劉 堯,靳 晶, 孫雪梅,劉 靜,王肖肖,劉月平*

(1. 河北醫(yī)科大學(xué)第四醫(yī)院病理科，河北 石家莊 050011；2. 河北醫(yī)科大學(xué)第四醫(yī)院腫瘤研究所，河北 石家莊 050011；3. 河北省廊坊市中醫(yī)醫(yī)院體檢中心，河北 廊坊 065000)

食管癌是世界范圍內(nèi)常見(jiàn)的癌癥相關(guān)死亡原因之一，其是東亞和中東地區(qū)的主要組織學(xué)類(lèi)型[1]。對(duì)于食管鱗狀細(xì)胞癌(esophageal squamous cell carcinoma,ESCC)患者的預(yù)后并沒(méi)有明顯改觀。因此，開(kāi)發(fā)新的免疫治療靶點(diǎn)和尋找有效的ESCC分子預(yù)測(cè)因子和替代治療方法迫在眉睫。在腫瘤微環(huán)境中，腫瘤浸潤(rùn)淋巴細(xì)胞(tumor infiltrating lymphocytes,TILs)越來(lái)越受到關(guān)注，有許多證據(jù)表明ESCC中TILs數(shù)量增加[2-3]。有研究表明，TILs表面可見(jiàn)淋巴細(xì)胞活化基因3(lymphocyte activating gene 3,LAG-3)的高表達(dá)[4]。在多種腫瘤中也發(fā)現(xiàn)了LAG-3的免疫調(diào)節(jié)作用，包括肝細(xì)胞癌、腎細(xì)胞癌、膠質(zhì)瘤等[5-7]。LAG-3不僅能調(diào)節(jié)T細(xì)胞的功能，其與預(yù)后也存在關(guān)聯(lián)[8]。本研究中回顧性分析60例ESCC患者，探討LAG-3的表達(dá)、TILs及其相關(guān)性，并評(píng)估LAG-3在ESCC中的預(yù)后價(jià)值。

1 資料與方法

1.1一般資料 篩選2018—2019年河北醫(yī)科大學(xué)第四醫(yī)院經(jīng)手術(shù)切除后病理診斷明確且術(shù)前未進(jìn)行新輔助治療的ESCC手術(shù)患者60例，所有切片均由2位高年資病理醫(yī)師復(fù)閱核實(shí)，根據(jù)WHO第5版消化系統(tǒng)腫瘤病理學(xué)和遺傳學(xué)分類(lèi)標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行，確定診斷無(wú)誤。按照美國(guó)癌癥聯(lián)合委員會(huì)(American Joint Committee on Cancer,AJCC)和國(guó)際抗癌聯(lián)盟(Union International Center of Cancer,UICC)聯(lián)合發(fā)表的第8版臨床分期進(jìn)行分期。60例ESCC患者均經(jīng)隨訪中心電話隨訪或來(lái)院復(fù)查，隨訪截止時(shí)間為2020年12月。

所有入選患者均同意手術(shù)樣本使用且簽訂書(shū)面同意書(shū)，且本研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.2試劑及儀器 ST5020染色機(jī)、脫水機(jī)、包埋機(jī)購(gòu)自徠卡顯微系統(tǒng)(上海)貿(mào)易有限公司；蘇木素、伊紅購(gòu)自武漢博爾夫生物科技有限公司；RM2135石蠟切片機(jī)購(gòu)自徠卡顯微系統(tǒng)(上海)貿(mào)易有限公司；兔抗人LAG-3單克隆抗體購(gòu)自Abcam公司(EPR20261)；全自動(dòng)免疫組織化學(xué)機(jī)購(gòu)自深圳市永年科技有限公司；聚合酶鏈反應(yīng)(polymerase chain reaction,PCR)引物為上海生工生物工程股份有限公司合成。紫外分光光度計(jì)購(gòu)自美國(guó)NanoDrop公司，PCR 儀購(gòu)自日本TAKARA公司。

1.3方法 60例ESCC標(biāo)本均經(jīng)3.7%多聚甲醛固定，常規(guī)脫水、透明及石蠟包埋；將蠟塊固定于RM2135石蠟切片機(jī)上，切成4 μm厚的薄片，45 ℃水中展片和貼片，以及56 ℃恒溫箱中烤片，常規(guī)進(jìn)行蘇木精-伊紅染色(hematoxylin-eosin staining)。免疫組織化學(xué)采用EnVision兩步法進(jìn)行，抗體稀釋濃度為1∶150，DAB顯色，蘇木精復(fù)染。石蠟切片脫蠟、水化及自來(lái)水沖洗，根據(jù)試劑說(shuō)明書(shū)對(duì)組織進(jìn)行抗原修復(fù)，切片陽(yáng)性對(duì)照為人正常扁桃體組織，陽(yáng)性標(biāo)準(zhǔn)為細(xì)胞質(zhì)著色。

1.4染色結(jié)果判定 LAG-3免疫組織化學(xué)染色定位于細(xì)胞質(zhì)，人正常扁桃體組織可見(jiàn)散在LAG-3陽(yáng)性信號(hào)，在ESCC中，LAG-3陽(yáng)性表達(dá)于TILs上，而腫瘤細(xì)胞上為陰性。TILs的評(píng)估根據(jù)浸潤(rùn)程度分為低度浸潤(rùn)(TILs<10%)、中度浸潤(rùn)(10%≤TILs<40%)和高度浸潤(rùn)(TILs ≥40%)[9]。

1.5組織總RNA的提取 將凍存于液氮罐中ESCC組織取出，提取 RNA(操作按試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行)。 用紫外分光光度計(jì)測(cè)定總 RNA純度和含量，在260 nm和280 nm處的紫外吸光度值比值在(2.0±0.1)之間。分別取RNA 5 μg進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄，操作過(guò)程按試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行，以18 s rRNA為內(nèi)參照。LAG-3所使用的引物上游為5′-GGTACCG-CCACCATGTGGGAGGCT-3′，下游為5′-ATGG-TGAGAGCCTCCACCCCCGAGGTGGCCTGCT-3′。

1.6統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用SPSS 27.0統(tǒng)計(jì)軟件分析數(shù)據(jù)。Spearman相關(guān)性分析LAG-3的表達(dá)與臨床病理特征的的關(guān)系，Kaplan-Meier生存分析和多因素COX回歸分析評(píng)估患者無(wú)進(jìn)展生存期(progression-free survival,PFS)和預(yù)后影響因素。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1臨床資料 60例ESCC患者年齡42～77歲，平均(63.4±9.2)歲；腫瘤直徑1.0～5.8 cm，平均(3.34±1.41)cm；腫瘤位于食管上段8例，中段32例，下段20例；腫瘤分化程度為高分化者19例，中分化者27例，低分化者14例；TNM分期Ⅰ～Ⅱ期為24例，Ⅲ～Ⅳ期為36例；淋巴結(jié)陽(yáng)性的患者48例，淋巴結(jié)陰性的患者12例；低度TILs 21例(35.0%)，中度TILs 27例(45.0%)，高度TILs 12例(20.0%)；LAG-3陽(yáng)性23例，陰性37例。

2.2LAG-3在食管鱗狀細(xì)胞癌中的表達(dá)情況 免疫組織化學(xué)染色觀察LAG-3在食管鱗狀細(xì)胞癌中陽(yáng)性表達(dá)位于細(xì)胞質(zhì)，且陽(yáng)性信號(hào)位于腫瘤浸潤(rùn)淋巴細(xì)胞上，其在食管鱗狀細(xì)胞癌中的陽(yáng)性率為38.3%(23/60)，LAG-3陰性率為61.7%(37/60)。Spearman相關(guān)性分析顯示，LAG-3的表達(dá)與TILs呈正相關(guān)，而與腫瘤分化程度和TNM分期呈負(fù)相關(guān)(圖1，表1)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

圖1 食管鱗狀細(xì)胞癌中LAG-3的表達(dá)(SP ×200)

表1 60例食管鱗狀細(xì)胞癌中LAG-3的表達(dá)與臨床病理學(xué)特征的關(guān)系Table 1 Relationship between the expression of LAG-3 and clinicopathological features in 60 cases of esophageal squamous cell carcinoma (例數(shù))

用RNA提取試劑盒對(duì)對(duì)正常食管黏膜組織和ESCC組織抽提細(xì)胞總RNA，并利用 RT-PCR檢測(cè)LAG-3的mRNA相對(duì)表達(dá)量，我們發(fā)現(xiàn)ESCC組織中LAG-3 mRNA表達(dá)明顯高于正常食管黏膜組織(圖2)。

圖2 正常食管黏膜組織和ESCC組織中LAG-3 mRNA的表達(dá)水平

2.3食管鱗狀細(xì)胞癌中TILs狀態(tài) 觀察了全部ESCC的HE切片，并進(jìn)行了TILs的評(píng)估，TILs在食管鱗狀細(xì)胞癌中有不同程度的浸潤(rùn)。在60例ESCC患者中，低度TILs占35.0%(21/60)，中度TILs占45.0%(27/60)，高度TILs占20.0%(12/60)。TILs狀態(tài)與LAG-3呈正相關(guān)，與腫瘤分化程度和TNM分期呈負(fù)相關(guān)(圖3，表2)。

圖3 食管鱗狀細(xì)胞癌中TILs狀態(tài)(HE ×200)

表2 60例食管鱗狀細(xì)胞癌中TILs狀態(tài)與臨床病理學(xué)特征的關(guān)系Table 2 Relationship between TILs and clinicopathological features in 60 cases of esophageal squamous cell carcinoma (例數(shù))

2.4預(yù)后分析 60例ESCC患者從確診時(shí)開(kāi)始計(jì)算生存時(shí)間，截止時(shí)間為2020年12月，隨訪時(shí)間12～36個(gè)月，平均24個(gè)月。隨訪期內(nèi)死亡5例，病死率為8.3%。Kaplan-Meier生存分析結(jié)果顯示：患者無(wú)進(jìn)展生存期與TNM分期(HR=3.887,95%CI:2.106～6.387,P<0.001)、淋巴結(jié)狀況(HR=3.132,95%CI:1.875～5.109,P=0.031)、LAG-3(HR=3.477,95%CI:2.125～5.386,P=0.035)及TILs(HR=3.512,95%CI:2.322～5.271,P=0.041)有關(guān)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(圖4)。多因素COX回歸分析結(jié)果顯示：患者無(wú)進(jìn)展生存期與TNM分期(HR=4.105,95%CI:2.217～6.489,P<0.001)、LAG-3(HR=3.789,95%CI:2.176～6.103,P<0.001)有關(guān)。

圖4 患者無(wú)進(jìn)展生存率與臨床病理特征的關(guān)系

3 討 論

免疫治療是當(dāng)今腫瘤治療領(lǐng)域最具前景的發(fā)展方向之一，癌癥免疫療法自2013年被科學(xué)雜志評(píng)為“年度突破”以來(lái)，癌癥免疫學(xué)提出了一種完全不同的治療癌癥的方法，它針對(duì)的是宿主免疫系統(tǒng)，而不是腫瘤細(xì)胞[10]。免疫檢查點(diǎn)是調(diào)節(jié)自我耐受和逃離免疫系統(tǒng)的最重要的免疫球蛋白。目前開(kāi)發(fā)較為成熟的受體靶點(diǎn)包括程序性死亡受體1(programmed death receptor 1,PD-1)及其配體程序性死亡配體1(programmed death ligand 1,PD-L1)和TILs上的細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞相關(guān)蛋白4(cytotoxic T lymphocyte-associated molecule-4,CTLA-4)[11-14],但由于在其相關(guān)的抗體治療過(guò)程中患者出現(xiàn)了原發(fā)性耐藥,新的抗腫瘤靶點(diǎn)的開(kāi)發(fā)與探尋成為新的探究熱點(diǎn)。由于腫瘤細(xì)胞可通過(guò)免疫檢查點(diǎn)受體來(lái)躲避免疫系統(tǒng)的殺傷和識(shí)別,這就促使阻斷免疫檢查點(diǎn)受體成為近年來(lái)腫瘤免疫治療的新方法和新思路。

淋巴細(xì)胞活化基因3(lymphocyte activation gene 3,LAG-3)是一種免疫球蛋白超家族的成員，其全稱(chēng)為淋巴細(xì)胞活化基因3(lymphocyte activation gene-3)，它能負(fù)向調(diào)控T細(xì)胞[15]。Triebel等[16]于1990年發(fā)現(xiàn)了LAG-3這一免疫球蛋白，LAG-3分子的cDNA克隆首次被分離出并發(fā)現(xiàn)了LAG-3的免疫調(diào)控機(jī)制。Baixeras等[17]于1992年通過(guò)試驗(yàn)驗(yàn)證了LAG-3的主要配體是主要組織相容性復(fù)合體Ⅱ類(lèi)分子 。新近的研究表明， LAG-3的一個(gè)重要的功能性配體被發(fā)現(xiàn)，即為纖維蛋白原樣蛋白1(fibrinogen-like protein 1，F(xiàn)GL1)，并揭示了腫瘤免疫中FGL1-LAG-3通路的功能[18]。Shan等[19]綜述了LAG-3的結(jié)構(gòu)及功能，提出它是一種由498個(gè)氨基酸構(gòu)成的Ⅰ型跨膜蛋白樣的免疫抑制性受體，它可以選擇性表達(dá)在活化的T細(xì)胞、樹(shù)突細(xì)胞和NK細(xì)胞上。LAG-3免疫球蛋白由4種具有高度同源性的胞外免疫球蛋白超家族類(lèi)似(IgSF-like)結(jié)構(gòu)域(D1～D4)構(gòu)成，其對(duì)T細(xì)胞的調(diào)節(jié)功能與PD-1類(lèi)似，主要作為遞送抑制信號(hào)的受體起作用[20]。LAG-3蛋白具有負(fù)向調(diào)節(jié)T細(xì)胞的功能,在維持機(jī)體免疫系統(tǒng)穩(wěn)態(tài)和促進(jìn)腫瘤免疫逃逸和發(fā)揮免疫功能方面發(fā)揮了重要角色[21]。作為一種很有潛力的免疫檢查點(diǎn)之一，在腫瘤免疫治療方面LAG-3表現(xiàn)出了很好的效果，治療上發(fā)揮了重要的作用[22]。在本研究的食管鱗狀細(xì)胞癌隊(duì)列中，納入了60例術(shù)前未經(jīng)新輔助治療的ESCC患者，分析并探究了LAG-3在食管鱗狀細(xì)胞癌中的表達(dá)情況，評(píng)估其預(yù)后價(jià)值并分析其與TILs的相關(guān)性，為將來(lái)進(jìn)一步的研究打下堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)，為將來(lái)的臨床干預(yù)和研究提供一定的參考價(jià)值。近年來(lái)許多研究都證明了LAG-3作為一種免疫抑制性受體在腫瘤中具有較好的預(yù)后預(yù)測(cè)價(jià)值。一項(xiàng)Ⅱ期結(jié)腸癌的臨床研究表明，LAG-3的評(píng)估有助于預(yù)測(cè)結(jié)腸癌患者的預(yù)后，并能篩選出可能從輔助化療中受益的患者，因此，LAG-3可作為Ⅱ期結(jié)腸癌患者的預(yù)后生物標(biāo)志物[23]；Asano等[24]的研究表明，LAG-3可能成為三陰性乳腺癌和人表皮生長(zhǎng)因子受體2(human epidermal growth factor receptor 2,HER2)陽(yáng)性乳腺癌等高度惡性乳腺癌的生物標(biāo)志物，可以預(yù)測(cè)新輔助治療的效果；Wang等[25]的研究表明， LAG-3的表達(dá)與CTLA-4表達(dá)相關(guān)，LAG-3陽(yáng)性表達(dá)與ESCC預(yù)后不良有關(guān)；而一項(xiàng)關(guān)于軟組織肉瘤的研究，LAG-3在腫瘤浸潤(rùn)淋巴細(xì)胞上的表達(dá)與較差的存活率相關(guān)[26]。在納入的60例ESCC患者中，LAG-3的陽(yáng)性率為38.3%，LAG-3的表達(dá)與腫瘤分化程度、TNM分期和TILs有關(guān)，即LAG-3陽(yáng)性信號(hào)更多見(jiàn)于腫瘤高、中分化的患者，且只表達(dá)于TILs上，而在腫瘤細(xì)胞上不表達(dá)，且LAG-3在TILs上的表達(dá)在TNM分期Ⅲ～Ⅳ期的患者低于Ⅰ～Ⅱ期的患者。RT-PCR檢測(cè)也證實(shí)了LAG-3在ESCC中的相對(duì)表達(dá)量高于正常食管黏膜組織。LAG-3的表達(dá)更趨向于腫瘤高、中分化、TNM分期較早、TILs越高的患者中，提示這些患者將來(lái)的預(yù)后可能是較好的。在腫瘤微環(huán)境中，TILs的存在也是決定免疫檢查點(diǎn)抑制劑抗腫瘤效果的重要因素。腫瘤中高度淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)與良好的預(yù)后相關(guān)，TILs狀態(tài)也成為了一個(gè)預(yù)后有用的指標(biāo)。在LAG-3高表達(dá)的患者中，TILs存在相對(duì)較高。TILs狀態(tài)與LAG-3呈正相關(guān)，與腫瘤分化程度和TNM分期呈負(fù)相關(guān)?；颊叩纳娣治鲆沧C明了LAG-3是與預(yù)后高度相關(guān)的，提示LAG-3是生存率的獨(dú)立預(yù)測(cè)因子。

總之，LAG-3表達(dá)的降低與TNM晚期顯著相關(guān)。此外，TILs越多，LAG-3表達(dá)水平越高，生存率也越高，提示LAG-3和TILs聯(lián)合可作為ESCC預(yù)后有價(jià)值的生物標(biāo)志物。后續(xù)將進(jìn)一步擴(kuò)充數(shù)據(jù)量，以提高數(shù)據(jù)支持和ESCC患者免疫檢查點(diǎn)抑制劑治療的可能性。