)對(duì)自噬的雙向調(diào)節(jié)(圖1)。研究表明，多種自噬相關(guān)基因與HCC細(xì)胞索拉非尼耐藥密切相關(guān)，如自噬相關(guān)基因7(autophagy-related gene-7,ATG7)的表達(dá)上調(diào)是產(chǎn)生保護(hù)性自噬的標(biāo)志之一，并且在該基因被敲除后HCC細(xì)胞對(duì)索拉非尼的敏感度得以恢復(fù)。進(jìn)一步的研究表明，索拉非尼可通過非mTOR依賴和mTOR依賴兩種方式實(shí)現(xiàn)對(duì)自噬的雙向調(diào)節(jié)。索拉非尼通過誘導(dǎo)非mTOR依賴的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激激活保護(hù)性自噬并介導(dǎo)HCC耐藥；然而持續(xù)性治療可激活由FBP2介導(dǎo)的PI3K/AKT/mTOR信號(hào)通路，其中mTOR是自噬的負(fù)調(diào)控因子。因此，特異性抑制AKT可以解除mTOR對(duì)自噬的負(fù)調(diào)控作用，從而通過將保護(hù)性自噬轉(zhuǎn)換為自噬性細(xì)胞死亡來逆轉(zhuǎn)索拉非尼耐藥。以上證據(jù)表明，保護(hù)性自噬是HCC細(xì)胞介導(dǎo)索拉非尼耐藥的重要因素，逆轉(zhuǎn)耐藥性可以通過抑制自噬使其無法實(shí)現(xiàn)細(xì)胞保護(hù)的目的或者進(jìn)一步提升自噬水平達(dá)到自噬性細(xì)胞死亡這2種方法。

3.2鐵死亡 鐵死亡是最近發(fā)現(xiàn)的一種非細(xì)胞凋亡的RCD過程，涉及鐵離子介導(dǎo)的脂質(zhì)氧化物的異常累積，造成細(xì)胞死亡。在這個(gè)過程中，各種誘導(dǎo)劑打破細(xì)胞氧化還原平衡，產(chǎn)生大量脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物，從而引發(fā)細(xì)胞死亡。越來越多的研究表明，索拉非尼可在不同的癌細(xì)胞系中誘導(dǎo)鐵死亡，同時(shí)鐵死亡又與索拉非尼耐藥機(jī)制密切相關(guān)，導(dǎo)致鐵死亡的關(guān)鍵因素是鐵離子介導(dǎo)的脂質(zhì)氧化物的異常累積，該圖顯示了調(diào)節(jié)鐵離子和脂質(zhì)過氧化的相關(guān)途徑(圖2)[18]。最近的一項(xiàng)研究報(bào)道稱，應(yīng)用鐵螯合劑去鐵胺(deferoxamine,DFO)螯合細(xì)胞內(nèi)不穩(wěn)定鐵離子可顯著保護(hù)HCC細(xì)胞免受索拉非尼的細(xì)胞毒性作用。同時(shí)，研究發(fā)現(xiàn)DFO并不會(huì)阻止索拉非尼靶向細(xì)胞內(nèi)激酶。相反，螯合細(xì)胞內(nèi)不穩(wěn)定鐵離子進(jìn)一步阻止了索拉非尼在HCC細(xì)胞中誘導(dǎo)氧化應(yīng)激。另一方面，金屬硫蛋白(metallothionein,MT-1G)通過抑制鐵死亡促進(jìn)索拉非尼耐藥，是HCC中索拉非尼耐藥性的關(guān)鍵調(diào)節(jié)劑和有希望的治療靶點(diǎn)。索拉非尼可通過誘發(fā)氧化應(yīng)激促使HCC細(xì)胞MT-1G基因高表達(dá)，通過對(duì)比接受索拉非尼治療的晚期HCC患者血清中的MT-1G濃度，發(fā)現(xiàn)MT-1G高表達(dá)的HCC患者接受索拉非尼治療多預(yù)后不良，提示MT-1G也可以作為晚期HCC患者接受索拉非尼治療的潛在預(yù)后指標(biāo)，敲低MT-1G的表達(dá)會(huì)增加細(xì)胞內(nèi)谷胱甘肽消耗和脂質(zhì)過氧化，有助于增強(qiáng)索拉非尼誘導(dǎo)的鐵死亡?？傊?，索拉非尼介導(dǎo)的HCC細(xì)胞鐵死亡是不依賴于其介導(dǎo)激酶的抑制作用，甚至是其發(fā)揮抗腫瘤作用的主要方式。

圖2 鐵死亡與索拉非尼耐藥的機(jī)制

4 總結(jié)與展望

HCC在早期即可表現(xiàn)出對(duì)系統(tǒng)性索拉非尼治療的耐藥性。為了增強(qiáng)索拉非尼誘導(dǎo)的抗腫瘤作用，迫切需要了解其潛在機(jī)制并確定治療靶點(diǎn)。本研究全面歸納了可能共同促進(jìn)HCC對(duì)索拉非尼耐藥的分子及細(xì)胞機(jī)制。表觀遺傳學(xué)、細(xì)胞轉(zhuǎn)運(yùn)過程以及調(diào)節(jié)性細(xì)胞死亡均能介導(dǎo)HCC索拉非尼耐藥，并在其中發(fā)揮關(guān)鍵作用。為了保持索拉非尼對(duì)HCC的療效，需要進(jìn)一步研究針對(duì)初始或獲得性耐藥性的治療方法。